用标记探针进行检测和熔解曲线分析的方法

摘要

本发明涉及一种用标记探针进行检测和熔解曲线分析的方法及包括此探针的试剂盒，属于生物技术领域。本发明的方法在扩增体系中包括热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶、设计标记的寡核苷酸探针及其余扩增体系常用组分，其中标记的探针包括报告标记和猝灭标记；由于上述DNA聚合酶的使用，探针不会被水解，因此可以将探针设计成比较长的长度，从而覆盖包括多个突变核苷酸靶序列的较大区域，有利于克服现有技术中标记探针较短的缺陷。本发明的方法及试剂盒可以简便的实现对靶序列进行检测和熔解曲线分析，可以节省成本，并测定含有多种突变的靶序列。

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用标记探针进行核酸检测和熔解曲线分析的技术领域，特别是涉及采用双标记寡核苷酸探针对含有至少一个突变核苷酸的靶核酸序列进行分析的方法。

背景技术

Real-time PCR可以用来检测和定量靶核酸序列。如今许多以探针为基础的方法应用于real-time PCR中，例如TaqMan探针(U.S.Pat.Nos.5,210,015 and 5,487,972)，分子信标探针(molecularbeacons，U.S.Pat.Nos.5,925,517 and 6,103,476)，自我检测扩增子(self-probing amplicons)，也称scorpions(U.S.Pat.No.6,326,145)，Amplifluor(Chen et al.，Appl.Environ.Microbiol.64：4210-6，1998)，Amplifluor(U.S.Pat.No.6,117,635)，置换杂交探针(Li et al.，Nucleic Acids Res.30：E5，2002)，DzyNA-PCR(Todd et al.，Clin.Chem.46：625-30，2000)，荧光限制性内切酶检测(Cairns et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.318：684-90，2004)，相邻杂交探针(U.S.Pat.No.6,174,670和Wittwer et al.，Biotechniques 22：130-1，134-8，1997)等。总而言之，荧光标记的探针提高了靶序列定量的特异性。

关于基因型多态性和稀有突变的检测已经申请了很多专利。突变的检测对于病理性突变的早期诊断是非常重要的，尤其是对于癌症和耐药的突变检测更为重要。近年来报到了很多检测突变的方法，期间基于real-time PCR技术鉴别等位基因的方法也得到了发展，两种主要的技术已被广泛应用。其中一种主要技术为，荧光信号是在每个PCR循环的结束时通过探针的杂交或水解产生的，例如TaqMan探针和分子信标探针技术。荧光检测一定是在PCR过程中或结束时。这些技术由于等位基因的特异性而需要使用两条探针，其中一条探针对应第一个等位基因，另外一条探针对应第二个等位基因。另外一种主要技术为，通过熔解曲线分析来检测突变，同样通常需要两条探针进行熔解曲线分析，例如邻近杂交探针。近年来，出现了一种单标记探针(U.S.Pat.No.6,635,427)。较高的荧光背景和对序列特异核苷酸的依赖让单标记探针具有一定的局限性。基于双标记TaqMan探针的熔解曲线分析方法也有报道(Housni et al.，2003)。然而，这个报道中的标记TaqMan探针的检测方法也有其局限性。首先，它使用了具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶，为了防止发生常规TaqManreal-time PCR延伸步骤中探针的水解，所选探针的熔解温度(Tm值)要比PCR引物的Tm值低10℃，由于探针的Tm值较低，因此探针的杂交效率也较低，而造成最终的荧光检测信号也比较弱，探针的Tm值较低也就意味着探针较短，这就使得探针没有办法覆盖到靶序列较长的距离，这对于检测一个基因核心区域的一连串突变是很不利的，例如TB耐药中RpoB基因的核心区域；其次，以TaqMan探针为基础的熔解曲线分析一般不适用于长探针，由于报告标记和猝灭标记被长距离的核苷酸所隔离，而使报告标记和猝灭标记无法相互作用。对于一个长的TaqMan探针，很难检测到探针杂交状态和处于单链状态时荧光强度的差异。在现有的技术方法中，TaqMan real-time PCR方法可以在每个循环实时检测荧光信号，但通常不能进行熔解曲线分析。Housni等报道的改进后的基于TaqMan的方法，当探针遇到合适的条件时能够进行熔解曲线分析，但不能在每个循环实时检测荧光信号。基于分子信探针的方法可以在每个循环实时检测荧光信号，但不能对探针与靶序列杂交的混合物进行熔解曲线分析。邻近杂交探针可以进行实时检测和熔解曲线分析，但同时需要两条探针，一条探针用于锚定，另外一条探针用于报告。

这就需要一种改进的探针用于实时监测PCR反应和/或进行熔解曲线分析，同时也需要一种可以覆盖包含多个突变位点的靶序列较大区域的探针。

发明内容

本发明的目的是提供一种用标记探针进行检测和熔解曲线分析的方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

首先，提供一种从样本中检测靶核酸序列的方法，包括：

在一个扩增体系中扩增靶序列，所述扩增体系包括至少一条标记的寡核苷酸探针，一对扩增引物和一个热稳定的DNA聚合酶，优选是不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶；

在扩增期间，在每个循环实时检测依赖于杂交的荧光发射信号；

在标记的寡核苷酸探针与扩增的靶核酸杂交形成的熔解曲线分析中，产生一个熔解谱；

所述寡核苷酸探针包括一个报告标记和一个猝灭标记，当标记的寡核苷酸探针处于未与靶序列杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光；当所述标记的寡核苷酸探针与靶序列杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此寡核苷酸探针未与靶序列杂交而处于单链状态时的荧光强度；

所述扩增是不对称扩增，扩增中一条引物的浓度高于另外一条与之配对引物的浓度；

其中，所述标记的寡核苷酸探针的熔解温度(Tm)高于扩增引物的熔解温度(Tm)值；

其中，所述猝灭标记是非荧光猝灭基团。

所述的“寡核苷酸”是指天然的或经过修饰的单体或聚合物的线性寡聚物，它包括脱氧核苷、核糖核苷、蛋白核酸核苷和通过碱基配对的相互作用与目标多核苷酸特异结合的能力。

扩增优选为热循环反应，或者也可以是等温扩增。

优选通过PCR扩增。在不对称PCR扩增期间，检测依赖于杂交的荧光发射信号，其中一对PCR引物的比例为不超过1∶2，或者不超过1∶3，或者不超过1∶4，或者不超过1∶5，最佳的PCR引物比例取决于具体的实验。

虽然本发明可选用任何DNA聚合酶，但优选是热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，再优选是经过修饰的、不具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶，在反应过程中，探针不会被经过修饰的Taq聚合酶所水解。本发明发现，采用经过修饰的、不具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶会得到比采用具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶更好的结果。

由于探针不会被水解，所以可以设计成所需要的长度。在本发明中，可以使用一个具有高Tm值的长探针。通常探针的Tm值高于引物的退火温度0～20℃。引物的退火温度可以与引物的Tm值相同，或者低于引物的Tm值～5℃。设计探针的Tm值可以比延伸温度还高，例如72℃或者更高。在反应中，采用具有链置换活性的聚合酶效果会更好。

寡核苷酸探针3’末端或5’末端的猝灭标记优选用非荧光猝灭基团，其报告标记优选用荧光基团标记，报告标记可以标记在寡核苷酸探针内部的一个核苷酸残基上，也可以标记在寡核苷酸探针5’末端或3’末端。

报告标记优选是荧光基团，其可以是荧光素、荧光素衍生物、蓝色素、荧光素-蓝色素复合物等。

所述的“荧光基团”是指在一个确定的激发波长下吸收光能，在另一个确定的不同波长下发射光能的部分。例如荧光基团包括，也不仅限于此：Alexa Fluor dyes(Alexa Fluor 350，Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 532，Alexa Fluor 546，Alexa Fluor 568，Alexa Fluor594，Alexa Fluor 633，Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680)，AMCA，AMCA-S，BODIPY染料(BODIPY FL，BODIPY R6G，BODIPY TMR，BODIPYTR，BODIPY 530/550，BODIPY 558/568，BODIPY 564/570，BODIPY576/589，BODIPY 581/591，BODIPY 630/650，BODIPY 650/665)，Carboxyrhodamine 6G，carboxy-X-rhodamine(ROX)，Cascade Blue，Cascade Yellow，Cyanine染料(Cy3，Cy5，Cy3.5，Cy5.5)，Dansyl，Dapoxyl，Dialkylaminocoumarin，4′，5′-Dichloro-2′，7′-dimethoxy-fluorescein，DM-NERF，Eosin，Erythrosin，Fluorescein，FAM，Hydroxycoumarin，IRDyes(IRD40，IRD 700，IRD 800)，JOE，Lissamine rhodamine B，Marina Blue，Methoxycoumarin，Naphthofluorescein，Oregon Green 488，OregonGreen 500，Oregon Green 514，Pacific Blue，PyMPO，Pyrene，Rhodamine 6G，Rhodamine Green，Rhodamine Red，Rhodol Green，2′，4′，5′，7′-Tetra-bromosulfone-fluorescein，Tetramethyl-rhodamine(TMR)，Carboxytetramethylrhodamine(TAMRA)，Texas Red and Texas Red-X。

所述的“猝灭基团”与荧光基团之间距离足够近时，能够吸收或消散激发的荧光基团的能量。猝灭基团可以是荧光的猝灭基团，也可以是非荧光的猝灭基团。上面所列的荧光基团如果与另外一个荧光基团邻近，也可以扮演一个猝灭基团的角色，此时发生FRET猝灭或者接触猝灭。优选选择不发出任何可见光的非荧光猝灭基团。非荧光猝灭标记包括如下，也不仅限于此：DABCYL(4-(4′-dimethylaminophenylazo)benzoicacid)succinimidyl ester，diarylrhodamine carboxylic acid，succinimidyl ester(QSY-7)和4′，5′-dinitrofluorescein carboxylic acid，succinirnidylester(QSY-33)，quencherl，或“Black hole quenchers”(BHQ-1，BHQ-2和BHQ-3)，Iowa Black FQ，Deep Dark Quencher，Eclipse DarkQuencher核苷酸类似物，核苷酸G残基，纳米粒子和金微粒。

寡核苷酸探针可以包括超过15个核苷酸，或者超过20个核苷酸，或者超过25个核苷酸，或者超过30个核苷酸。设计较长的探针是比较有利的，因为它可以覆盖包括多个突变核苷酸靶序列的较大区域。

报告标记和猝灭标记可以位于35个核苷酸以内，也可以位于25个核苷酸以内。换言之，报告标记和猝灭标记之间可以间隔不超过35个核苷酸，或者不超过25个核苷酸，或者不超过20个核苷酸，或者不超过18个核苷酸，或者不超过15个核苷酸，或者不超过14个核苷酸，但是优选要超过8个核苷酸。因此，报告标记和猝灭标记之间的距离可以是8到35个核苷酸，也可以是8到20个核苷酸，也可以是9到18个核苷酸，也可以是10到17个核苷酸，也可以是10到16个核苷酸，也可以是10到15个核苷酸，也可以是10到14个核苷酸。

例如，一个寡核苷酸探针5’末端标记FAM，3’末端标记BHQ1，当探针与靶核酸序列杂交时，FAM的荧光强度至少超过探针单链状态时FAM荧光强度1.5倍。

例如，一个寡核苷酸探针5’末端标记Texas Red，3’末端标记BHQ2，当探针与靶核酸序列杂交时，Texas Red的荧光强度至少超过探针单链状态时Texas Red荧光强度3倍。

例如，一个寡核苷酸探针内部核苷酸上标记FAM，3’末端标记BHQ1，当探针与靶核酸序列杂交时，FAM的荧光强度至少超过探针单链状态时FAM荧光强度1倍。

在标记寡核苷酸的熔解曲线分析中，产生熔解谱的步骤还包括，当探针与靶核酸序列分离时，确定扩增产物荧光强度变化负一次导数(-df/dT)最大值的步骤。

“熔解谱”是指寡(或多)核苷酸与其互补序列测量值的采集，它所表示的是寡(或多)核苷酸由双链成为单链的分子转变(或者相反过程)。核酸由双链成为单链的转变在学术术语中通常描述为核酸分子的“熔解”，这种转变也可以描述成为核酸的“变性”或“解离”。因此，本发明中的熔解谱也可以称为“解离谱”、“变性谱”、“熔解曲线”、“解离曲线”、“杂交/解离谱”等等。

靶核酸序列与探针杂交区域至少要包含一个突变核苷酸、单核苷酸多态性(SNP)、缺失或插入，或包含两个甚至更多的突变核苷酸、单核苷酸多态性(SNP)、缺失或插入。探针与靶核酸序列杂交区域可以包含两个或更多的耐药突变核苷酸。

其次，本发明涉及一个能够实时监测PCR反应和/或进行熔解曲线分析的标记的寡核苷酸探针，所述的“寡核苷酸”包括：

所述的寡核苷酸探针包括一个报告标记和一个猝灭标记，当标记的寡核苷酸探针处于未与靶序列杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光。

所述的寡核苷酸探针与靶序列杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此寡核苷酸探针未与靶序列杂交而处于单链状态时的荧光强度。

其中，所述猝灭标记是非荧光猝灭基团。

所述的猝灭标记是非荧光猝灭基团，它标记在寡核苷酸探针的3’末端。

所述的报告标记是荧光基团，它标记在寡核苷酸探针的内部核苷酸残基上或5‘末端。

所述的寡核苷酸探针包括至少25个核苷酸，或者至少30个核苷酸。

所述的报告标记和猝灭标记之间间隔不超过25个核苷酸，或者不超过18个核苷酸，或者不超过15个核苷酸。

所述的报告标记和猝灭标记之间的距离可以是8到20个核苷酸，也可以是9到18个核苷酸，也可以是10到17个核苷酸，也可以是10到16个核苷酸，也可以是10到15个核苷酸，也可以是10到14个核苷酸。

所述标记的寡核苷酸探针与热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶配合使用。

在已完成靶核酸序列扩增后核酸序列的检测和分析中，也可以使用本发明中的探针；或者也可以用在目标扩增的独立终点检测试验中。双标记的寡核苷酸探针通常杂交在扩增靶序列所用引物对之间的位置。

在每个循环都实时检测荧光信号的实验系统中，可以在扩增期间进行分析。当然，也可以通过扩增结束后的熔解曲线分析，来研究靶核酸序列。探针可以是荧光标记的，也可以是非荧光标记的，例如生物素。

再次，本发明涉及一个从样本中检测靶核酸序列的试剂盒，包括：

①至少有一条标记的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括一个报告标记和一个猝灭标记，当标记的寡核苷酸探针处于未与靶序列杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光；当标记的寡核苷酸探针与靶序列杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此寡核苷酸探针未与靶序列杂交而处于单链状态时的荧光强度；

其中，所述标记寡核苷酸探针的熔解温度(Tm)高于扩增引物的熔解温度(Tm)值；

其中，所述猝灭标记是非荧光猝灭基团，它标记在寡核苷酸探针的3’末端；

所述报告标记是荧光基团，它标记在寡核苷酸探针的内部核苷酸残基上或5’末端；

②热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶及核酸序列扩增所需其余常用各组分。

寡核苷酸探针可以包括超过25个核苷酸，或者超过30个核苷酸。报告标记和猝灭标记之间间隔不超过25个核苷酸，或者不超过18个核苷酸，或者不超过15个核苷酸。报告标记和猝灭标记之间的距离可以是8到20个核苷酸，也可以是9到18个核苷酸，也可以是10到17个核苷酸，也可以是10到16个核苷酸，也可以是10到15个核苷酸。

另外，本发明涉及到一种检测耐药结核分枝杆菌的方法，包括：

在一个扩增反应中扩增基因组区域，其中，这里提到的基因组区域中的突变引起了结核分枝杆菌的耐药。这里提到的扩增体系包括至少一条标记的寡核苷酸探针，至少一对扩增引物(正向引物和反向引物)和一个热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。

标记的寡核苷酸探针与扩增的基因组区域杂交形成的熔解曲线分析中产生一个熔解谱。

这里提到的寡核苷酸探针是双标记探针，它包括一个报告标记和一个猝灭标记。当双标记寡核苷酸探针处于未与扩增的基因组区域杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光。

当双标记寡核苷酸探针与扩增的基因组区域杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此双标记寡核苷酸探针未与扩增的基因组区域杂交而处于单链状态时的荧光强度。

这里提到的扩增是不对称扩增，扩增中引物的浓度是不平衡的。

这里提到的基因组区域选自以下的基因，其中包括与耐利福(RIF)平相关的RpoB基因，与耐异烟肼(INH)相关的KatG基因、maBA(fabG1)-inhA启动子和oxyR-ahpC基因间区域，与耐乙胺丁醇(EMB)相关的embB基因，与耐吡嗪酰胺(PZA)相关的pncA基因，与耐链霉素(STR)相关的rpsL和rrs基因，与耐左氧氟沙星相关的gyrA基因，这里提到的基因组区域中的突变包括，rpoB基因的511、513、515、516、518、519、522、526、531和533位点，embB基因的306位点，katG基因的315位点，inhA基因的-15和-8位点，ahpC基因-6、-9、-10和-12位点等18个或更多突变位点。

猝灭标记可以是非荧光猝灭基团，它标记在寡核苷酸探针的3’末端，这里提到的报告标记可以是荧光基团，它可以标记在寡核苷酸探针内部的核苷酸残基上。

这里提到的报告标记可以标记在寡核苷酸探针的5’末端。

在标记寡核苷酸的熔解曲线分析中，产生熔解谱的步骤还包括当探针与靶核酸序列分离时，确定-df/dT最大值的步骤。

靶核酸序列与探针的杂交区域至少要包含一个与结核耐药相关的突变。其中，探针与野生型序列匹配，或者探针与突变型序列匹配。

这里提到的扩增是多重检测反应，反应中至少存在两条与不同基因组区域杂交的探针。

这里提到的至少两条探针的每条可以都与野生型序列匹配，也可以每条都与突变型序列匹配，还可以其中一条与野生型序列匹配，另外一条与突变型序列匹配。

这里提到的两条探针可以包含可以在单一信号检测通道内检测的相同或相似的染料标记，或者也可以包含在不同信号检测通道内检测的不同颜料标记。

其中探针可以包含不与扩增序列互补的核苷酸，这里提到的探针与包含9bp回文结构序列的RpoB基因的81bp核心区域杂交，上述探针中所包含的不与扩增序列互补的核苷酸阻止了探针自身发夹结构的形成。

此方法还包括以野生型样本为对照，对临床样本所产生熔解谱的分析。熔解谱中峰的位置如果与野生型相比出现至少1℃的改变，这就标志着样本中突变的存在。

此方法可以在一个反应管中扩增两个或者更多的基因组区域。

这里提到的引物选自本说明书序列表中的SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：16。

这里提到的探针选自本说明书序列表中的SEQ ID NO：17～SEQ IDNO：30。

其中，一条探针由25～50个核苷酸组成，在杂交的条件下，它能够与结核分枝杆菌RpoB基因81bp的核心区域杂交。这条探针包括一个标记在3’末端的猝灭标记和一个标记在内部核苷酸残基上或5’末端的报告标记。这里的探针杂交在包含RpoB基因526、531和533密码子的区域，探针含有与扩增序列不互补的核苷酸；这里提到的探针与包含9bp回文结构序列的RpoB基因的81bp核心区域杂交，上述探针中所包含的不与扩增序列互补的核苷酸阻止了探针自身发夹结构的形成。这里提到的探针选自本说明书序列表中的SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27。

此发明还包括一个从样本中检测耐药结核分枝杆菌的试剂盒，包括：

至少一条标记的寡核苷酸探针。此寡核苷酸探针包括一个报告标记和一个猝灭标记。当标记的寡核苷酸探针处于未与靶序列杂交的单链构象时，猝灭标记能够猝灭报告标记所发出的荧光；

当寡核苷酸探针与靶序列杂交时，形成双链结构，报告标记的荧光不能够被猝灭，此时，报告标记的荧光强度要远高于此寡核苷酸探针未与靶序列杂交而处于单链状态时的荧光强度；

其中，猝灭标记是非荧光标记，它标记在探针的3’末端。

其中，报告标记是荧光染料标记，它标记在在寡核苷酸探针的内部核苷酸残基上或标记在探针的5’末端。

核酸序列扩增所需其它各组分。它包括一个热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。

其中，引物选自本说明书序列表中的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：16。

其中，探针选自本说明书序列表中的SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：30。

总之本发明提供了一种改进的探针用于实时监测PCR反应和/或进行熔解曲线分析，同时此探针可以覆盖包含多个突变位点的靶序列较大区域而便于进行检测及分析。

附图说明

图1是双标记寡核苷酸探针与靶序列杂交示意图。

图2是单重基因扩增后的野生型和突变型熔解曲线分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1：引物和探针的设计与合成

利福平和异烟肼是结核病治疗方案中关键的一线药物，也是最容易出现耐药性的抗结核药物。研究表明，97％利福平耐药株是由于rpoB基因(511、513、515、516、518、519、522，526、531和533位点)突变所致，突变主要集中在一段高度保守的81bp区域。异烟肼耐药性主要与编码过氧化氢酶-过氧化物酶的katG基因(315位点)、编码还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性烯酰基载体蛋白还原酶的inhA基因(-8，-15位点)和编码烷基过氧化氢酶的ahpC基因(-6、-9、-10和-12位点)突变相关。embB306位点突变是一个高特异性的与结核耐多药相关的遗传标记。根据上述5种与结核耐药相关基因序列设计引物和探针，并确保产生的靶序列扩增产物中含有待检测的全部突变位点；靶核酸序列扩增产物与探针的杂交区域至少要包含一个待检的突变核苷酸。正向引物可以是序列表中的SEQ ID NO.1～SEQID NO.9对应的与结核耐药相关5种基因的引物及其组合，反向引物可以是序列表中SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.16对应的与结核耐药相关5种基因的引物及其组合，探针可以是序列表中SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.30对应的序列及其组合

引物和探针均委托专业公司进行合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。除RpoB探针1的FAM荧光报告基团标记在第16位碱基dT上，RpoB探针2的FAM荧光报告基团标记在第17位碱基dT上，RpoB探针3的FAM荧光报告基团标记在第14位碱基dT上，RpoB探针4的FAM荧光报告基团标记在第24位碱基dT和ahpc3探针3的FAM荧光报告基团标记在第12位碱基dT上外，其余各探针均为5’末端标记FAM荧光报告基团。所有探针的3’末端均标记BHQ1猝灭基团。RpoB探针2与靶序列的结合区域含有一个9个碱基对的倒转重复顺序，为了防止回文结构的形成，RpoB探针2引入了不配对碱基，分别在11位和22位碱基位置。RpoB探针3，RpoB探针4，inhA探针3也引入了不配对碱基以减小Tm值。

实施例2：PCR反应组成

按下表(表1)配制PCR反应液并加入TB DNA模板(每次实验必须包括阴性对照和野生型阳性对照)。配制完成后旋涡振荡混匀，离心后上机。

表1 PCR体系各成分组成(master MixI)

  各组分名称  终浓度  PCR Buffer  1×  MgCl₂  1.5mM  Betaine  0.8M  dNTPs  0.25mM  RpoB正向引物  0.4μM  RpoB反向引物  0.05μM  RpoB探针1  0.3μM  RpoB探针2  0.3μM  Taq酶5‘exo-  0.5U  无菌超纯水  适量  DNA模板  1μl  总体积  20μl

实施例3：反应程序设定

设置收集FAM荧光信号的荧光检测通道，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪开始扩增，反应程序如下(以Rotor Gene Q为例)：

表10 PCR程序设定

结果判定

当荧光定量PCR仪运行结束后，用其配套软件对本次试验的结果进行熔解曲线分析。以阳性对照品反应管(野生型)为参照，其熔解曲线与阳性对照品管峰型完全相同的样本为野生型；其熔解曲线与阳性对照品管峰型有差异的为突变型。当基因发生突变后，其熔解曲线的Tm值与野生型相比会有所降低，结果见附图2。

序列表

<110>无锡锐奇基因生物科技有限公司

 

<120>用标记探针进行检测和熔解曲线分析的方法

 

<160>30

 

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>RpoB正向引物1

 

<400>1

GCCGCGATCA AGGAGTTCTT C 21

 

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>RpoB正向引物2

 

<400>2

AGGCGATCAC ACCGCAGACG TT 22

 

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>KatG正向引物

 

<400>3

CGTATGGCAC CGGAACCGGT AA 22

 

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>ahpc正向引物1

 

<400>4

CACTGCTGAA CCACTGCTTT GC 22

 

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>ahpc正向引物2

 

<400>5

GCGGCGATGC CGATAAATAT GG 22

 

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>inhA正向引物1

 

<400>6

CACGTTACGC TCGTGGACAT AC 22

 

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>inhA正向引物2

 

<400>7

GAGCGTAACC CCAGTGCGAA AG 22

 

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>emb正向引物1

 

<400>8

CGTCGGACGA CGGCTACATC 20

 

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>emb正向引物2

 

<400>9

GGTGATATTC GGCTTCCTGC TC 22

 

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>RpoB反向引物

 

<400>10

CGGCACGCTC ACGTGACAGA C 21

 

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>KatG反向引物1

 

<400>11

CGAGGAAACT GTTGTCCCAT TTCG 24

 

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>KatG反向引物2

 

<400>12

GCTCCCACTC GTAGCCGTAC A 21

 

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>ahpc反向引物

 

<400>13

CTCCTCATCA TCAAAGCGGA CAATG 25

 

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>inhA反向引物1

 

<400>14

CTGTGGCAGT CACCCCGACA A 21

 

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>inhA反向引物2

 

<400>15

CCAGGACTGA ACGGGATACG AA 22

 

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>emb反向引物

 

<400>16

GCCGAACCAG CGGAAATAGT TGGA 24

 

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>RpoB探针1

 

<400>17

GGTTGTTCTG GTCCATGAAT TGGCTCAGC 29

 

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>RpoB探针2

 

<400>18

GCCCCAGCGt CGACAGTCGG TGCTTGTGGG 30

 

<210>19

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>KatG探针1

 

<400>19

TCACCAGCGG CATCG 15

 

<210>20

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>KatG探针2

 

<400>20

CGATCACCAG CGGCATC 17

 

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>ahpc探针1

 

<400>21

GCGACATTCC ATCGTGCCG 19

 

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>ahpc探针2

 

<400>22

TGCGACATTC CATCGTGCCG 20

 

<210>23

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>inhA探针1

 

<400>23

GCGAGACGAT AGGTTG 16

 

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>inhA探针2

 

<400>24

CGAGACGATA GGTTGTCGGG 20

 

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>emb探针1

 

<400>25

TCGGCGACTC GGGCCATGCC C 21

 

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>RpoB探针3

 

<400>26

CCAGCGtCGA CAGTCGGtGC TTGTGG 26

 

<210>27

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>RpoB探针4

 

<400>27

CGACAGtGGG TTGTTCTGGT CCATGAATTG GCTCAGC 37

 

<210>28

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>ahpc探针3

 

<400>28

CCATCGTGCC GTGAAGTCGC TGTCAGGCA 29

 

<210>29

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>emb探针2

 

<400>29

CGACTCGGGC CATGCCC 17

 

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>inhA探针3

 

<400>30

CGGCGAGATG GTAGGCTGTC GGGG 37