结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建

摘要

目的 利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP.方法 根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列.将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD 18 T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒.将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒.Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Western blot检测mtHSP70蛋白表达情况. 结果 酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达.结论 含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础.