细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒的构建及应用

摘要

本发明涉及一种细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒的构建及应用，是将PCR扩增获得的ALV-env基因与慢病毒表达载体重组构建的一种可在细胞膜上表达ALV-env蛋白的荧光真核转基因表达质粒，该质粒含有ALV-env基因。该质粒被转染到宿主细胞后，可将ALV-env基因和绿色荧光蛋白基因(EmGFP)基因整合到宿主细胞染色体中，并在宿主细胞膜表面表达出禽白血病的囊膜蛋白，同时在宿主细胞浆中表达报告基因-绿色荧光蛋白。该膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒可用于制备禽白血病假病毒，制备的禽白血病假病毒可用于检测J-亚型禽白血病中和抗体。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒的构建与应用，属于生物技术领域。 

(二)背景技术

禽白血病病毒囊膜糖蛋白基因(ALV-env)编码的囊膜糖蛋白(env)包括囊膜表面蛋白gp85和穿膜蛋白gp37，两者在宿主细胞内先是形成gp85-gp37聚合前体蛋白，再经加工剪切形成成熟的囊膜糖蛋白gp85和gp37。ALV-env基因编码的囊膜蛋白是该类病毒的主要表面蛋白。该囊膜蛋白与靶细胞表面特异性受体相互识别、结合，是病毒进入靶细胞进行复制、增殖所必需的。 

pLenti7.3质粒是Invitrogen公司利用HIV基因片段等构成的慢病毒病毒真核表达质粒载体(Lentiviral vector)。pLenti7.3质粒可将重组到其多克隆位点的目的基因导入到被转染的宿主细胞核并整合到宿主细胞染色体中。pLenti7.3质粒可将其HIV长末端杂交启动子(RSV/5’LTR)到SV40pA之间的DNA序列转录成一条长的mRNA，然后反转录成cDNA。此部分DNA序列在整合到宿主细胞染色体中后，在CMV启动子的作用下可在宿主细胞核中转录插入的目的基因，在细胞浆中表达目的基因；同时表达pLenti7.3携带的绿色荧光蛋白(EmGFP)。 

(三)发明内容：

本发明的第一个目的是将PCR扩增获得的ALV-env基因与慢病毒表达载体重组构建一种可在细胞膜上表达ALV-env蛋白的荧光真核转基因表达质粒(pLenti7.3/ALV-env)，该质粒含有ALV-env基因。 

本发明的另一个目的是细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒在制备禽白血病假病毒中的应用。 

本发明通过以下技术方案实现： 

一种细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其ALV-env蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

一种细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒是利用含启动序列的特异性引物：上游引物：5’ATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCAC 3’；下游引物：5’GACAGCTGCTCCCTAATTCTATG 3’，通过PCR方法从禽白血病病毒基因组(从鸡胚成纤维细胞培养物中提取)扩增env基因。禽白血病env基因与商品化pLenti7.3表达质粒重组，构成细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒(pLenti7.3/ALV-env)。含有pLenti7.3/ALV-env质粒的大肠杆菌，已于2009年11月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：3415，分类命名大肠埃希氏菌Escherichia coli。 

本发明还包括上述细胞膜表达ALV-env蛋白荧光表达转基因质粒在禽白血病假病毒上的应用。 

细胞膜表达ALV-env蛋白荧光表达转基因质粒被转染到宿主细胞(如HEK293细胞)后，env基因可表达禽白血病的囊膜蛋白，并定植到宿主细胞膜表面，同时在宿主细胞浆中表达报告基因—绿色荧光蛋白。将ALV-env基因和绿色荧光蛋白基因(EmGFP)整合到宿主细胞染色体中，并在宿主细胞膜表面表达出禽白血病的囊膜蛋白，同时在宿主细胞浆中表达报告基因—绿色荧光蛋白。利用这种出现绿色荧光并在细胞膜上表达ALV-env蛋白的HEK293细胞，借助辅助质粒(pLP1、pLP2，Invitrogen公司)可制备禽白血病假病毒。 

制备出的假病毒可用于检测禽白血病病毒(ALV-J亚型)的中和抗体：当待测样本中具有足够量的抗ALV-J亚型中和抗体时，可阻止该假病毒与宿主细胞结合，当样本无抗禽白血病病毒(ALV-J亚型)中和抗体或中和抗体较少时，该假病毒可与宿主细胞结合，24小时后在荧光显微镜下检测宿主细胞有无绿色荧光，如有可发出绿色荧光的宿主细胞则说明样本中没有中和抗体，样本检测结果为阴性；如无可发出绿色荧光的宿主细胞(阴性对照样本细胞可发出荧光)细胞则说明样本中有中和抗体，样本检测结果为阳性。 

本发明的有益效果是：利用本发明构建的pLenti7.3/ALV-env质粒与辅助质粒共同转染HEK293细胞，制备ALV-J假病毒，可代替利用活的ALV-J病毒进行中和试验，避免了活ALV病毒对环境的污染。由于假病毒可自发发荧光，在中和实验中可以省略荧光抗体染色部分，减少非特异性荧光反应。 

(四)附图说明

图1通过PCR扩增的ALV-env基因电泳结果：1是env扩增片段；M是DNA分子量标记2K DNA Marker。 

图2ALV-env基因与Peasy-T1克隆载体构建的T-env酶切鉴定结果：1是T-env克隆单酶切；2是T-env双酶切；3是DNA分子量标记2K plus DNA Marker。 

图3ALV-env基因pLenti7.3载体构建的pLenti7.3/ALV-env酶切鉴定结果：1是ALV-env/ALV-env表达载体双酶切产物；M是DNA分子量标记15K DNA Marker。 

图4细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒结构图：ALV-env是插入的外源基因，其余部分为pLenti7.3载体。 

pLenti7.3/ALV-env表达质粒的结构特征如下： 

HIV长末端杂交启动子(RSV/5’LTR hybrid promoter)：1-410 

RSV promoter：bases 1～229 

HIV-1 5’LTR：bases 230～410 

HIV包装信号(HIV-1 psi(ψ)packaging signal)：521～565 

HIV反转录元件(HIV-1 Rev response element(RRE))：1075～1308 

Cppt：bases 1801-1923 

CMV启动子(CMV promoter)：1935～2519 

禽白血病膜蛋白基因(ALV-env)：2570～4327 

V5标签(V5 epitope)：4345～4386 

WPRE：bases 4405-5002 

SV40启动子(SV40 promoter)：5013～5321 

绿色荧光蛋白基因(EmEMGFP)：5380～6099 

HIV长末端重复序列(ΔU3/3’LTR)：6170～6404 

ΔU3：bases 6170～6223 

3’LTR：bases 6224～6404 

SV40多聚A(SV40 polyadenylation signal)：6476～6607 

氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin(bla)resistance gene)：7565～8425 

质粒骨架(pUC origin)：8570～9243 

9243～9650：原商品化载体中未注明部分。 

其中禽白血病膜蛋白基因(ALV-env)是本发明制备的基因，其余部分来自商品化质粒pLenti7.3。 

图5表达载体转染后48小时荧光检测结果：发出荧光的细胞为已转染pLenti7.3/ALV-env将要释放假病毒的HEK293细胞。 

图6中和试验结果观察：为假病毒与宿主细胞结合后培养24小时，在荧光显微镜下观察到的可发出绿色荧光的细胞，此时样本为阴性。 

(五)具体实施方式

一、ALV-env基因的获取 

利用含启动序列的ALV-env特异性引物，通过PCR方法，自禽白血病病毒细胞培养物中扩增禽白血病ALV-env基因。 

1、DNA摸板的提取 

将ALV-J病毒毒株接种于100mL细胞培养瓶中长成70％-80％的鸡胚成纤维细胞(CEF)单层。接种后细胞维持7-10天，收集接种病毒培养的细胞，按照以下程序提取组织DNA： 

1)收集接种病毒的细胞瓶中细胞，细胞经Hanks液轻轻吹打洗涤数次，然后每瓶加入 0.25％胰酶0.5～1.0ml，37℃温箱中放置5～10min，将细胞消化吹打后收集于5ml离心管。 

2)1×PBS液洗涤，2000rpm离心沉淀转移到1.5ml离心管中，然后加入300μl抽提液(100mmol/LNaCl，10mmol/L Tris.Cl PH 8.0，25mmol/L EDTA pH 8.0，0.5％SDS)悬浮后，加入蛋白酶K(100μg/ml)，55℃水浴中消化过夜。 

3)加入等体积的苯酚/氯仿溶液(苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)约400μl抽提一次，将上层液体转移到另一1.5ml离心管中，加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和2倍体积无水乙醇后，置于-20℃冷却2h或者更长时间。 

4)取出后12000rpm离心10min沉淀DNA，以70％乙醇悬浮DNA沉淀后，12000rpm离心5～10min，弃去上清。 

5)经乙醇沉淀后的DNA，空气中室温自然干燥后，溶解于50μl体积的TE Buffer 

(10mmol Tris-Cl，1mmol EDTA，pH 8.0)中，核酸定量约为50～100ng/μl，即为模板DNA，以用于扩增整合进细胞基因组的ALV-J的前病毒DNA模板。 

2、ALV-env基因扩增 

ALV-env基因特异性引物： 

上游引物：5’ATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCAC 3’ 

下游引物：5’GACAGCTGCTCCCTAATTCTATG 3’ 

PCR反应体系如下： 

ddH₂O                15.8μL 

10×Buffer           2.5μL 

MgCl₂                2.0μL 

4dNTP                2.0μL 

上游引物(20pM)       1.0μL 

下游引物(20pM)       1.0μL 

Taq enzyme           0.2μL 

Model DNA            1μL 

PCR反应程序如下 

94℃10mini 

94℃1min 

57℃1min 

72℃2min 

72℃10min 

4℃保存 

反应结束后，进行琼脂糖电泳，目的基因长度为1710bp，见附图1。 

3、PCR产物与Peasy-T1克隆 

将扩增的PCR产物与与Peasy-T1克隆载体连接，获得T-env克隆载体。其构建过程是： 

建立5微升连接体系： 

PCR产物             0.5μL 

Peasy-T1            4.5μL 

连接体系室温反应10-15分钟 

感受态细胞的转化： 

取5μL连接产物转化TOP10感受态细胞。 

挑取单阳性菌落，接种到含5mL LB(含100μg/mL)培养基的试管中，37℃震荡培养过夜。提取质粒，利用限制性内切酶BamH1、Xho1酶切，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳，见到1710bp和3928bp两条DNA片段，见附图2。 

二、ALV-env与pLenti7.3连接： 

利用限制性内切酶BamH1、Xho1酶切T-env克隆载体。利用1％琼脂糖凝胶进行电泳，从胶上回收带有粘性末端的ALV-env片断。 

利用限制性内切酶BamH1、Xho1酶切质粒pLenti7.3，将线形化的载体与从回收的DNA片断用T4DNA连接酶连接，得到细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒pLenti7.3/Alv-env质粒。 

其构建过程是： 

T-env载体与pLenti7.3表达载体双酶切 

建立50微升酶切反应体系： 

BamH1              2μL 

Xho1               2μL 

10×K Buffer       5μL 

Plasmid            30μL 

ddH2O              11μL 

37℃水浴4h。电泳切胶回收。 

ALV-env片段与pLenti7.3表达载体连接： 

回收表达载体与ALV-env片段，建立连接反应体系： 

PCR产物        2μl 

pLenti7.3         8μl 

Solution I        10μl 

16℃连接过夜。 

5、转化和增菌 

转化Stbl3感受态，挑取单菌落，接种到含10mL LB(含100μg/mL)培养基的试管中，37℃震荡培养过夜，提取质粒后利用限制性内切酶BamH1、Xho1酶切，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳，见到1710bp和7935bp两条DNA片段，见图3。DNA序列测定，确认ALV-env已与pLenti7.3表达载体重组，阅读框架正确，获得pLenti7.3/ALV-env表达载体质粒。 

6、增菌并提取质粒 

大量培养，利用QIAGEN DNA质粒纯化试剂盒，提取质粒，电泳鉴定。具体过程如下： 

(1)将筛选克隆重新划板，挑取单菌落，接种到含10mL LB培养基的试管中，37℃震荡培养过夜，取1培养物mL接种到含100mL LB(含100μg/mL)培养基的试管中，37℃震荡培养过夜，。 

(2)利用QIAGEN DNA质粒纯化试剂盒提取质粒： 

1)取30mL细菌培养物于50mL离心管中，离心使细菌沉淀。 

2)加1mL裂解液I，剧烈振荡，悬浮菌体。 

3)加1mL裂解液II，轻轻混匀，冰浴不超过5分钟。 

4)加1mL裂解液III，上下振荡，冰浴10分钟。 

5)12000rpm离心10min，取上清夜。 

6)将上清装入层析柱中，垂直静置，待上清夜完全通过层析柱。 

7)加2mL洗脱，垂直静置，待洗脱液完全通过层析柱。 

8)收集洗脱液，检测DNA浓度，-20℃冰箱保存备用。 

三、制备细胞膜表达ALV-env蛋白、细胞浆表达绿色荧光蛋白HEK293细胞 

将HEK293细胞接种24孔板，每孔1ml MEM+10％FBS(胎牛血清)，培养至70％～80％细胞融合。每孔加入脂质体-DNA转染液(pLenti7.3/ALV-env 0.8μg；，辅助质粒PLp1，PLp20.8μg；脂质体2μg)表达质粒混合溶液，稍稍震荡混匀，于37℃、CO₂5％的培养箱里培养6小时，弃转染液，每孔加入含10％FBS的DMEM 1ml，60～72小时观察可在宿主细胞浆中出现绿色荧光(激发光波长488nm，发射光波长567nm)，见图5。收集上清液，滴定禽白血病假病毒滴度(ID₅₀)。-20℃冰箱保存。该禽白血病假病毒可用于检测禽白血病病毒中和抗体的病毒效价。 

四、禽白血病假病毒的应用 

连续稀释测待检血清样本，用50～100*ID₅₀禽白血病假病毒与等量的已稀释的待检样本混合，37℃孵育30分钟，接种鸡胚成纤维细胞，37℃孵育24～48小时。如果样品中含有足够量的抗ALV-J亚型中和抗体时，可阻止该假病毒与鸡胚成纤维细胞结合；当样本无抗禽白血病病毒中和抗体或中和抗体较少时，该假病毒可与鸡胚成纤维细胞结合。24小时后在荧光显微镜下检测鸡胚成纤维细胞是否可发出绿色荧光，如观察到可发出绿色荧光的鸡胚成纤维细胞则说明样本中没有足够的中和抗体(如图6)，样本为阴性；如无可发出绿色荧光的细胞(阴性对照样本细胞可发出荧光)则说明样本中有中和抗体，样本为阳性。 

利用本发明构建的pLenti7.3/ALV-env质粒与辅助质粒共同转染HEK293细胞，制备ALV-J假病毒，可代替利用活的ALV-J病毒进行中和试验，避免了活ALV病毒对环境的污染。由于假病毒可自发荧光，在中和实验中可以省略荧光抗体染色部分，减少非特异性荧光反应，并可节约时间和试剂。 

<110>山东农业大学 

<120>细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒的构建及应用 

<160>2 

<210>1 

<211>2932 

<212>DNA 

<213>质粒(Plasmid) 

<220> 

<221>CDS 

<222>(1175)..(2932) 

<400>1 

ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat     60 

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tagtaacggc cgccagtgtg ctggaattgc cctt atg gaa gcc gtc ata aag gca   1195 

                                     Met Glu Ala Val Ile Lys Ala 

                                     1               5 

ttt ctg act ggg cac cct gga aag gtg agc aag aag gac tct aag aag    1243 

Phe Leu Thr Gly His Pro Gly Lys Val Ser Lys Lys Asp Ser Lys Lys 

        10                  15                  20 

aag ccg cca gca aca agc aag aaa gac ccg gag aag aca ccc ttg ctg    1291 

Lys Pro Pro Ala Thr Ser Lys Lys Asp Pro Glu Lys Thr Pro Leu Leu 

    25                  30                  35 

cca tcg aga ggt tac ttt ttc ttt caa acg ata ctt gtg tgc gtg gtt    1339 

Pro Ser Arg Gly Tyr Phe Phe Phe Gln Thr Ile Leu Val Cys Val Val     

40                  45                  50                  55 

att att tcc gtt gtc cca ggg gtg ggg gga gtt cat ctg ttg cga caa    1387 

Ile Ile Ser Val Val Pro Gly Val Gly Gly Val His Leu Leu Arg Gln 

                60                  65                  70 

cca gga aac gtg tgg gtc acc tgg gca aat atg acg ggc cga aca gat    1435 

Pro Gly Asn Val Trp Val Thr Trp Ala Asn Met Thr Gly Arg Thr Asp 

            75                  80                  85 

ttt tgc ctt agt cta cag tca gcg acc tca cca ttc cgc acc tgc ttg    1483 

Phe Cys Leu Ser Leu Gln Ser Ala Thr Ser Pro Phe Arg Thr Cys Leu 

        90                  95                  100 

ata ggc att cca cag tat cct ctg aac acc ttt gag gga tat gtc act    1531 

Ile Gly Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Asn Thr Phe Glu Gly Tyr Val Thr 

    105                 110                 115 

aat gtt act gct tgc gat aac gac gcc gat tta gcc agc caa aca gca    1579 

Asn Val Thr Ala Cys Asp Asn Asp Ala Asp Leu Ala Ser Gln Thr Ala 

120                 125                 130                 135 

tgc ttg ata cag gct cta aat aca acc ctc cct tgg gac ccc caa gaa    1627 

Cys Leu Ile Gln Ala Leu Asn Thr Thr Leu Pro Trp Asp Pro Gln Glu 

                140                 145                 150 

ttg gat att tta ggg tcc cag atg atc aag aac gga aca aca cgt acg    1675 

Leu Asp Ile Leu Gly Ser Gln Met Ile Lys Asn Gly Thr Thr Arg Thr 

            155                 160                 165 

tgt gtt acc ttt ggt tcg gtg tgc tat aaa gag aac aat cgc agt aga    1723 

Cys Val Thr Phe Gly Ser Val Cys Tyr Lys Glu Asn Asn Arg Ser Arg 

        170                 175                 180 

gtc tgt cac aat ttt gat ggg aat ttt aat ggg act ggt ggg gcg gaa    1771 

Val Cys His Asn Phe Asp Gly Asn Phe Asn Gly Thr Gly Gly Ala Glu 

    185                 190                 195 

gca gaa ttg cgt gac ttc ata gca aaa tgg aaa agt gat gac ctt ctt    1819 

Ala Glu Leu Arg Asp Phe Ile Ala Lys Trp Lys Ser Asp Asp Leu Leu     

200                 205                 210                 215 

ata agg ccc tat gtc aac caa tca tgg acg atg gta agt cca ata aac    1867 

Ile Arg Pro Tyr Val Asn Gln Ser Trp Thr Met Val Ser Pro Ile Asn 

                220                 225                 230 

aca gag agt ttt tca ata agt agt aga tat tgt gga ttc acc agt aac    1915 

Thr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Ser Arg Tyr Cys Gly Phe Thr Ser Asn 

            235                 240                 245 

gag act cgt tac tat aga agg aac cgt tct agt tgg tgt agt tca aaa    1963 

Glu Thr Arg Tyr Tyr Arg Arg Asn Arg Ser Ser Trp Cys Ser Ser Lys 

        250                 255                 260 

ggg gga gaa tgg tca gca ggg tac agc aac ggg aca gaa tgt tcc agc    2011 

Gly Gly Glu Trp Ser Ala Gly Tyr Ser Asn Gly Thr Glu Cys Ser Ser 

    265                 270                 275 

aac acg agg ggt tgc ggt ggt aat tgt aca gcg gaa tgg aat tat tat    2059 

Asn Thr Arg Gly Cys Gly Gly Asn Cys Thr Ala Glu Trp Asn Tyr Tyr 

280                 285                 290                 295 

gca tat ggg ttt acc ttc ggg aaa cag cca gag gtg ttg tgg aac aat    2107 

Ala Tyr Gly Phe Thr Phe Gly Lys Gln Pro Glu Val Leu Trp Asn Asn 

                300                 305                 310 

ggg act gct aag gca ctc cct cca ggt att ttc ttg att tgt ggg gac    2155 

Gly Thr Ala Lys Ala Leu Pro Pro Gly Ile Phe Leu Ile Cys Gly Asp 

            315                            320                          325 

agg gct tgg caa ggt atc cca cgt aac gcc ttg gga ggg ccc tgt tat    2203 

Arg Ala Trp Gln Gly Ile Pro Arg Asn Ala Leu Gly Gly Pro Cys Tyr 

         330                 335                 340 

cta gga caa ttg act atg ctc tct cct aac ttt acc acc tgg ata aca    2251 

Leu Gly Gln Leu Thr Met Leu Ser Pro Asn Phe Thr Thr Trp Ile Thr 

    345                 350                 355 

tat ggg ccg aac att acg ggt cac cgc cgt agc agg cgc tcg ccg aat    2299 

Tyr Gly Pro Asn Ile Thr Gly His Arg Arg Ser Arg Arg Ser Pro Asn 

360                 365                 370                 375 

cat ctc tcg cct gac tgc aat gac gag gta cag cta tgg agt gtg aca    2347 

His Leu Ser Pro Asp Cys Asn Asp Glu Val Gln Leu Trp Ser Val Thr 

                380                 385                 390 

gcc cgg ata ttt gct tct ttc ttt gct cct ggt gta gcc gca gca cag    2395 

Ala Arg Ile Phe Ala Ser Phe Phe Ala Pro Gly Val Ala Ala Ala Gln 

            395                 400                 405 

gcc tta aag gag att gaa cgc ttg gca tgt tgg tcg gtt aag cag gcg    2443 

Ala Leu Lys Glu Ile Glu Arg Leu Ala Cys Trp Ser Val Lys Gln Ala 

        410                 415                 420 

aat tta aca tca tta ata ttg aat gcg ata ctg gag gat acg aac agt    2491 

Asn Leu Thr Ser Leu Ile Leu Asn Ala Ile Leu Glu Asp Thr Asn Ser 

    425                 430                 435 

atc cgg cac gcg gtg ttg cag aat cga gca gcc atc gac ttc tta ctc    2539 

Ile Arg His Ala Val Leu Gln Asn Arg Ala Ala Ile Asp Phe Leu Leu 

440                 445                 450                 455 

ctg gcg cag gga cac ggg tgt caa gac gtg gaa ggg atg tgt tgc ttc    2587 

Leu Ala Gln Gly His Gly Cys Gln Asp Val Glu Gly Met Cys Cys Phe 

                460                 465                 470 

aat ctc agc gat cat agt gag tcc att cac aag gcg ctt caa gcc atg    2635 

Asn Leu Ser Asp His Ser Glu Ser Ile His Lys Ala Leu Gln Ala Met 

            475                 480                 485 

aag gag cat aca gag aag ata cgg gtg gaa gac gat ccc ata ggg gat    2683 

Lys Glu His Thr Glu Lys Ile Arg Val Glu Asp Asp Pro Ile Gly Asp 

        490                 495                 500 

tgg ttt acg cgc acg ttt ggt ggt ctt gga ggg tgg ctc gcg aaa ggt    2731 

Trp Phe Thr Arg Thr Phe Gly Gly Leu Gly Gly Trp Leu Ala Lys Gly 

    505                 510                 515 

gtt aag acg ctg ctg ttt gcc ttg ctt gtc ata gtc tgt cta tta gct    2779 

Val Lys Thr Leu Leu Phe Ala Leu Leu Val Ile Val Cys Leu Leu Ala 

520                 525                 530                 535 

atc att cca tgt ata atc aag tgc ttc cag gat tgc cta tcg aga aca    2827 

Ile Ile Pro Cys Ile Ile Lys Cys Phe Gln Asp Cys Leu Ser Arg Thr 

                540                 545                 550 

atg tat cag ttt atg gat gaa cgc ata aga tat cat aga att agg gag    2875 

Met Tyr Gln Phe Met Asp Glu Arg Ile Arg Tyr His Arg Ile Arg Glu 

            555                 560                 565 

cag ctg tca agg gca att ctg cag ata tcc atc aca ctg gcg gcc gct    2923 

Gln Leu Ser Arg Ala Ile Leu Gln Ile Ser Ile Thr Leu Ala Ala Ala 

        570                 575                 580 

cga gtc tag                                                        2932 

Arg Val 

    585 

<210>2 

<211>585 

<212>PRT 

<213>禽白血病病毒Avian Leukosis Virus 

<400>2 

Met Glu Ala Val Ile Lys Ala Phe Leu Thr Gly His Pro Gly Lys Val 

1               5                  10                 15 

Ser Lys Lys Asp Ser Lys Lys Lys Pro Pro Ala Thr Ser Lys Lys Asp 

            20                  25                30 

Pro Glu Lys Thr Pro Leu Leu Pro Ser Arg Gly Tyr Phe Phe Phe Gln 

        35                  40                 45 

Thr Ile Leu Val Cys Val Val Ile Ile Ser Val Val Pro Gly Val Gly 

    50                 55               60 

Gly Val His Leu Leu Arg Gln Pro Gly Asn Val Trp Val Thr Trp Ala 

65                  70                  75                 80 

Asn Met Thr Gly Arg Thr Asp Phe Cys Leu Ser Leu Gln Ser Ala Thr 

                 85                  90                 95 

Ser Pro Phe Arg Thr Cys Leu Ile Gly Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Asn 

            100                105               110 

Thr Phe Glu Gly Tyr Val Thr Asn Val Thr Ala Cys Asp Asn Asp Ala 

        115                120                 125 

Asp Leu Ala Ser Gln Thr Ala Cys Leu Ile Gln Ala Leu Asn Thr Thr 

    130                135                 140 

Leu Pro Trp Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Gly Ser Gln Met Ile 

145                 150                 155                 160 

Lys Asn Gly Thr Thr Arg Thr Cys Val Thr Phe Gly Ser Val Cys Tyr 

                165                 170                 175 

Lys Glu Asn Asn Arg Ser Arg Val Cys His Asn Phe Asp Gly Asn Phe 

            180                 185                 190 

Asn Gly Thr Gly Gly Ala Glu Ala Glu Leu Arg Asp Phe Ile Ala Lys 

        195                 200                 205 

Trp Lys Ser Asp Asp Leu Leu Ile Arg Pro Tyr Val Asn Gln Ser Trp 

    210                 215                 220 

Thr Met Val Ser Pro Ile Asn Thr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Ser Arg 

225                 230                 235                 240 

Tyr Cys Gly Phe Thr Ser Asn Glu Thr Arg Tyr Tyr Arg Arg Asn Arg 

                245                 250                 255 

Ser Ser Trp Cys Ser Ser Lys Gly Gly Glu Trp Ser Ala Gly Tyr Ser 

            260                 265                 270 

Asn Gly Thr Glu Cys Ser Ser Asn Thr Arg Gly Cys Gly Gly Asn Cys 

        275                 280                 285 

Thr Ala Glu Trp Asn Tyr Tyr Ala Tyr Gly Phe Thr Phe Gly Lys Gln 

    290                 295                 300 

Pro Glu Val Leu Trp Asn Asn Gly Thr Ala Lys Ala Leu Pro Pro Gly 

305                 310                 315                 320 

Ile Phe Leu Ile Cys Gly Asp Arg Ala Trp Gln Gly Ile Pro Arg Asn 

                325                 330                 335 

Ala Leu Gly Gly Pro Cys Tyr Leu Gly Gln Leu Thr Met Leu Ser Pro 

            340                 345                 350 

Asn Phe Thr Thr Trp Ile Thr Tyr Gly Pro Asn Ile Thr Gly His Arg 

        355                 360                 365 

Arg Ser Arg Arg Ser Pro Asn His Leu Ser Pro Asp Cys Asn Asp Glu 

    370                 375                 380 

Val Gln Leu Trp Ser Val Thr Ala Arg Ile Phe Ala Ser Phe Phe Ala 

385                 390                 395                 400 

Pro Gly Val Ala Ala Ala Gln Ala Leu Lys Glu Ile Glu Arg Leu Ala 

                405                 410                 415 

Cys Trp Ser Val Lys Gln Ala Asn Leu Thr Ser Leu Ile Leu Asn Ala 

            420                 425                 430 

Ile Leu Glu Asp Thr Asn Ser Ile Arg His Ala Val Leu Gln Asn Arg 

        435                 440                 445 

Ala Ala Ile Asp Phe Leu Leu Leu Ala Gln Gly His Gly Cys Gln Asp 

    450                 455                 460 

Val Glu Gly Met Cys Cys Phe Asn Leu Ser Asp His Ser Glu Ser Ile 

465                 470                 475                 480 

His Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Glu His Thr Glu Lys Ile Arg Val 

                485                 490                 495 

Glu Asp Asp Pro Ile Gly Asp Trp Phe Thr Arg Thr Phe Gly Gly Leu 

            500                 505                 510 

Gly Gly Trp Leu Ala Lys Gly Val Lys Thr Leu Leu Phe Ala Leu Leu 

        515                 520                 525 

Val Ile Val Cys Leu Leu Ala Ile Ile Pro Cys Ile Ile Lys Cys Phe 

    530                 535                 540 

Gln Asp Cys Leu Ser Arg Thr Met Tyr Gln Phe Met Asp Glu Arg Ile 

545                 550                 555                 560 

Arg Tyr His Arg Ile Arg Glu Gln Leu Ser Arg Ala Ile Leu Gln Ile 

                565                 570                 575 

Ser Ile Thr Leu Ala Ala Ala Arg Val 

            580                 585