一种靶向沉默H19RNA表达的单链反义RNA及其效果检测方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，公开了一种沉默非编码癌基因H19RNA表达的单链反义RNA及其效果检测方法。所述单链反义RNA是以H19RNA的第五外显子的部分序列作为靶位点，设计并合成的23nt，27nt，31nt，35nt，39nt单链反义RNA，其5’和3’均为羟基，不带有其它化学修饰。采用脂质体介导法转染人宫颈癌Hela细胞和人前列腺癌PC3细胞，sasRNA能够持久、高效、特异地抑制H19RNA的表达。流式细胞检测sasRNA介导的H19RNA表达水平的下调导致细胞周期阻滞于G2/M期。本发明的单链反义RNA效果明显，检测方法操作简便，成本低廉，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种沉默非编码癌基因H19 RNA表达的单链反义RNA及其效果检测方法。 

背景技术

基因沉默是指生物体内的特定基因由于各种调控因素的存在导致不能表达或表达降低的生物学现象，它不仅是生物体调节基因表达、维持正常生理活动的重要方式，同时也是对特定基因进行功能研究和注释，发掘疾病治疗药物靶点乃至实施疾病基因治疗的重要途径。目前常用的基因沉默技术主要包括三大类，第一类是反义DNA(antisense oligonucleotide，ASO)技术。反义DNA是指一段能与特定基因的mRNA以碱基互补配对的方式结合的反义寡核苷酸，能够阻止靶基因的转录或是翻译，从而下调基因表达(Ideue，T.，Hino，K.，Kitao，S.，Yokoi，T.，and Hirose，T.Efficient oligonucleotide-mediated degradation of nuclearnoncoding RNAs in mammalian cultured cells.RNA 2009，15，1578-1587.)。第二类是反义RNA(antisense RNA)技术。反义RNA是指能与特定基因的RNA序列互补配对的一段RNA分子，通过造成靶基因RNA的稳定性下降或是影响mRNA的转录或翻译而沉默基因的表达(Achenbach，T.V.，Brunner，B.，and Heermeier，K.Oligonucleotide-based knockdown technologies：antisense versus RNAinterference.Chembiochem 2003，4，928-935；Beisner，J.，Dong，M.，Taetz，S.，Nafee，N.，Griese，E.U.，Schaefer，U.，Lehr，C.M.，Klotz，U.，andMurdter，T.E.Nanoparticle mediated del ivery of 2’-O-methyl-RNA leads toefficient telomerase inhibition and telomere shortening in human lungcancer cells.Lung Cancer.，68，346-354)。第三类是RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术。RNA干扰是以21～23bp的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)为效应分子，导引RISC复合体(RNA-induced silencing compplex)识别并切割靶分子mRNA的过程(Scherer，L.J.，and Rossi，J.J.Approaches for thesequence-specific knockdown of mRNA.Nat Biotechnol 2003，21，1457-1465.)。这三种方法各有优劣，但在实际应用中，往往面对相同的问题：(1)基因沉默的效率不高，导致靶基因的表达不能被有效抑制；(2)基因沉默的持续时间较短，导 致靶基因的表达回复较快，难以完成功能分析；(3)基因沉默的作用特异性不高，引起脱靶效应或是免疫副反应，造成对结果的误判(Lin，X.，Ruan，X.，Anderson，M.G.，McDowell，J.A.，Kroeger，P.E.，Fesik，S.W.，and Shen，Y.siRNA-mediated off-target gene silencing triggered by a 7 ntcomplementation.Nucleic Acids Res 2005，33，4527-4535；Tschuch，C.，Schulz，A.，Pscherer，A.，Werft，W.，Benner，A.，Hotz-Wagenblatt，A.，Barrionuevo，L.S.，Lichter，P.，and Mertens，D.Off-target effects of siRNA specificfor GFP.BMC Mol Biol 2008，9，60；Kleinman，M.E.，Yamada，K.，Takeda，A.，Chandrasekaran，V.，Nozaki，M.，Baffi，J.Z.，Albuquerque，R.J.，Yamasaki，S.，Itaya，M.，Pan，Y.Sequence-and target-independent angiogenesissuppression by siRNA via TLR3.Nature 2008，452，591-597.)。此外，对一个特定靶基因的mRNA来说，局部的二级结构等特性又使得不同位点呈现出不同的可接近性(accessibility)，进而造成基因沉默效果的巨大差异。因此，寻找有效的基因沉默方式和有效的靶基因作用位点，仍然是实际研究工作中面临的巨大挑战。 

H19RNA是在多种肿瘤组织如人宫颈癌，人前列腺癌，人肝癌，乳腺癌等高表达的非编码RNA，被认为是一个癌基因，具有促进癌症发生和发展的作用(mad J.Matouk，N.D.，Shaul Mezan，Suhail Ayesh，Rasha Abu-lail，Abraham Hochberg，Eithan Galun.The H19 Non-Coding RNA Is Essential for Human Tumor Growth.PLoS ONE 2007，2，1-15.；Tomomi Yoshimizu，A.M.，Marie-Anne Ripoche，AnneGabory，Maria Vernucci，Andrea Riccio，Sabine Colnot，Cécile Godard，BenoitTerris，Hélène Jammes，and Luisa Dandolo.The H19 locus acts in vivo asa tumor suppressor.PNAS 2008，105，12417-12422.)。因此，发展一种有效的基因沉默技术敲除或敲低H19 RNA在恶性肿瘤组织中的表达，将为实现相关疾病的基因治疗提供新的药物靶点和新的治疗方式，这无疑具有重要的应用价值和发展前景。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种靶向沉默非编码癌基因H19 RNA表达的单链反义RNA及其效果检测方法。 

为达到上述目的，本发明采用了如下的技术措施： 

本发明所提供的单链反义RNA是以H19 RNA的第五外显子的部分序列作为靶位点，设计并合成的23～39nt单链反义RNA(sasRNA)，其5’和3’均为羟基，不带有其它化学修饰； 

所述的单链反义RNA包括如下序列(序列方向均为5’-3’)： 

sasRNA-23，HO-UUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUC-OH； 

sasRNA-27，HO-UCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUG-OH； 

sasRNA-31，HO-UGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGU-OH； 

sasRNA-35，HO-GGUGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGUUC-OH； 

sasRNA-39，HO-AUGGUGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGUUCCU-OH。 

本发明所提供的单链反义RNA的效果检测方法，包括如下步骤： 

(1)sasRNA转染人类肿瘤细胞 

将化学合成的sasRNA用DEPC处理水稀释为20μM浓度的溶液，贮存于-80℃超低温冰箱；使用Lipofectamine2000脂质体转染试剂将sasRNA分别反式转染人类肿瘤细胞； 

(2)Northern blot和荧光定量PCR检测H19 RNA的表达水平 

Trizol法提取转染后各细胞样品的总RNA，部分总RNA用于Northern blot检测；部分总RNA用于逆转录反应合成cDNA，采用SYBR Green I荧光定量PCR方法以基因特异引物检测H19RNA和内参β-actin mRNA的表达水平，2^-ΔΔCt方法计算H19RNA的敲除水平； 

(3)碘化丙啶染色结合流式细胞仪分析细胞周期的时相分布变化 

转染48小时后用胰酶消化处理细胞制备单细胞悬液，碘化丙啶(PI)对基因组DNA进行染色，流式细胞仪分析不同处理组的细胞周期时相分布。 

(4)sasRNA是否激活免疫副反应 

终浓度40nmol/L的sasRNA转染肿瘤、细胞，48h后收集细胞，Trizol提取总RNA，半定量RT-PCR检测干扰素系统标志基因的表达情况，内参为β-actinmRNA； 

(5)sasRNA是否造成脱靶效应 

选取人类基因组中mRNA序列与sasRNA存在相似性的4个基因，转染sasRNA后48h收集样品，半定量RT-PCR检测这四个基因的mRNA水平，内参为 β-actin mRNA。 

进一步的技术方案是： 

SYBR Green I荧光定量PCR(real-time PCR)的方法检测H19 RNA的表达水平，所用的定量PCR引物为：H19QF，GGAAATGAATATGCTGCACTTTACAACC；H19QR，GCTGCTGTTCCGATGGTGT；内参β-actin mRNA的定量PCR引物为：ActQF，CGTGGACATCCGCAAAGAC；ActQR，TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。 

用Northern blot的方法检测H19RNA的表达水平，所用特异探针的序列为：H19RNA的探针序列为：GCTGCTGTTCCGATGGTGT；内参β-actin mRNA的杂交探针序列为：TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。 

检测sasRNA是否激活免疫副反应，所用的检测干扰素系统相关基因的特异引物为：OAS1-F，TCTCAGAAATACCCCAGCCAA，OAS 1-R，GAAGACAACCAGGTCAGCGTC；IFNG-F，AGATGTAGCGGATAATGGAACTCT，IFNG-R，TCTTCCTTGATGGTCTCCACACTC；IFNK-F，CACCCTATCCCTGGACTGTAAC，IFNK-R，TGGGGCAACTCAAAAGCTATGT；ISG20-F，ACTGAAACAGGGTCGGGATG，ISG20-R，GCCGGATGAACTTGTCGTAC；IFNB1-F，CCAACAAGTGTCTCCTCCAAAT，IFNB1-R，AATCTCCTCAGGGATGTCAAAG。 

检测sasRNA是否造成脱靶效应，所检测的部分同源基因及其特异引物为：KeratinF，GTGGCATTGGTGGTGGCATC，KeratinR，GGCTTTCAGCAAGTGGGCTC；USP9xF，CAAACAGATACAGCCCACCCT，USP9xR，TAGAGGGCCAAAGGTCAAATC；GAL10F，CAGTGGAGAAAAGAACCCGACG，GAL10R，GCTGGTGGAAGCCATAGATTG；ZNF420F，CTCAGGAAGAGTGGGAATGCC，ZNF420R，TGCTTCTCCATCTTGCCTTTG。 

作为对照，本发明还合成相应的小干扰RNA(siRNA)21bp siRNA，Guide：AUGGUGUCUU UGAUG UUGG dTdT，Pasenger：CCAAC AUCAA AGACA CCAU dTdT； 

所有的RNA寡核苷酸由大连宝生物科技有限公司(Takara)合成，5’和3’端均为羟基，不带有其它任何修饰，PAGE纯化，电泳显示为单一、纯净条带；DNA寡核苷酸由英骏生物科技有限公司(Invitrogen，上海)合成，两侧均为羟基，不带有其它任何修饰，PAGE纯化，电泳显示为单一、纯净条带。 

靶位点和寡核苷酸的位置信息见附图1。H19RNA由五个外显子和四个短的内含子组成，靶位点位于第五外显子的5’端部分。靶位点的序列，化学合成的sasRNA和siRNA的序列如图所示。上游引物P1和下游引物P2为 荧光定量PCR引物的退火位置。 

综合上述内容并结合实施例所示的信息，本发明所提供的单链反义RNA及其效果检测方法，具有如下的优势： 

(1)相对于同一位点的siRNA及其它对照效应分子，sasRNA在低剂量转染条件下，即可具有强劲的基因沉默能力，能够高效抑制靶基因H19 RNA的表达。 

(2)相对于同一位点的siRNA及其它对照效应分子，sasRNA对H19 RNA的基因沉默效应可以持续至少6天以上，具有持久性的特点，这为进行H19 RNA的功能研究提供了新基因沉默技术体系。 

(3)sasRNA对靶基因H19RNA的沉默效应是特异的，既不会引起免疫副反应，也不会造成脱靶效应，因而其生物学效应也是特异的。 

(4)sasRNA介导的H19RNA的基因沉默导致肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G2/M期，显著影响细胞周期进程，减缓细胞的分裂速度。这为以H19RNA为药物靶点的肿瘤治疗提供了新的方法和手段。 

(5)操作简便易行，成本低廉，检测方法稳定可靠。 

附图说明

图1H19 RNA的靶位点和sasRNA以及siRNA的序列信息。 

图2荧光定量PCR检测sasRNA的基因沉默效果。 

图3Northern blot检测sasRNA的基因沉默效果。 

图4低剂量的sasRNA可介导高效的基因沉默。 

图5sasRNA可介导持久的基因沉默效应。 

图6sasRNA沉默H19 RNA的表达引起Hela细胞周期的阻滞。 

图7sasRNA沉默H19 RNA的表达引起PC3细胞周期的阻滞。 

图8sasRNA不会激活免疫副反应。 

图9sasRNA不会造成脱靶效应。 

具体实施方式

本发明所提供的单链反义RNA是以H19 RNA的第五外显子的部分序列作为靶位点，设计并合成的23～39nt单链反义RNA(sasRNA)，其5’和3’均为羟基，不带有其它化学修饰； 

本发明所提供的单链反义RNA的效果检测方法，包括如下步骤： 

(1)sasRNA转染人类肿瘤细胞 

将化学合成的sasRNA用DEPC处理水稀释为20μM浓度的溶液，贮存于-80℃超低温冰箱；使用Lipofectamine2000脂质体转染试剂将sasRNA分别反式转染人类肿瘤细胞； 

(2)Northern blot和荧光定量PCR检测H19 RNA的表达水平 

Trizol法提取转染后各细胞样品的总RNA，部分总RNA用于Northern blot检测；部分总RNA用于逆转录反应合成cDNA，采用SYBR Green I荧光定量PCR方法以基因特异引物检测H19 RNA和内参β-actin mRNA的表达水平，2^-ΔΔCt方法计算H19RNA的敲除水平； 

(3)碘化丙啶染色结合流式细胞仪分析细胞周期的时相分布变化 

转染48小时后用胰酶消化处理细胞制备单细胞悬液，碘化丙啶(PI)对基因组DNA进行染色，流式细胞仪分析不同处理组的细胞周期时相分布。 

(4)sasRNA是否激活免疫副反应 

终浓度40nmol/L的sasRNA转染肿瘤、细胞，48h后收集细胞，Trizol提取总RNA，半定量RT-PCR检测干扰素系统标志基因的表达情况，内参为β-actinmRNA； 

(5)sasRNA是否造成脱靶效应 

选取人类基因组中mRNA序列与sasRNA存在相似性的4个基因，转染sasRNA后48h收集样品，半定量RT-PCR检测这四个基因的mRNA水平，内参为β-actin mRNA。 

本发明的优势和特点，可以从下面对实施例的详细描述和附图包含的信息中得到明显的体现. 

实施例1sasRNA的合成与制备及质量控制(附图1) 

所用sasRNA的序列为： 

sasRNA-23，HO-UUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUC-OH； 

sasRNA-27，HO-UCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUG-OH； 

sasRNA-31，HO-UGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGU-OH； 

sasRNA-35，HO-GGUGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGUUC-OH； 

sasRNA-39，HO-AUGGUGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGUUCCU-OH。 

方向为5’-3’，由大连宝生物科技有限公司(Takara)合成，PAGE纯化，不带修饰。 

对照siRNA的序列为：21bp siRNA，Guide：AUGGU GUCUU UGAUG UUGG dTdT，Pasenger：CCAAC AUCAA AGACA CCAU dTdT。由大连宝生物科技有限公司(Takara)合成，PAGE纯化，不带修饰。双链siRNA duplex由Guide和Passenger等摩尔退火形成。 

用DEPC处理水将上述寡核苷酸稀释，并用Nanovue微量分光光度计准确测定各溶液的浓度和纯度，调整为20μmol/L浓度的溶液，保存于-80℃。 

实施例2sasRNA转染Hela细胞敲除并检测对H19RNA的沉默效果(附图2) 

(1)采用反式转染方法将sasRNA转染人宫颈癌Hela细胞，具体步骤为：将生长状态旺盛的Hela细胞用胰酶消化为单细胞悬液，红细胞计数板计数细胞，调整为4×10⁴cells/100μl。 

配制转染复合物，体系如下： 

核                              酸               +(Opti-MEM) 

Lipofectamine2000+(Opti-MEM) 

35nt sasRNA(20μmol/L) 1μl     50μl    1μl    50μl 

21bp siRNA(20μmol/L)  1μl     50μl    1μl    50μl 

将上述各成分混合，室温放置20分钟，形成转染复合物。 

将4×10⁴cells/100μl与上述转染复合物混合，滴于24孔板中，补加300μl完全培养基，置于37℃，5％CO₂的条件下培养。核酸的转染终浓度为40nmol/L。 

Opti-MEM为细胞培养级的无血清培养基，购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000为脂质体转染试剂，购自美国Invitrogen公司。(2)48h后收获细胞，以Trizol法提取细胞的总RNA，主要步骤为： 

-每孔细胞用100μl PBS清洗2次； 

-每孔细胞样品加入600μl Trizol试剂，室温放置5分钟，使细胞裂解； 

-将裂解的细胞样品用移液枪转移到1.5ml离心管中，加入120μl氯仿，上下颠倒混匀； 

-在高速离心机上，以12，000g的转速，4℃的条件下离心15分钟； 

-吸取上清至新鲜离心管，加入300μll异丙醇，冰上放置10分钟； 

-在高速离心机上，以12，000g的转速，4℃的条件下离心10分钟； 

-用移液枪将上清吸走丢弃，用75％的乙醇洗涤沉淀，室温下静置5分钟晾干，彻底去除残余液体； 

-用20μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA； 

-用Nanovue仪器测定RNA样品的浓度及纯度，此样品可长期保存于-80℃。 

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，氯仿、异丙醇、乙醇均购自国药集团，均为分子生物学级别。 

(3)逆转录合成cDNA 

-取2μg总RNA样品用于逆转录反应，首先去除痕量的基因组DNA污染，在0.2ml离心管中配制如下体系： 

RNA(2μg)           10μl 

RQI DNA酶           2μl 

10×DNA酶反应缓冲液 2μl 

DEPC处理双蒸水      6μl 

                              

总体积              20μl 

置于37℃反应30min，然后加入2μl stop buffer，65℃温育10分钟失活DNase的活性。 

RQI DNA酶购自美国Promega公司，反应缓冲液为产品自带。 

-在上述样品中加入下列成分： 

上一步反应物                        22μl 

8个寡核苷酸的随机引物(100μmol/L)   0.5μl 

5×逆转录缓冲液                     6μl 

10mM dNTP mix(终浓度1mmol/L)        0.5μl 

M-MLV逆转录酶                       1μl 

                                             

总体积                              30μl 

在42℃反应1小时，然后在70℃加热10min，失活逆转录酶。 

M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司，5×逆转录缓冲液为产品自带；8个寡核苷酸的随机引物由美国Invitrogen公司(上海)合成；dNTP购自上海申能博彩生物科技有限公司。 

(4)荧光定量PCR检测H19 RNA的丰度 

用基因特异引物进行荧光定量PCR反应，体系如下： 

成分                    用量 

2×SYBR Green I混合物   10μl 

Plus solution           2μl 

上游引物(10μmol/L)     0.25μl 

下游引物(10μmol/L)     0.25μl 

模板cDNA                0.5μl 

PCR级别双蒸水           7μl 

                                  

总体积                  20μl 

反应条件为：95℃预变性2min，同时激活热启动TaqDNA聚合酶；95℃5sec，60℃20sec，40～50个循环，在60℃的退火/延伸时段采集荧光信号；溶解曲线分析(Melt curve analysis)，温度为50℃～99℃，检测产物的单一性(uniformity)。 

H19 RNA的定量PCR引物为：H19QF，GGAAATGAATATGCTGCACTTTACAACC；H19QR，GCTGCTGTTCCGATGGTGT；内参为β-actin mRNA，H19 RNA的丰度均一化到mock样品。内参β-actin mRNA的定量PCR引物为：ActQF，CGTGGACATCCGCAAAGAC；ActQR，TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。采用2^-ΔΔCt方法计算H19 RNA的丰度。 

2×SYBR Green I混合物和Plus solution购自日本Toyobo。 

结果如附图2所示，当sasRNA的长度大于27nt时，其基因沉默效果显著高于相应位点的siRNA。 

实施例3Northern blot检测35nt sasRNA对H19 RNA的基因沉默敲除效果(附图3) 

在本实施例中，我们选取35nt sasRNA作为单一研究对象做进一步检测。本实施例的部分步骤，包括35nt sasRNA和siRNA的合成与制备，转 染Hela细胞，提取总RNA等，与实施例1和实施例2的内容相同。下面主要叙述Northern blot的详细操作： 

(1)RNA专用甲醛变性电泳 

-按下述方法制备甲醛变性胶(25ml)： 

Agarose           0.3克 

TdH₂O             21.75ml 

煮沸溶解，室温冷至60℃时加入。 

10×MOPS          2.5ml 

37％甲醛          0.75ml 

混匀后倒胶。 

-按下述体系处RNA样品： 

RNA(5μg/μL)     1μL 

10×MOPS          1.25μL 

Formamide(甲酰胺) 6.25μL 

EB(0.5μg/μL)    0.5μL 

将上述成分混匀，65℃变性5分钟，立即冰浴，加2.5μL 6×溴酚兰上样缓冲液点样，100V，30min。 

(2)转移至尼龙膜 

先在电转仪上放置2层滤纸，再放上2层干净滤纸，事先将滤纸用0.5×TBE润湿。然后胶体在上尼龙膜在下放好，再依次覆盖润湿的新鲜滤纸，开始转膜，50min；电流的计算公式为0.8mA/cm²。 

(4)探针标记 

按下述体系配制探针标记反应： 

探针(0.2ug/ul)                2.5ul 

10XT4多核苷酸激酶反应缓冲液   1.5ul 

T4多核苷酸激酶(10U/ul)        1ul 

双蒸水                        15ul 

γ-³²PATP                     1ul 

                                        

总体积                        16ul 

37℃水浴30min，-20℃保存。 

-取1ul上述标记的探究与尼龙膜在5ml杂交液中孵育过夜，杂交液的配方为：杂交液(100ml) 

成分           终浓度        母液浓度        用量 

SSPE           5X            20X             25ml 

SDS            1％           10％            10ml 

Denhardt’s    5X            50X             10ml 

双蒸水                                       55ml 

                                                   

总体积                                       100ml 

-第二天将杂交液倒入专用的废液缸，用洗膜液将尼龙膜洗涤三次，洗膜液的配方为： 

洗膜液(500ml) 

          终浓度        母液浓度         用量 

SSPE      2X            20X              25ml 

SDS       0.1％         10％             1ml 

双蒸水                                   474ml 

                                                 

总体积                                   500ml 

-洗膜后，将尼龙膜晾干后放入磷屏夹中显影6h，在Typhoon扫描仪上读取信号并生成图像。 

H19 RNA的探针序列为：GCTGCTGTTCCGATGGTGT；内参β-actin(β-肌动蛋白)mRNA的杂交探针序列为：TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。 

由附图3可知，与同一位点的siRNA相比，35nt sasRNA能够更加有效地抑制H19 RNA的表达。 

实施例4低剂量的sasRNA可介导高效的基因沉默(附图4) 

在本实施例中，我们选取35nt sasRNA为研究对象，检测了它在不同浓度下对H19 RNA的基因沉默作用。同时，我们设置了21bp siRNA，siRNA的两条单链分子(分别为Guide和Passenger)，以及反义DNA作为对照分子。本实施例的部分步骤，包括总RNA的提取，逆转录合成cDNA，荧光定量PCR(包括所用基因特异引物)等，与实施例2的内容相同，在此不再赘述。 

(1)RNA与DNA的合成与制备及质量控制 

35nt sasRNA的序列为：HO-GGUGUCUUUGAUGUUGGGCUGAUGAGGUCUGGUUC-OH；对照siRNA的序列为：21bp siRNA，Guide：AUGGU GUCUU UGAUG UUGG dTdT，Pasenger：CCAAC AUCAA AGACA CCAU dTdT。由大连宝生物科技有限公司(Takara)合成，PAGE纯化，不带修饰。双链siRNA duplex由Guide和Passenger等摩尔退火形成。 

对照反义DNA的序列为asDNA，GGTGTCTTTGATGTTGGGCTGATGAGGTCTGGTTC。上海英骏生物科技有限公司合成，PAGE纯化。 

用DEPC处理水将上述寡核苷酸稀释，并用Nanovue微量分光光度计准确测定各溶液的浓度和纯度，调整为20μmol/L，1μmol/L，0.1μmol/L三种浓度的溶液，保存于-80℃。 

(2)转染Hela细胞 

采用反式转染法将五种不同的分子分别转染Hela细胞，具体步骤为：将生长状态旺盛的He la细胞用胰酶消化为单细胞悬液，红细胞计数板计数细胞，调整为4×10⁴cells/100μl。 

配制转染复合物，体系如下： 

将上述各成分混合，室温放置20分钟，形成转染复合物。 

将4×10⁴cells/100μl与上述转染复合物混合，滴于24孔板中，补加300μl完全培养基，置于37℃，5％CO₂的条件下培养。在转染48h后收集细胞用于后续检测。核酸的转染终浓度分别为80nmol/L，40nmol/L，20nmol/L，10nmol/L，1nmol/L，0.1nmol/L. 

收获细胞后经总RNA提取，cDNA合成，荧光定量PCR检测等步骤，检测H19RNA的表达水平。 

由附图4的结果可知，35nt sasRNA在低浓度条件下即可介导高效的基因沉默效应，显著高于相应位点其余四种分子的沉默效果。 

实施例5sasRNA可介导持久的基因沉默效应(附图5) 

在本实施例中，我们选取35nt sasRNA为研究对象，检测了它在40nmol/L的浓度下基因沉默效应的持久性。同时，我们设置了21bp siRNA，siRNA的两条单链分子(分别为Guide和Passenger)，以及反义DNA作为对照分子。本实施例的步骤，包括核酸的合成与制备及质量控制，转染Hela细胞，总RNA的提取，逆转录合成cDNA，荧光定量PCR(包括所用基因特异引物)等，与实施例1，实施例2和实施例4的内容相同，在此不再赘述。 

(1)不同时间点样品的收集 

40nmol/L终浓度的35nt sasRNA，35nt asDNA，21bp siRNA，21nt Guide和21nt Passenger转染He la细胞，分别在如下的时间点收集细胞：2h，3h，8h，12h，24h，48h，72h，96h，144h.收集的样品经总RNA提取，cDNA合成，荧光定量PCR检测等步骤，检测H19RNA的表达水平。 

由附图5的结果可知，35nt sasRNA对H19RNA的基因沉默效应可以持续至少6天的时间，远远高于相应位点其余四种分子的沉默效果。 

实施例635ntsasRNA和siRNA沉默H19RNA对Hela细胞周期的影响(附图6) 

在本实施例中，我们选取35nt sasRNA和siRNA作为研究对象，检测了它们在沉默H19 RNA表达之后对人宫颈癌Hela细胞周期的影响。本实施例的部分步骤，包括35nt sasRNA和siRNA的合成与制备，转染Hela细胞等，与实施例1和实施例2的内容相同。下面着重叙述细胞周期测定的详细步骤： 

(1)单细胞悬液的制备 

-24孔板的细胞用PBS洗涤一次，胰酶消化，将细胞充分吸打均匀，制成单细胞悬液。 

-转速1,500，5分钟，台式离心机室温下离心收集细胞； 

-去掉上清，加入70％乙醇(用PBS配制)，冰浴固定15分钟。 

-转速1,500，5分钟，台式离心机室温下离心收集细胞； 

-制备碘化丙啶(PI)染液，体系如下： 

核酸酶RNase A(10mg/ml)       2μL 

曲拉通Triton X-100(5％)      5μL 

碘化丙啶(PI，10mg/ml)        5μL 

PBS                          488μL 

                                    

总体积                       500μL 

-将细胞与碘化丙啶(PI)染液充分混匀，37℃温育40分钟，染色DNA的同时降 解RNA； 

-转速1,500，5分钟，台式离心机室温下离心收集细胞；500μL PBS重悬细胞。 

(2)流式分析 

-用滤膜将染色的细胞过滤之后注入专用的样品管中； 

-流式细胞仪检测，每个样品的进门细胞数以10⁴记。 

-Muticycle AV软件分析样品的细胞周期分布，计算出处于不同细胞周期时相的细胞数目和比例。 

核酸酶RNase A购自立陶宛Fermentas公司，曲拉通Triton X-100购自美国赛默-飞世尔公司，碘化丙啶(PI)购自上海申能博彩生物科技有限公司。 

由附图6的结果可知，因为sasRNA比siRNA沉默H19RNA的效果要好，因而造成了更大比例的Hela细胞阻滞于G2/M期，更为显著地减缓了肿瘤细胞的分裂速度。 

实施735ntsasRNA和siRNA沉默H19RNA对PC3细胞周期的影响(附图7) 

在本实施例中，我们选取35nt sasRNA和s iRNA作为研究对象，检测了它们在沉默H19RNA表达之后对人前列腺癌PC3细胞周期的影响。本实施例的操作步骤，包括包括35nt sasRNA和siRNA的合成与制备，转染PC3细胞，制备单细胞悬液，流式分析等，与实施例4的内容相同，故不再重复叙述。 

由附图7的结果可知，因为sasRNA沉默H19RNA的效应比siRNA显著，因而造成了更大比例的PC3细胞阻滞于G2/M期，更为显著地减缓了肿瘤细胞的分裂速度。 

实施例835nt sasRNA和siRNA不会激活干扰素系统基因的表达(附图8) 

在本实施例中，我们选取35nt sasRNA和siRNA作为研究对象，检测了将二者转染转染细胞之后，是否激活或促进了干扰素系统的表达。本实施例的部分步骤，包括35nt sasRNA和siRNA的合成与制备，转染Hela细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA等，与实施例1和实施例2的内容相同，下面着重叙述半定量PCR检测干扰素系统相关基因表达的操作步骤： 

(1)所检测的干扰素系统相关基因及其序列为： 

OAS1-F，TCTCAGAAATACCCCAGCCAA，OAS1-R，GAAGACAACCAGGTCAGCGTC； 

IFNG-F，AGATGTAGCGGATAATGGAACTCT，IFNG-R，TCTTCCTTG ATGGTCTCCACACTC； 

IFNK-F，CACCCTATCCCTGGACTGTAAC，IFNK-R，TGGGGCAACTCAAAAG CTATGT； 

ISG20-F，ACTGAAACAGGGTCGGGATG，ISG20-R，GCCGGATGAACTTGTCGTAC； 

IFNB1-F，CCAACAAGTGTCTCCTCCAAAT，IFNB1-R，AATCTCCTCAGGGATGTCAAAG。 

(2)完成cDNA的合成之后，配制下述PCR反应体系： 

10×PCR反应缓冲液         2μl 

dNTP(40mmol/L)            0.5μl 

Taq DNA聚合酶             0.2μl 

cDNA                      1μl 

上游引物(10μmol/L)       0.5μl 

下游引物(10μmol/L)       0.5μl 

PCR级别双蒸水             15.3μl 

                                   

总体积                    20μl 

置于PCR仪上94℃变性30sec，56℃引物退火30sec，72℃延伸30sec，反应30个循环。以2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增情况。 

由图8示结果可知sasRNA转染细胞后不会激活干扰素系统基因的过表达，不引起免疫副反应，说明sasRNA介导的H19 RNA的基因沉默是特异的。 

实施例935nt sasRNA在体内不会造成脱靶效应(附图9) 

在本实施例中，我们选取35nt sasRNA作为单一研究对象，检测其转染Hela细胞后是否导致脱靶效应。本实施例的部分步骤，包括35nt sasRNA和s iRNA的合成与制备，转染Hela细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA等，与实施例1和实施例2的内容相同，下面着重叙述半定量PCR检测部分同源基因表达水平的操作步骤： 

(1)人类基因组中有4个基因的mRNA序列与sasRNA存在不同程度的相似性。这些基因及其特异引物分别为：(方向均为5’-3’) 

KeratinF，GTGGCATTGGTGGTGGCATC，KeratinR，GGCTTTCAGCAAGTGGGCTC； 

USP9xF，CAAACAGATACAGCCCACCCT，USP9xR，TAGAGGGCCAAAGGTCAAATC； 

GAL10F，CAGTGGAGAAAAGAACCCGACG，GAL10R，GCTGGTGGAAGCCATAGATTG； 

ZNF420F，CTCAGGAAGAGTGGGAATGCC，ZNF420R，TGCTTCTCCATCTTGCCTTTG。 

内参为β-actin mRNA，其特异引物为： 

ActF：CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT，ActR：TGGAAGGTGGACAGCGAGGC 

H19 RNA的特异引物为： 

H19F：ACTCAGGAATCGGCTCTGGAA，H19R：ATGATGTGGTGGCTGGTGGTC3 

(2)完成cDNA的合成之后，配制下述PCR反应体系： 

10×PCR反应缓冲液      2μl 

dNTP(40mmol/L)         0.5μl 

Taq DNA聚合酶          0.2μl 

cDNA                   1μl 

上游引物(10μmol/L)    0.5μl 

下游引物(10μmol/L)    0.5μl 

PCR级别双蒸水          15.3μl 

                                

总体积                 20μl 

置于PCR仪上94℃变性30sec，56℃引物退火30sec，72℃延伸30sec，反应30个循环。以2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增情况。 

由图9示结果可知sasRNA对这四个基因的表达水平免疫影响，说明sasRNA不会造成脱靶效应。 

SEQUENCELISTING

 

<110> 武汉大学

 

<120> 一种靶向沉默非编码癌基因

 

<130> 

 

<160> 31   

 

<170> PatentInversion3.3

 

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

 

<400> 1

uuugauguugggcugaugagguc                                            23

 

 

<210> 2

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

 

<400> 2

ucuuugauguugggcugaugaggucug                                        27

 

 

<210> 3

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<212> RNA

<213> 人工序列

 

<400> 3

ugucuuugauguugggcugaugaggucuggu                                   31

 

 

<210> 4

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<212> RNA

<213> 人工序列

 

<400> 4

ggugucuuugauguugggcugaugaggucugguuc                               35

 

 

<210> 5

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<212> RNA

<213> 人工序列

 

<400> 5

auggugucuuugauguugggcugaugaggucugguuccu                           39

 

 

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 6

ggaaatgaatatgctgcactttacaacc                                       28

 

 

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

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gctgctgttccgatggtgt                                                 19

 

 

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 8

cgtggacatccgcaaagac                                                 19

 

 

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 9

tggaaggtggacagcgaggc                                                20

 

 

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

<400> 10

gctgctgttccgatggtgt                                                 19

 

 

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

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tggaaggtggacagcgaggc                                                20

 

 

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

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tctcagaaataccccagccaa                                              21

 

 

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

 

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<213> 人工序列

 

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<212> DNA

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<212> DNA

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<213> 人工序列

 

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<210> 30

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<212> DNA

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<400> 30

auggugucuuugauguuggdtdt                                            23

 

 

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<213> 人工序列

 

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ccaacaucaaagacaccaudtdt                                            23