碱基特异性引物结合探针熔解曲线技术检测EGFR基因29种突变

摘要

肺癌的发病率和死亡率一直位居各类肿瘤之首，而非小细胞肺癌约占肺癌总数的85％。吉非替尼和埃罗替尼是近年来开发的两种特异性较高的治疗非小细胞肺癌的靶向治疗药物，它们都属于表面生长因子受体(EGFR)——酪氨酸激酶抑制剂(TKI)类药物。然而，临床实践显示这两种药物的疗效存在很大的个体差异，仅对10％～30％的非小细胞肺癌患者有较好的疗效。研究发现，EGFR基因酪氨酸激酶区域存在着多种突变，这些突变会对EGFR-TKI类药物的疗效有显著影响。
　　 肿瘤体细胞突变存在于大量的野生型背景之中，对检测技术的要求较高。本论文以实时荧光PCR为平台，使用碱基特异性引物结合探针熔解曲线分析的方法建立了检测29种EGFR突变的五管双色体系。该体系通过碱基特异性引物选择性地扩增突变模板，使用特异荧光探针抑制野生型的扩增，并利用熔解曲线熔解峰的Tm值对突变进行区分。
　　 为防止扩增产物污染，我们在体系中加入了dUTP和UNG酶。建立好的UNG/dUTP防污染体系可将含有dUTP模板的浓度降低10～100倍。检测体系可耐受200ng的野生型细胞系基因组，可检出低至30拷贝(0.1ng)的突变模板，且可检出100ngDNA样品中含量低至0.5％的突变。
　　 我们利用建立的体系对临床标本进行了检测:其中正常人血液和绒毛膜标本40份，结果全部为阴性，无非特异出现;2011～2012年FFPE肺癌标本100份，检出阳性标本27份，与测序结果对比一致性较好，Kappa值为0.974，p＜0.05;中山医院检测2012年FFPE肺癌标本10份，与罗氏公司的cobas(@)EGFR突变检测试剂盒对比，结果完全一致。
　　 本文所建立的EGFR检测体系具有高特异性、灵敏度和选择性，有望成为非小细胞肺癌个体化治疗中的患者筛查工具。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第一节 EGFR突变与非小细胞肺癌靶向治疗

1．1 非小细胞肺癌及其治疗

1．2 EGFR突变与非小细胞肺癌靶向治疗

第二节 EGFR突变检测方法

2．1 非实时PCR方法

2．2 实时PCR检测方法

第三节 论文的研究内容

第二章 材料与方法

第一节 模板DNA以及临床标本的来源

1．1 细胞系

1．2 阳性质粒

1．3 临床标本

第二节 引物探针设计

2．1 外显子18引物探针设计

2．2 外显子19引物探针设计

2．3 外显子20引物探针设计

2．4 外显子21引物探针设计

第三节 实验设计

3．1 检测体系的原理

3．2 内参基因的加入

3．3 检测体系的建立

3．4 UNG／duTP防污染体系的建立

3．5 反应体系野生型耐受性考察

3．6 反应体系灵敏度考察

3．7 反应体系选择性考察

3．8 部分管内突变的区分

3．9 标本考察

第三章 结果

第一节 体系的建立

1．1 体系的优化

1．2 UNG／dUTP防污染体系

1．3 反应体系野生型耐受性考察结果

1．4 反应体系灵敏度考察结果

1．5 反应体系选择性考察结果

1．6 部分突变类型的区分

第二节 标本考察

2．1 健康人血液标本及绒毛膜标本检测结果

2．2 FFPE肺癌标本检测结果

2．3 中山医院合作检测EGFR突变

第四章 讨论

第一节 生物标记物的检测

第二节 EGFR检测体系的评估

2．1 EGFR五管检测体系的结果评估

2．2 EGFR五管检测体系与商品化EGFR突变检测试剂盒的比较

第三节 检测对标本的要求

3．1 检测对标本取材的要求

3．2 检测对标本DNA质量的要求

第四节 体系的完善

参考文献

附录

附录一：EGFR检测体系灵敏度考察结果

附录二：EGFR检测体系选择性考察结果

致谢