一种特异识别单核细胞增生李斯特菌的核酸适配子及其筛选方法与应用

摘要

本发明公开了一种单核细胞增生李斯特菌的核酸适配子及其筛选方法与应用。通过SELEX技术获得了能够特异识别单核细胞增生李斯特菌的单链DNA寡核苷酸适配子，该适配子可以通过荧光素标记等转为报告适配子用于检测单核细胞增生李斯特菌，该适配子序列在准确、快速检出食品中的单核细胞增生李斯特菌方面具有广泛应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一种与单核细胞增生李斯特菌高特异性和高亲和力的核酸适配子，为该核酸适配子在检测单增李斯特菌中的应用提供科学依据和理论基础。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种常见、重要的人畜共患病原菌。它能引起人、畜的李斯特菌病，严重感染后主要表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。因此，如何快速、准确检测单增李斯特菌具有重要研究意义。

传统检测病原菌的方法往往是需要先分离病原微生物，然后通过微生物培养，再用经典的方法鉴定。耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。因此发展快速、灵敏检测病原微生物的技术十分必要。利用抗体虽然能够特异识别病原细菌，能够迅速、准确的对待检标本作出鉴定，但该技术受特异性抗体制备难度的制约。因为按照伯杰分类标准，生物学形状基本相同的细菌群体构成一个菌种，性状相近关系密切的若干菌种组成一个菌属。从本质上讲，同一菌属所含的表面抗原绝大多数是相同的，只有细微的差别，找到这些差别并制备相应特异性抗体显然是一项耗时而艰巨的任务。

近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，是一种研究核酸结构和功能的有效方法。其基本原理是体外化学合成一个随机单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗去未与靶物质结合的核酸分子，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的筛选过程。通过数轮重复筛选与扩增，最后得到高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子，即aptamer。利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，适配子具有更明显的优越性，如不依赖动物细胞，不受免疫条件和免疫原性限制，适配子的筛选完全在体外进行，具有时间、质量和数量上的选择弹性，可以在合成时粘确、定点、随意连接其他功能基团和分子；适配子变性与复性可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输；靶分子范围更广，除蛋白质、核苷酸大分子外，还有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶碱等)、生长因子、肽链、类固醇、糖类、辅因子(如FMN等)，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子等；与靶分子结合具有更强的特异性和亲和力，不受组织或样品中非靶蛋白的干扰，可以在靶目标性质未知的情况下筛选出其相应的适配子；适配子通过占据靶物质表位，使疾病得到控制，作为临床药物的治疗，已显现了潜在的时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白等的作用，以达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对一些致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。

本发明以食品中和临床上常见的单核细胞增生李斯特菌为靶标，利用SELEX技术获得了与单核细胞增生李斯特菌特异性结合的核酸适配子序列，该序列可以快速、准确检测单增李斯特菌，由于单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测靶细菌，因此操作简单、直接。该发明可以在食品安全检测、临床医学等领域得到广泛应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种微生物分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配子技术快速、准确检测单核细胞增生李斯特菌的方法。

本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以单核细胞增生李斯特菌完整的菌细胞为靶标，筛选获得与靶细胞高亲和性特异结合的适配子，通过羧基荧光素(FAM)标记方法将获得的适配子转为报告适配子，用于从临床血、食品培养上清中检测到相应的靶细菌，达到快速、准确诊断的目的。

本发明的优点：

(1)与蛋白类的抗体相比，单链寡核苷酸更为稳定；aptamer可直接体外合成、标记，不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制备成本低，周期短。

(2)该序列是从结构显著、与靶细菌具有不同亲和力的8条适配子序列中选取出的亲和力和特异性均最强的适配子序列，能够特异识别单核细胞增生李斯特菌。

附图说明

图1是合成的ssDNA文库2％琼脂糖凝胶电泳图谱

图2是部分SELEX筛选的PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳图谱

图3是单增李斯特菌适配子F1-F8二级结构图谱

图4是单增李斯特菌适配子F1-F8亲和力饱和结合曲线

表1是F2适配子与九种对照细菌的结合率

具体实施方式：

下面是通过SELEX技术筛选特异结合单核细胞增生李斯特菌的核酸适配子制备方法及其快速检出单核细胞增生李斯特菌方面的应用。

1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)

随机单链DNA(ssDNA)文库：5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA(N35)TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′，构建了长度为78nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为35个碱基的随机序列，库容量为10¹⁴以上；引物I：5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3′；引物II：5′-GATCCGGGCCTCATGTCG AA-3′，将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液-20℃贮存备用。

2、双链DNA(dsDNA)及单链DNA(ssDNA)文库的PCR扩增

每轮筛选前先将ssDNA文库扩增为dsDNA文库，并以dsDNA文库为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库，为了稳定条件，不改变反应体系和反应程序。PCR反应体系为：随机ssDNA模板2μL，引物I和引物II各2μL(20μmol/L)，含Mg²⁺dNTP混合物2μL(25mmol/L)，10×PCR缓冲液5μL，Taq聚合酶0.5μL，加超纯水至50μL；PCR反应程序为：97℃预变性5min，然后进行循环，96℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸40s，循环30次，最后72℃延伸9min，12℃冷却5min，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，置4℃环境储存备用。

3、筛选所用靶标细菌的获取与处理

LB液体培养基培养单核细胞增生李斯特菌，37℃摇床培养至对数生长期(OD₆₀₀约为0.3)，停止培养，收集OD₆₀₀为0.3左右的菌液1mL，4℃，8000rpm离心10min，弃上清，用结合缓冲液(1×BB)冲洗两次，洗去多余的培养基成分，置4℃环境储存备用。

4、SELEX技术筛选获得特异识别单增李斯特菌的核酸适配子

第一轮筛选时，反应体系为600μL，取2nmol扩增后的随机dsDNA文库加入适量的1×BB于95℃变性5min，立即冰浴10min。将其加入处理好的菌细胞(1×10⁸个)离心管中，再加入5倍于随机ssDNA文库摩尔数的5％BSA溶液和酵母tRNA，以降低结合背景，于37℃振荡孵化1h。孵化后需更换离心管，以去除与离心管壁结合的ssDNA，将新离心管于4℃，6000rpm离心10min，弃上清，去除未结合或结合不紧密的随机ssDNA文库，随后用含0.05％BSA的1×BB通过重悬浮和离心冲洗2次，最后加入100μL 1×PCR缓冲液，于95℃变性5min，0℃立即冷却10min，经4℃，8000rpm离心10min，吸取上清至另一洁净的离心管中，即为第一轮筛选所得的适配子。以此为模板PCR扩增为dsDNA文库，用于第二轮筛选。第二轮至第八轮反应体系为350μL，其中随机ssDNA文库为100pmol，每轮筛选需用新鲜菌液，重复筛选8次获得单核细胞增生李斯特菌的适配体库。将每轮筛选PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

上述筛选结合缓冲液(1×BB)为50mMTris-HCl(pH 7.4)，5mM KCl，100mM NaCl，1mMMgCl₂；冲洗缓冲液为含0.05％的1×BB；洗脱缓冲液为1×PCR缓冲液。

5、克隆和测序

将第八轮富集的ssDNA文库，PCR扩增为双链，送上海博尚生物技术有限公司进行DNA序列测定，获得20条适配子序列。

6、适配子序列结构分析

采用DNAMAN软件和RNA Structure 4.2软件分别对适配子序列进行一级结构和二级结构分析，获得20条序列的同源性信息和二级结构图谱。结合一级结构同源性和二级结构将序列分为8个家族，从每个家族中选出1条结构稳定，能级较低的序列为代表进行下一步鉴定，共8条，如图3所示，每条适配子中的茎环结构和发卡结构可能是适配子与靶细菌结合的基础

7、适配子与单核细胞增生李斯特菌亲和力和特异性测定

7.1适配子亲和力分析

将上述8条适配子序列5′端标记FAM，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用于亲和力测定。

FAM-F1

5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGGGGCCTAGACTAGGGGGAGAGGGTGGGACGGTTTCGACATGAGGCCCGGATC-3′

FAM-F2

5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATACTATCGCGGAGACAGCGCGGGAGGCACCGGGGATTCGACATGAGGCCCGGATC-3′

FAM-F3

5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGGCGGCGGCGGTGGTACGGGGTTGGGAGCGGGCT TCGACATGAGGCCCGGATC-3′

FAM-F4

5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGCGTATGCGCAGCGAGGGCGGCCGGGCGACGTCGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3′

FAM-F5

5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACCACGGGAACAACATCGTGGCAGGGACGAGCGTCCTTTCGACATGAGGCCCGGATC-3′

FAM-F6

5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGCGCGCTGCCGACGCGGGGGGGCTGATTAGCGTGGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3′

FAM-F7

5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAACTGAGGGGCGGCGGACGGGATGGGAAATGTAGGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3′

FAM-F8

5′-GGGAGCTCAGAAFAAACGCTCAATAGCGTGGGTAACCGTGTTGGGGGGTGCCACGGTCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3′

将八条适配子分别用1×BB稀释为不同的浓度梯度(10，20，50，100，150，200，250，300nmol/L)，与1×10⁸个单核细胞增生李斯特菌在37℃温育结合1h，4℃，6000rpm，离心10min，弃上清，用1×BB冲洗两次，加入100μL 1×BB，避光混匀，用FL-7000荧光分光光度计测定荧光值(测三次取平均值)，利用Sigma Plot11.0软件计算各适配子的解离常数Kd值，并绘制其饱和结合曲线，如图4所示。

7.2特异性分析

与单核细胞增生李斯特菌细胞亲和力最强即Kd值最小的适配子序列为F2序列，Kd值为58.85nmol/L，将10pmol F2适配子(100nmol/L，1×BB)分别与金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、绿脓杆菌、嗜酸乳杆菌于37℃温肓结合1h，4℃，6000rpm，离心10min，弃上清，用1×BB冲洗两次，将菌细胞重溶于100μL 1×BB，用FL-7000荧光分光光度计测定荧光值(测三次取平均值)。结果显示F2适配子与九种对照菌的结合率不超过5％，如表1所示，表明F2适配子与单核细胞增生李斯特菌的特异性良好，因此，利用SELEX技术筛选的单核细胞增生李斯特菌高亲和性特异核酸适配子检测单核细胞增生李斯特菌，具有广泛的应用前景。

表1F2适配子与九种对照细菌的结合率(％)