一种制备绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法

摘要

本发明公开了一种制备绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法。该方法选取乙酸-乙酸钠缓冲溶液低温浸提麦曲中微生物胞外酶，通过使用含有二硫苏糖醇和三氯乙酸的预冷丙酮溶液Ⅰ沉淀蛋白并用含有二硫苏糖醇的预冷丙酮溶液漂洗沉淀，最后加入裂解液制备出适合双向电泳的高质量样品。本发明制备绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备绍兴黄酒成品麦曲中包含各种微生物胞外酶蛋白的方法，特别涉及一种制备绍兴黄酒成品麦曲中包含各种微生物胞外酶蛋白双向电泳样品的方法。

背景技术

黄酒是世界三大酿造酒之一。“以麦制曲，用曲酿酒”是中国黄酒的特色，传统的麦曲生产是以破碎后的小麦为原料，采用天然富集、自然培育微生物的方法制备而来。麦曲在黄酒酿造中具有极其重要的地位，被喻为“酒之骨”，它不但是黄酒酿造的“粗酶制剂”，而且麦曲内蓄积了多种微生物的代谢产物，赋予了黄酒独特的风味。研究表明，麦曲中微生物的胞外酶主要是来源于各种霉菌和细菌分泌的各类水解酶系，包括淀粉酶系、蛋白酶系、纤维素酶系、半纤维素酶系、脂肪酶系等等。这些复合酶系共同作用将麦曲中的各种大分子物质(淀粉、蛋白质、脂肪等)分解为小分子物质，以便微生物的生长、繁殖、产酶、产酒。

目前国内直接针对黄酒麦曲中微生物胞外酶的研究开展得较少，且主要是利用色谱技术对麦曲中单一酶类进行纯化及开展酶学性质研究，通过类似方法无法达到全面获取麦曲中微生物胞外酶组成，并确定其微生物来源的目的。宏蛋白质组学是最近几年被提出的新概念，其定义是指对某一特定环境中微生物群落的所有蛋白质进行大规模的分析和鉴定。宏蛋白质组的研究策略与经典的蛋白质组研究策略相似，主要包括环境总蛋白的提取制备、蛋白质分离以及质谱鉴定和数据比对3个步骤。应用宏蛋白质组学理论和思想，利用双向电泳技术对从绍兴黄酒成品麦曲中浸提出的所有可溶性蛋白(主要是各种微生物分泌的胞外酶蛋白)进行高分辨率分离，能为后续通过质谱分析手段大规模鉴定麦曲中的微生物胞外酶，并进一步弄清其微生物来源奠定基础。

选择合适的样品制备方法是双向电泳成功的关键因素之一，制备方法选择不当，会造成大量盐离子和其它干扰物质残留，严重影响等电聚焦，从而影响双向电泳的效果。麦曲中的各种微生物分泌所产的胞外酶必须尽可能从固态麦曲中利用适当的缓冲体系浸提制备出来，同时还要去除多糖、脂类、核酸等干扰双向电泳的杂质，并需尽量避免目标蛋白样品的降解。迄今为止，还没有制备绍兴黄酒成品麦曲微生物胞外酶双向电泳样品的有效方法和技术，从而导致利用蛋白组学技术进行黄酒麦曲微生物胞外酶的相关研究一直停滞不前。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备较高质量的绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法。

本发明所提供的制备绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法，包括以下步骤：

1)称取一定质量的绍兴黄酒成品麦曲，加入适当体积浓度为0.09-0.15mol/L，pH3.8-5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，同时加入1片蛋白酶抑制剂混合片(Roche，complete^TM)，在4℃条件下浸提4-12h；然后依次用4层纱布和滤纸过滤，得滤液。利用冷冻高速离心机使滤液在4℃，10000r/min条件下离心30min，收集上清液；

2)向步骤1)得到的粗酶提取液中加入4-6倍体积预冷的丙酮溶液Ⅰ(其中含0.01-0.03mol/L的二硫苏糖醇，0.05-0.2g/mL的三氯乙酸)，混匀，-20℃放置1h；低温高速离心收集沉淀，向沉淀中加入2mL预冷的丙酮溶液Ⅱ(其中含0.01-0.03mol/L的二硫苏糖醇)，清洗沉淀，-20℃放置1h；低温高速离心收集沉淀，采用预冷的丙酮溶液Ⅱ重复清洗沉淀一次；用保鲜膜封盖装有蛋白沉淀的离心管管口，-20℃挥发残留丙酮。

3)将步骤2)中制得的蛋白沉淀加入适量的样品裂解液(其中含6-8mol/L尿素、0.02g/mL的CHAPS、体积百分含量为0.5-2％的IPG缓冲液、0.002g/mL的溴酚蓝)，室温下充分溶解，离心取上清液，此上清液即为绍兴黄酒成品麦曲微生物胞外酶双向电泳样品；所述裂解液组成为样品裂解液为8mol/L尿素、0.02g/mL的CHAPS、体积百分含量为0.5％的IPG缓冲液、0.002g/mL的溴酚蓝。

所述步骤1)中绍兴黄酒成品麦曲用量为20g-30g/50mL，优选为25g/50mL。

所述步骤1)乙酸-乙酸钠缓冲溶液为pH5.0，浓度为0.09mol/L。

所述步骤1)中在4℃条件下浸提麦曲12h。

所述步骤2)中，所述丙酮溶液Ⅰ为4倍体积。

所述丙酮溶液Ⅰ中含0.02mol/L的二硫苏糖醇，0.1g/mL的三氯乙酸。

所述步骤2)丙酮溶液Ⅱ中含0.02mol/L的二硫苏糖醇。

所述步骤3)中，制得的蛋白沉淀与样品裂解液的质量体积比为100mg/400μL-150mg/400μL，优选为150mg/400μL。

所述绍兴黄酒成品麦曲为绍兴黄酒成品机制曲、脚踏曲或熟曲。

所述绍兴黄酒成品麦曲为绍兴黄酒成品机制曲。

为了使样品中残留的丙酮既能完全挥发，又不影响样品的制备质量，所述步骤2)中最后用保鲜膜封盖装有蛋白沉淀的离心管管口，置于-20℃环境的优选时间为48h。

发明人通过长时间的科学研究，发现具有较低离子强度的弱酸性缓冲液提取绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶总蛋白，能最大限度地提取出含有目标蛋白的样品。采用三氯乙酸-丙酮法沉淀蛋白质，可以有效地去除盐离子、多糖、脂类、核酸等干扰电泳效果的物质。另外，本研究在提取蛋白的过程中，增加了丙酮清洗的次数，从而能够更彻底地去除上述杂质。使用的样品裂解液中，尿素作为变性剂能破坏蛋白质的高级结构，打断非共价连接。CHAPS是一种兼性去污剂，它能打断蛋白质分子或亚基间的疏水作用，增加蛋白质的溶解性。加入二硫苏糖醇是为了打断二硫键，并使所有蛋白质处于还原状态。IPG缓冲液能通过电荷与电荷之间的反应减少蛋白质结合，从而增加蛋白质的可溶性。

本发明制备绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。

附图说明

图1为绍兴黄酒成品机制麦曲微生物胞外酶的双向电泳图谱

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1

1、样品制备

1)称取25g浙江绍兴市某黄酒厂成品机制麦曲，加入50mL浓度为0.09mol/L，pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，同时加入1片蛋白酶抑制剂混合片，在4℃条件下浸提12h。然后依次用4层纱布和滤纸过滤，得滤液。利用冷冻高速离心机使滤液在4℃，10000r/min条件下离心30min，收集上清液，此上清液为粗酶提取液。

2)在步骤1)得到的粗酶提取液中加入4倍体积预冷的丙酮溶液Ⅰ(其中含20mmol/L的二硫苏糖醇，0.1g/mL的三氯乙酸)，颠倒数次混匀后，-20℃放置1h用以沉淀蛋白；接着4℃，12000r/min离心30min，弃去上清，收集沉淀。在收集的沉淀中加入2mL预冷的丙酮溶液Ⅱ(其中含20mmol/L的二硫苏糖醇)，轻轻摇晃，用以清洗沉淀，-20℃放置1h，接着4℃，12000r/min离心15min。接着再利用预冷的丙酮溶液Ⅱ，采用相同步骤重复清洗沉淀一次，最后用保鲜膜封盖装有沉淀的离心管管口，置于-20℃环境48h，使沉淀中残留的丙酮完全挥发。

3)将步骤2)中制得的蛋白质沉淀加入300μL的样品裂解液(其中含8mol/L尿素，0.02g/mL的CHAPS，体积百分含量为0.5％的IPG缓冲液，0.002g/mL的溴酚蓝)，室温下充分溶解，然后12000r/min离心10min，取上清液，此上清液即为绍兴黄酒成品麦曲微生物胞外酶双向电泳样品。

2、电泳检测

1)按照《双向电泳操作手册》进行水化上样和等电聚焦。在Immobiline干胶条再泡胀盘中加入含100μg蛋白的样品液，将IPG干胶条(7cm，pH3-10)水平放入其中，加入少量IPG覆盖液，水化过夜。水化过夜后的胶条转移到Ettan IPGphor胶条槽中，进行等电聚焦。等电聚焦程序设置为：①Step，300V×2h；②Gradient，1000V×0.5h；③Gradient，5000V×1.5h；④Step，5000V，2500vh。

2)等电聚焦结束后，立即进行平衡。采用两步平衡法，先将IPG胶条放入3mL平衡液Ⅰ中，在水平摇床上平衡15min；再使用平衡液Ⅱ进行第二步平衡，在摇床上平衡15min。

平衡液Ⅰ配方：尿素72.07g，SDS 4.0g，1.5M Tris-HCl 6.7mL(pH8.8)，甘油69mL，1％溴酚蓝贮存液400μL，加入双蒸水至200mL，使用前每10mL加入DTT 100mg。

平衡液Ⅱ配方：尿素72.07g，SDS 4.0g，1.5M Tris-HCl 6.7mL(pH8.8)，甘油69mL，1％溴酚蓝贮存液400μL，加入双蒸水至200mL，使用前每10mL加入IAA 250mg。

3)平衡后进行第二向SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12.5％(10cm×7cm×1mm)。将平衡后的IPG胶条转移到已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面顶端，排除胶条与胶面之间的气泡。以恒流方式进行电泳：先10mA电泳10min，然后电流调至20mA。当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。

4)采用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色。

5)利用捷达JD-801凝胶电泳图像分析系统对脱色后的双向电泳凝胶进行扫描、拍照。

双向电泳结果如图1所示，结果表明该绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶样品的制备和分离效果较好，最终得到了分辨率较高，重复性较好的双向电泳图谱(图1)。

实施例2

1)称取30g浙江绍兴市某黄酒厂成品机制麦曲，加入50mL浓度为0.15mol/L，pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，同时加入1片蛋白酶抑制剂混合片，在4℃条件下浸提4h。然后依次用4层纱布和滤纸过滤，得滤液。利用冷冻高速离心机使滤液在4℃，10000r/min条件下离心30min，收集上清液，此上清液为粗酶提取液。

2)在步骤1)得到的粗酶提取液中加入6倍体积预冷的丙酮溶液Ⅰ(其中含10mmol/L的二硫苏糖醇，0.2g/mL的三氯乙酸)，颠倒数次混匀后，-20℃放置1h用以沉淀蛋白；接着4℃，12000r/min离心30min，弃去上清，收集沉淀。在收集的沉淀中加入2mL预冷的丙酮溶液Ⅱ(其中含30mmol/L的二硫苏糖醇)，轻轻摇晃，用以清洗沉淀，-20℃放置1h，接着4℃，12000r/min离心15min。接着再利用预冷的丙酮溶液Ⅱ，采用相同步骤重复清洗沉淀一次，最后用保鲜膜封盖装有沉淀的离心管管口，置于-20℃环境48h，使沉淀中残留的丙酮完全挥发。

3)按100mg/400mL的比例向步骤2)中制得的蛋白质沉淀加入裂解液(其中含8mol/L尿素，0.02g/mL的CHAPS，体积百分含量为0.5％的IPG缓冲液，0.002g/mL的溴酚蓝)，室温下充分溶解，然后12000r/min离心10min，取上清液，此上清液即为绍兴黄酒成品麦曲微生物胞外酶双向电泳样品。

2、电泳检测

1)按照《双向电泳操作手册》进行水化上样和等电聚焦。在Immobiline干胶条再泡胀盘中加入含100μg蛋白的样品液，将IPG干胶条(7cm，pH3-10)水平放入其中，加入少量IPG覆盖液，水化过夜。水化过夜后的胶条转移到Ettan IPGphor胶条槽中，进行等电聚焦。等电聚焦程序设置为：①Step，300V×2h；②Gradient，1000V×0.5h；③Gradient，5000V×1.5h；④Step，5000V，2500vh。

2)等电聚焦结束后，立即进行平衡。采用两步平衡法，先将IPG胶条放入3mL平衡液Ⅰ中，在水平摇床上平衡15min；再使用平衡液Ⅱ进行第二步平衡，在摇床上平衡15min。

平衡液Ⅰ配方：尿素72.07g，SDS 4.0g，1.5M Tris-HCl 6.7mL(pH8.8)，甘油69mL，1％溴酚蓝贮存液400μL，加入双蒸水至200mL，使用前每10mL加入DTT 100mg。

平衡液Ⅱ配方：尿素72.07g，SDS 4.0g，1.5M Tris-HCl 6.7mL(pH8.8)，甘油69mL，1％溴酚蓝贮存液400μL，加入双蒸水至200mL，使用前每10mL加入IAA 250mg。

3)平衡后进行第二向SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12.5％(10cm×7cm×1mm)。将平衡后的IPG胶条转移到已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面顶端，排除胶条与胶面之间的气泡。以恒流方式进行电泳：先10mA电泳10min，然后电流调至20mA。当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。

4)采用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色。

5)利用捷达JD-801凝胶电泳图像分析系统对脱色后的双向电泳凝胶进行扫描、拍照。

结果表明该绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶样品的制备和分离效果较好，双向电泳结果与图1高度相似。

实施例3

1)称取20g浙江绍兴市某黄酒厂成品机制麦曲，加入50mL浓度为0.10mol/L，pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，同时加入1片蛋白酶抑制剂混合片，在4℃条件下浸提10h。然后依次用4层纱布和滤纸过滤，得滤液。利用冷冻高速离心机使滤液在4℃，10000r/min条件下离心30min，收集上清液，此上清液为粗酶提取液。

2)在步骤1)得到的粗酶提取液中加入4倍体积预冷的丙酮溶液Ⅰ(其中含30mmol/L的二硫苏糖醇，0.15g/mL的三氯乙酸)，颠倒数次混匀后，-20℃放置1h用以沉淀蛋白；接着4℃，12000r/min离心30min，弃去上清，收集沉淀。在收集的沉淀中加入2mL预冷的丙酮溶液Ⅱ(其中含30mmol/L的二硫苏糖醇)，轻轻摇晃，用以清洗沉淀，-20℃放置1h，接着4℃，12000r/min离心15min。接着再利用预冷的丙酮溶液Ⅱ，采用相同步骤重复清洗沉淀一次，最后用保鲜膜封盖装有沉淀的离心管管口，置于-20℃环境48h，使沉淀中残留的丙酮完全挥发。

3)按140mg/400mL的比例向步骤2)中制得的蛋白质沉淀加入裂解液(其中含8mol/L尿素，0.02g/mL的CHAPS，体积百分含量为0.5％的IPG缓冲液，0.002g/mL的溴酚蓝)，室温下充分溶解，然后12000r/min离心10min，取上清液，此上清液即为绍兴黄酒成品麦曲微生物胞外酶双向电泳样品。

2、电泳检测

1)按照《双向电泳操作手册》进行水化上样和等电聚焦。在Immobiline干胶条再泡胀盘中加入含100μg蛋白的样品液，将IPG干胶条(7cm，pH3-10)水平放入其中，加入少量IPG覆盖液，水化过夜。水化过夜后的胶条转移到Ettan IPGphor胶条槽中，进行等电聚焦。等电聚焦程序设置为：①Step，300V×2h；②Gradient，1000V×0.5h；③Gradient，5000V×1.5h；④Step，5000V，2500vh。

2)等电聚焦结束后，立即进行平衡。采用两步平衡法，先将IPG胶条放入3mL平衡液Ⅰ中，在水平摇床上平衡15min；再使用平衡液Ⅱ进行第二步平衡，在摇床上平衡15min。

平衡液Ⅰ配方：尿素72.07g，SDS 4.0g，1.5M Tris-HCl 6.7mL(pH8.8)，甘油69mL，1％溴酚蓝贮存液400μL，加入双蒸水至200mL，使用前每10mL加入DTT 100mg。

平衡液Ⅱ配方：尿素72.07g，SDS 4.0g，1.5M Tris-HCl 6.7mL(pH8.8)，甘油69mL，1％溴酚蓝贮存液400μL，加入双蒸水至200mL，使用前每10mL加入IAA 250mg。

3)平衡后进行第二向SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12.5％(10cm×7cm×1mm)。将平衡后的IPG胶条转移到已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面顶端，排除胶条与胶面之间的气泡。以恒流方式进行电泳：先10mA电泳10min，然后电流调至20mA。当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。

4)采用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色。

5)利用捷达JD-801凝胶电泳图像分析系统对脱色后的双向电泳凝胶进行扫描、拍照。

双向电泳结果如图1所示，结果表明该绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶样品的制备和分离效果较好，最终得到了分辨率较高，重复性较好的双向电泳图谱。

结果表明该绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶样品的制备和分离效果较好，双向电泳结果与图1高度相似。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。