一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培养方法

摘要

本发明提供了一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006及利用该诱变菌株发酵生产聚苹果酸的方法，该菌株是以从我国宁夏回族自治区银川市王太堡果园土壤中筛选出的β-聚苹果酸生产菌TKPM10017的基础上采用多组复合诱变技术选育出的高产β-聚苹果酸的诱变菌株。在优化条件下β-聚苹果酸产量达到18.4±1.3g/L。

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培养方法。 

背景技术

聚苹果酸[Poly(malic-acid)或Poly malate，简称为PMLA]是以苹果酸为唯一单体的均聚高分子聚合物，是一种新型的完全生物降解性高分子材料。该种材料降解的产物无毒无害，不会对环境产生二次污染，近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。PMLA主要有三种结构：即α型、β型、γ型PMLA，唯一存在于人体内的只有β型PMLA。作为一种脂肪族聚酯，PMLA具有高度的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、无免疫原性和可化学衍生性，在药物方面具有很强的用途，可以作为药物载体用于心血管及脑肿瘤方面的研究，还可作为微胶囊材料、生物医学材料如手术缝合线及伤口、烧伤治疗的绷带等生物医学材料，直接用于人体，还可用于化妆产品及食品包装等材料。 

尽管早在20世纪60年代晚期就已发现聚苹果酸，但一直到20年后当它从几种生物中分离出来时才受到了重视。1969年Shimada等发现一种由苹果酸组成的高分子化合物能抑制圆弧青霉(Penicillium cyclopium)的酸性蛋白酶，当时酯键中的羧基位置还没有确定，沉寂几年后，聚苹果酸在黏菌(physarumpolycephalum)中被重新发现。而后几年聚苹果酸的发展几乎处于停滞期，1989年Fischer等在黏菌(physarum polycephalum)中再次发现聚苹果酸它是DNA聚合酶α的抑制剂。迄今为止，以Shimada，Fischer，Holler et al，Lee等为代 表的国外学者对PMLA的性能，合成和应用做了较深入地研究，而我国在这方面的研究相对较少，直到近几年才有学者对聚苹果酸的合成与性能做了基础性的研究。因此加强聚苹果酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究平台，具有重要的理论价值和应用价值。 

聚苹果酸的合成方法主要有化学法和微生物发酵法两种。化学合成法又分为直接聚合和开环聚合两种。直接聚合法虽然步骤简单，产物分离提纯容易，产率较高，只是聚苹果酸分子量低，反应温度较高，多为γ-PMLA，实际应用价值较低，而且催化剂有毒；开环聚合法合成产物虽以β-聚苹果酸为主，但合成过程步骤较多产率低，中间产物分离提纯繁琐；生物途径制备的聚苹果酸主要是通过微生物发酵合成，生物合成PMLA具有突出的优点，产物均为β型、分子量高、生产条件温和、产物纯度较高，微生物发酵得到的PMLA分子量可达200～760kDa，而化学法合成的分子量最多为174kDa，但微生物发酵生产PMLA产量不高，而且极高的生产成本未能实现大规模的工业生产，以致影响了该物质的应用。 

本发明利用复合诱变技术筛选获得一株β-聚苹果酸高产菌株，并对培养基进行优化，提高β-聚苹果酸的产量，有效降低了生产成本，实现了β-聚苹果酸的工业化生产。 

发明内容

本发明提供的方法与常规诱变方法相比筛选过程大为简化，工作效率更高的β-聚苹果酸高产菌株的诱变方法，有效提高β-聚苹果酸产率。 

本发明解决该技术问题所采用的技术方案为： 

1.采用多组复合诱变技术选育β-聚苹果酸高产菌株 

(1)选择生长良好的β-聚苹果酸生产菌株TKPM10017斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，制做10⁶个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下，30cm处，分别照射1、2、3、4、5、6、7、8min，将菌悬液梯度稀释涂平板，避光培养，计算致死率； 

(2)根据(1)致死率选择高、中、低三个不同剂量的照射时间分别对菌株TKBO16的孢子悬浮液进行紫外照射处理； 

(3)然后把(2)三个不同照射时间的菌悬液混合均匀，梯度稀释涂平板，避光培养； 

(4)将(3)中的诱变菌株接种到以琥珀酸为唯一碳源的发酵培养基中培养； 

(5)将(4)中的种子液以10％接种量接种到以柠檬酸为唯一碳源的发酵培养基中培养； 

(6)将(5)中的种子液以10％接种量接种到以醋酸为唯一碳源的发酵培养基中培养； 

(7)取(6)中的种子液接种到含CaCO₃的固体培养基平板上培养，筛选培养基中菌落大湿润、色泽黑亮、透明圈明显的菌株，即得高产聚苹果酸诱变菌株TKPM00006(该菌株于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337；分类命名：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)。 

2.出芽短梗霉TKPM00006的培养方法为： 

(1)菌种活化：将出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)TKPM00006转接至PDA斜面培养基，25℃培养3～5d； 

(2)种子培养：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓度约10⁶个/mL的孢子悬浮液，按10％(v/v)接种量接种装有100mL液体 种子培养基的500mL三角瓶中，25℃，200r/m条件下培养2～3d，制得种子液； 

(3)发酵培养：将(2)中的种子培养液以8～10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，在24～30℃下，200r/m振荡培养7～12d； 

3.出芽短梗霉TKPM00006所用到的培养基为： 

(1)菌种活化培养基：土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 4.0～4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min； 

(2)种子培养基：葡萄糖8％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K₂CO₃ 0.04％，KH₂PO₄ 0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，ZnSO₄·7H₂O 5×10^-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO₃ 2％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min； 

(3)发酵培养基：葡萄糖12％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K₂CO₃ 0.04％，KH₂PO₄ 0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，ZnSO₄·7H₂O 5×10^-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO₃ 3％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min； 

(4)选择培养基： 

①3％琥珀酸，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K₂CO₃ 0.04％，KH₂PO₄ 0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，ZnSO₄·7H₂O 5×10^-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO₃3％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min； 

②3％柠檬酸，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K₂CO₃ 0.04％，KH₂PO₄ 0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，ZnSO₄·7H₂O 5×10^-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO₃3％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min； 

③3％醋酸，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K₂CO₃ 0.04％，KH₂PO₄ 0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，ZnSO₄·7H₂O 5×10^-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO₃ 3％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min； 

(5)初筛培养基：PDA+0.5％CaCO3(分开灭菌)。 

本发明与现有技术相比，有益效果是：采用该诱变方法降低了筛选的盲目性，有效简化了筛选过程，同时优化了高产菌株的发酵培养条件，大大提高了诱变育种的工作效率。并且筛选出的高产菌发酵液为乳黄色，省却了活性炭除黑色素步骤，有利于后续提取工作，降低了生产成本。 

本发明的诱变菌株TKPM00006与常规β-聚苹果酸生产菌相比，其β-聚苹果酸生产能力更为高，并由此能够有效提高β-聚苹果酸的产率，降低生产成本。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能以此限定本发明的保护范围。 

实施例1从土壤中筛选出的生产β-聚苹果酸的菌株出芽短梗霉TKPM10017 

1.菌体形态：该菌株有酵母样和真菌菌丝体两种形态，分泌聚苹果酸的为酵母状细胞，菌丝体状细胞缺少高分子，幼龄营养细胞椭圆形至柠檬形，数个菌体可连成杆状，常具有节孢子、厚垣孢子、芽分生孢子。无性繁殖方式多样，主要类似于酵母菌的多边芽殖形式到形成明显的真菌丝。 

2.菌落形态：最初粘稠，脏白色，很快转变为淡绿色，最终为黑色。菌落质地由粘稠状到坚硬和革状，菌落边缘呈明显的根状，菌落中心凹陷较为湿润，若长期培养周边由乳白色转为黄褐色。 

3.培养特征：此菌为高耗氧菌，最适温度为24～30℃，微酸环境利于生长，pH4.5～5.0，180～200r/m下振荡培养7～12d。发酵过程中pH呈现先升高后下降的趋势，发酵结束时pH降至最低。发酵液颜色有橙黄色、黄褐色、乌青色和黑色，颜色不稳定。 

4.可以利用的碳源：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、琥珀酸、柠檬酸、醋酸，柠 檬酸钠、醋酸钠和油酸等其中之一。 

5.可以利用的氮源：有机氮蛋白胨、牛肉膏、玉米浸提液等，无机氮丁二酸铵、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。 

上述氮源可单独使用也可复合使用。 

实施例2以高产菌株TKPM10017为出发菌株采用多组复合诱变技术筛选菌株TKPM00006 

1.诱变菌株的获得 

(1)选择生长良好的β-聚苹果酸生产菌株TKPM10017斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，制做10⁶个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下，30cm处，分别照射1、2、3、4、5、6、7、8min，菌悬液梯度稀释涂平板，于25℃避光培养，计算致死率； 

(2)选择1min、3min、5min三个不同剂量的照射时间分别对菌株TKBO16的孢子悬浮液进行紫外照射处理； 

(3)然后把三个不同照射时间的菌悬液混合均匀，进行10倍系列稀释10^-1～10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的孢子悬浮液涂布平板，25℃避光培养4～5d； 

(4)将上述(3)中混合均匀的诱变菌株混合液接种到以琥珀酸为惟一碳源的发酵培养基中，发酵培养基成分为：3％琥珀酸，0.3％丁二酸铵，0.04％K₂CO₃，0.01％KH₂PO₄，0.01％MgSO₄.7H₂O，5ppm ZnSO₄.7H₂O，0.05％玉米浸出液，2％CaCO₃(单独灭菌)。将种子液置于25℃恒温摇床，200r/m，振荡培养7d； 

(5)将上述(4)中的培养液以10％接种量(v/v)接种到以3％柠檬酸为唯 一碳源的发酵培养基中培养，培养基其余成分同(3)； 

(6)将上述(5)中的培养液以10％(v/v)接种量接种到以3％醋酸为唯一碳源的发酵培养基中，培养基其余成分同(3)； 

(7)取上述(6)中的种子液进行10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬浮液涂布固体平板，固体培养基成分为：PDA+0.5％CaCO₃(分开灭菌)；25℃倒置培养4～5d； 

(8)从上述平板中挑选菌落大、黑亮湿润、透明圈明显的菌落，转接发酵培养基培养，检测聚苹果酸产量，结果筛选出高产菌株TKPM00006。发酵培养基成分为：12％葡萄糖，0.3％丁二酸铵，0.2％丁二酸，0.04％K₂C_O3，0.01％KH₂PO₄，0.01％MgSO₄.7H₂O，5ppm ZnSO₄.7H₂O，0.05％玉米浸出液，3％CaCO₃(分开灭菌)，500mL摇瓶装液量150mL，25℃，200r/m，振荡培养8d。 

2.诱变菌株TKPM 00006的特性 

(1)菌体形态：主要为酵母样形态，细胞椭圆形，大小均匀，数个菌体可连成杆状，芽分生孢子。 

(2)菌落形态：最初粘稠，乳白色，很快转变为淡绿色，最终为黑色。菌落质地粘稠湿润，圆滑，色泽黑亮，菌落边缘呈些微的根状。 

(3)培养特征：25℃，180～200r/m下振荡培养7～12d，发酵液颜色稳定为乳黄色，不产黑色素。 

(4)可以利用的碳源：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、琥珀酸、柠檬酸其中之一。 

(5)可以利用的氮源：丁二酸铵、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵及玉米浸提液。 

上述氮源可单独使用也可复合使用。 

(6)可以分别以琥珀酸、柠檬酸、醋酸为唯一碳源进行生长，并生长良好； 

实施例3出芽短梗霉TKPM00006的培养 

1.培养基的配制 

(1)菌种活化培养基：土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH4.0～4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min； 

(2)种子培养基：葡萄糖8％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K₂CO₃ 0.04％，KH₂PO₄ 0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，ZnSO₄·7H₂O 5×10^-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO₃ 2％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min； 

(3)发酵培养基：葡萄糖12％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K₂CO₃ 0.04％，KH₂PO₄ 0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，ZnSO₄·7H₂O 5×10^-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO₃3％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min； 

2.菌种活化 

将出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)TKPM00006转接PDA斜面培养基，于恒温培养箱中，25℃培养3～5d； 

3.种子培养 

选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶中，于25℃，200r/m下培养2～3d； 

4.发酵培养 

将3中制得的种子培养液以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，于25℃，200r/m下培养7～12d； 

检测结果：出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)TKPM00006在发酵培养基发酵生产β-聚苹果酸产量为18.4±1.3g/L.