利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法

摘要

本发明涉及一种利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法，该方法包括新疆紫草外植体的选择和处理、发根农杆菌的活化培养、子叶外植体的感染和毛状根的诱导、无菌新疆紫草毛状根根系的获得及新疆紫草毛状根的液体培养及紫草素等步骤。由于所使用的毛状根具备在无外源激素培养基上快速、自主生长的特性，因此该方法不仅能克服利用细胞培养物生产紫草素时细胞培养物生长缓慢、需外加激素维持其生长的不足，而且具有紫草素产出率稳定、培养时操作简便、成本较低、不受气候、土地等自然条件的限制等优点。尤其为利用毛状根培养法生产紫草素提供了一种稳定、可持续的新型药源，为今后应用生物反应器进行紫草素规模化生产提供了可靠的来源和物质基础。

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，涉及一种利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法。

背景技术

新疆紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst是多年生药用植物，紫草的主要成分为紫草素，是萘醌类化合物，是紫草中临床药效最好的一种，其有效成分为紫草素及其衍生物，具有显著的抗生育、抗炎、抗肿瘤、杀菌抗病毒、保肝和免疫调节等药理作用，同时作为色素可用于化妆品、食品及印染，在医药、食品、化妆品、印染领域有着巨大的市场潜力。新疆紫草占全国资源量的80％以上，是国内外商品紫草的主要来源。但新疆紫草依赖种子繁殖，生长3-5年才开花、结果，且种子成熟度和发芽率较低，自然修复缓慢，加之近年来大规模的无序采挖，产量也直线下降，年采挖量不足20吨，使新疆紫草野生资源处于濒危的边缘，对新疆的生态环境已造成极大破坏，为此，我国早在1996年就已将新疆紫草列为国家二级保护植物。为拓宽新疆紫草的开发利用途径，国内外学者进行了硬紫草的田间栽培、新疆紫草及硬紫草的细胞和组织培养、紫草素人工合成等许多研究。目前新疆紫草大面积人工栽培尚未见报道，且由于此法占用耕地、生长缓慢，药材产量低，有效成分低，受生态环境影响，同时药用植物的大田栽培往往使用大量的农药，造成严重的农药残留和重金属残留问题，不能满足市场需求而受到限制。日本早在20世纪80年代中期已实现了紫草细胞培养生产紫草素。但是，利用细胞培养生产紫草素还存在一些问题，如细胞培养生长缓慢，细胞容易聚集，细胞遗传与生理易变异，细胞代谢途径和代谢产物形成与细胞生长关系复杂，随生产规模的扩大紫草素产量不稳定或呈降低趋势，生产时间过长和生产成本过高等问题，限制了其工业化的发展。因此，寻找一种新的生产紫草素及其衍生物的方法以解决市场的需求势在必行。毛状根是发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri质粒诱发的结果，具有生长迅速，分支多，在无激素培养基上能够自主、持续生长，次生代谢产物含量高且稳定的特性，为药用植物次生代谢产物(如药物、天然色素、香料、天然调味品等)的工业化生产提供了一条有效途径。目前转化成功的植物已有200多种，人参、黄连等已能通过毛状根培养法进行工业化生产。新疆紫草毛状根国内未见报道。利用新疆紫草毛状根诱导和培养，以代替天然新疆紫草，生产有效成分紫草素，对保护其野生资源和生态环境，促进新疆紫草的产品开发和产业化具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法，该方法包括新疆紫草外植体的选择和处理、发根农杆菌的活化培养、子叶外植体的感染和毛状根的诱导、无菌新疆紫草毛状根根系的获得及新疆紫草毛状根的液体培养及紫草素的提取等步骤，是利用生长阶段快速繁殖的毛状根为试材，采用M-9液体培养基作为生产紫草素的培养基，从而利用培养的毛状根达到产业化生产紫草素的目的。由于诱导出的毛状根具有在培养基上快速自主生长的特性，因而它能克服利用细胞培养时细胞培养物生长缓慢、需外加激素维持其生长的不足，而且具有培养时操作简便、紫草素产量稳定、成本低、不受气候、土地等自然条件的限制等优点。尤其为利用毛状根培养法生产紫草素提供了一种稳定、可持续的新型药源，为今后应用生物反应器进行紫草素规模化生产提供了可靠的材料来源和物质基础，对保护新疆紫草野生资源及其进一步开发利用具有重要意义。

本发明所述的一种利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法，下列步骤进行：

新疆紫草毛状根的诱导：

a、将新疆紫草种子用75％酒精消毒30s-60s，再用0.1％升汞表面消毒5-10min，无菌水充分漂洗后过夜，再用抗生素头孢噻肟钠浸泡60min，接种在1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗环境培养15-20d，得到无菌苗，切取无菌苗幼嫩子叶，接种在1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗环境中1/2MS固体培养基预培养2d，待用；

b、将发根农杆菌按常规方法接于YEB固体培养基上，黑暗培养2d后，挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，温度28℃，转速160-180r/min，振荡培养过夜，所得菌液置于温度4℃，转速5000r/min的离心机中离心5-10min，所得菌体再用MS液体培养基重悬后用于感染；

c、将子叶外植体置于步骤b的发根农杆菌菌液中，浸泡5-15min，取出，于1/2MS固体培养基中共培养2d后，转接在含头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗培养形成毛状根；

d、将步骤c的毛状根剪取2-3cm，转入含头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基上，进行单根离体培养，每7d继代一次，逐渐降低抗生素浓度，直至无菌为止，再采用PCR、rolC基因序列分析和Southern分子杂交对毛状根进行遗传转化鉴定，确定毛状根株系；

新疆紫草毛状根的生长

e、将步骤d毛状根接种于无铵的MS或SH或1/2MS液体培养基中，加入0.5-1g/L酸水解酪蛋白，肌醇1g/L，15-30g/L的蔗糖，pH值5.6-6.0，温度25±1℃，转速为100-120r/min的条件下进行振荡、黑暗培养12-15d；

新疆紫草毛状根生产紫草素

f、将步骤e生长的毛状根接种于含酸水解酪蛋白0.5-1g/L和蔗糖15-30g/L的M-9液体培养基中培养5-15d，添加大孔吸附树脂NKA-91g/瓶，pH值为5.6-6.0，温度25±1℃，转速100-120rpm的条件下进行培养，25-30d为一个培养周期，取出毛状根，温度50℃烘干，研磨成粉，用浓度95％乙醇浸提3次，合并提取液，浓缩，即可得到紫草膏。

步骤a中子叶切块是在无菌条件下，将子叶切成0.2-0.5cm²的小块或将子叶周围切除。

步骤a、步骤c和步骤b中所用抗生素头孢噻肟钠的浓度为500-1000mg/L。

本发明所述的方法，所述步骤a的子叶外植体在预培养基中进行的黑暗培养是将外植体接种于预培养基上，温度25℃±1℃，时间24-48h，所述的预培养基为：1/2MS固体培养基；

所述步骤b发根农杆菌菌液是将发根农杆菌MSU440菌株置于YEB液体培养基中，在温度28℃、160-180r/min转速下培养至对数生长期；然后将菌液进行离心弃上清液，用无激素MS培养基重悬并稀释到OD＝0.3-0.7，所述OD值为农杆菌菌液在600nm光波下的光吸收值；

所述步骤c中的预培养子叶外植体经发根农杆菌的介导转化是将预培养后的子叶外植体浸泡到发根农杆菌(MSU440)菌液中，浸泡5-15min，以进行介导转化；

所述步骤c中的介导转化后的子叶外植体的共培养是将介导转化后的子叶外植体接种于共培养基上，在25℃±1℃下24-48h；其中共培养基为1/2MS固体培养基；

所述步骤c中的介导转化后的子叶外植体进行共培养后的外植体再进行抑菌继代培养是将介导转化后的子叶外植体进行共培养后的外植体转入抑菌培养基中，在25℃±1℃黑暗中进行至少五次继代抑菌培养，直至将菌除净；

所述的抑菌培养基为：MS基本培养基，其中大量元素减半、抗生素头孢噻肟钠500-1000mg/L；

所述步骤e中将具有毛状根的外植体接入毛状根生长培养基中进行毛状根的扩大培养是将抑菌培养的具有毛状根的外植体转入毛状根生长培养基中，温度25℃±1℃、转速100-120r/min、黑暗中进行毛状根的扩大培养，液体培养12-15d后毛状根的生长量达峰值，是起始接种量的20-30倍。

所述的毛状根生长培养基为：SH基本培养基、酸水解酪蛋白0.5-1g/L、肌醇1g/L和蔗糖15-30g/L。

所述步骤f中经扩大培养的毛状根转接入紫草素生产培养基中进行紫草素的生产，是将在生长培养基中进行扩大培养的毛状根转入紫草素生产培养基中，温度25℃±1℃，转速100-120r/min、黑暗中进行紫草素生产，培养25-30d时紫草素含量达峰值，为干重的1-1.5％，用95％的乙醇提取毛状根中的紫草素。

所述的毛状根生产培养基为：M-9基本培养基，酸水解酪蛋白0.5-1g/L和蔗糖15-30g/L。

本发明所述的方法中，MS培养基(Murashige and Skoog 1962)是本领域常用培养基；YEB培养基是基因工程领域常用的用于培养细菌的培养基；本实验所选用的发根农杆菌MSU440菌株由朱金虎博士惠赠；rolC基因引物由北京三博远志生物技术公司合成；Marker 2000购自北京天为科技时代；所用抗生素头孢噻肟钠由医院药房购得。

本发明所述的利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法，该方法中对新疆紫草毛状根生长和新疆紫草毛状根紫草素生产的条件为：

1、新疆紫草毛状根生长的条件：

通过对不同温度、转速、培养基、pH值、碳源等影响毛状根生长因子的研究，结果表明，毛状根接种量为0.5g，接种于装有50mL无铵的SH液体培养基的100mL锥形瓶中，加入1g/L酸水解酪蛋白替代NH₄⁺，肌醇1g/L，15g/L的蔗糖，pH值为5.8，于25±1℃，120±5rpm的条件下可促进和调控毛状根生长，12d为一个培养周期，毛状根增殖10.26倍，为毛状根紫草素生产奠定了物质基础。

2、新疆紫草毛状根紫草素生产条件：

通过对培养基、L-苯丙氨酸、琼脂糖、油菜素内酯、酸水解酪蛋白、真菌诱导子等影响毛状根紫草素合成因子的研究，并采用浸提法提取紫草素，分光光度法测定紫草素含量，结果表明，将经过一个生长周期生长的毛状根按接种量为3g接种于装有50mL M-9液体培养基的100mL锥形瓶中，并添加0.5g/L酸水解酪蛋白，25g/L的蔗糖，pH值为5.8，培养在25±1℃，120±5rpm的条件下，25d为一个培养周期，使毛状根中紫草素含量从固体培养及生长阶段的0.33％左右提高到1.20％，紫草素含量最高达1.60％，说明毛状根紫草素含量可通过理化因子进行调控。

3、大孔吸附树脂对毛状根紫草素含量的影响

通过在M-9液体培养中添加大孔吸附树脂并进行不同型号、添加时间及IAA、真菌诱导子等条件优化研究，采用柱层析、浸提法提取紫草素，分光光度法测定紫草素含量，结果表明，毛状根在M-9液体培养基中培养10d时添加大孔吸附树脂NKA-91g/瓶，培养35d后收获毛状根，大孔吸附树脂及毛状根中的紫草素总含量为3.64％，最高达3.90％。说明大孔吸附树脂可明显提高紫草素含量，是提高紫草素含量的主要调控因子。

4、毛状根中紫草素的RP-HPLC测定

RP-HPLC法同时测定新疆紫草毛状根Aehrf07株系、原产地温泉野生根的总紫草素中有效成分-乙酰紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰紫草素的含量，结果表明，毛状根中β，β′-二甲基丙烯酰紫草素含量较低，为0.010％；添加大孔吸附树脂和黑曲霉诱导子培养得到的毛状根中乙酰紫草素的含量最高(0.932％)，接近原植物根中的含量。采用石油醚提取毛状根中总紫草素，提取物中β，β′-二甲基丙烯酰紫草素和乙酰紫草素的提取率比用乙醇试验提取率高。

本发明所述的利用新疆紫草毛状根生产紫草素的方法与已有技术相比其特点为：

(1)应用新疆紫草毛状根大量培养生产紫草素与栽培和野生的植物相比，可获得稳定的质量和产量，不受环境气候的限制。

(2)由发根农杆菌转化的新疆紫草毛状根在无激素培养基上能够快速、自主生长，因而它克服了利用细胞培养时细胞培养物生长缓慢、需外加激素维持其生长，以及容易产生生理变异的不足，因而使得紫草素的质量和产量可持续获得。

(3)利用毛状根培养生产紫草素，不占用耕地，可在室内进行工厂化、规模化生产。

(3)可以通过调控毛状根的生长和紫草素的合成以提高紫草素的产量。

(4)该项技术不使用光照，在黑暗中进行毛状根培养，可节省电力，减少成本。

具体实施方式

实施例1

a、将新疆紫草种子用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞表面消毒5min，无菌水充分漂洗后过夜，再用500mg/L的头孢噻肟钠浸泡60min，接种在1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗环境培养15d，得到所需的无菌苗待用，切取0.2cm²的小块无菌苗幼嫩子叶，接种在1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗环境预培养2d，待用；

b、将发根农杆菌按常规方法接于YEB固体培养基上，黑暗培养2d后，挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，温度28℃，转速120r/min，振荡培养一昼夜，所得菌液置于温度4℃，转速5000r/min的离心机中离心5min，所得菌体再用MS液体培养基重悬后用于感染；

c、将子叶外植体置于步骤b的发根农杆菌菌液中，于室温下浸泡5min取出，用无菌滤纸吸干表面多余水分和菌液，于1/2MS固体培养基中共培养2d后，转接在含头孢噻肟钠500mg/L的1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗培养形成毛状根，2周后，从子叶外植体伤口处产生红色的根，产生毛状根的子叶外植体百分数约为19％；

d、将步骤c的毛状根剪取2cm，转入含头孢噻肟钠500mg/L的1/2MS固体培养基上，进行单根离体培养，每7d继代一次，逐渐降低抗生素浓度，直至无菌为止，再用PCR技术对毛状根进行遗传转化鉴定，确定毛状根株系；对毛状根进行PCR(聚合酶链式反应)检测，以确定T-DNA的插入，以发根农杆菌MSU440菌株为阳性对照，非转化根为阴性对照，设计roLC基因的特异性引物，利用PCR技术，从毛状根的总DNA中扩增到586bp的特异DNA片段，从分子水平证明了RiT-DNA已整合入新疆紫草的染色体组中；

同时将经过PCR扩增的呈阴性的新疆紫草毛状根中rolC基因进行正反链测序，结果两个序列有97％相吻合，其中正向测序序列与GENEBANK中Slightom J.L.等报道的pRiA4质粒rolC基因序列完全一致，同源性达到100％，进一步确认了rolC基因被整合进了新疆紫草毛状根中；对PCR阳性株进行Southern斑点杂交，结果显示呈阳性，最终确认rolC基因被整合进了新疆紫草毛状根中；

新疆紫草毛状根的生长

e、将步骤d毛状根接种于50mL无铵的MS液体培养基中，加入0.5g/L酸水解酪蛋白、肌醇1g/L和15g/L的蔗糖，pH值5.6，温度25±1℃，转速为100r/min的条件下进行振荡、黑暗培养12d；

新疆紫草毛状根生产紫草素

f、将步骤e除菌完全、生长速度快、PCR检测呈阳性的毛状根接种于50mL含0.5g/L酸水解酪蛋白和蔗糖15g/L的M-9液体培养基中培养10d，添加大孔吸附树脂NKA-91g/瓶，pH值为5.6，温度25±1℃，转速100rpm的条件下进行振荡、黑暗培养，25d为一个培养周期，取出毛状根，温度50℃烘干，研磨成粉80目，用浓度95％乙醇浸提3次，合并提取液，浓缩，即可得到紫草膏，用分光光度法测定毛状根中紫草素含量为干重的1-1.5％。

实施例2

a、将新疆紫草种子用75％酒精消毒45s，再用0.1％升汞表面消毒灭菌8min，无菌水充分漂洗后过夜，再用500mg/L的头孢噻肟钠浸泡60min，接种在1/2MS固体培养基上至萌发，再将无菌苗幼嫩子叶子叶周围切除，并接种在1/2MS固体培养基上温度25℃±1℃，黑暗环境培养18d，切取0.5cm²的小块无菌苗幼嫩子叶，接种在1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗环境预培养2d，待用；

b、将发根农杆菌按常规方法接于YEB固体培养基上，黑暗培养2d后，挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，温度28℃，转速135r/min，振荡培养一昼夜，所得菌液置于温度4℃，转速5000r/min的离心机中离心8min，所得菌体再用MS液体培养基重悬后用于感染；

c、将子叶外植体置于步骤b的发根农杆菌菌液中，于室温下浸泡10min取出，用无菌滤纸吸干表面多余水分和菌液，与1/2MS固体培养基中共培养2d后，转接在含头孢噻肟钠800mg/L的1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗培养形成毛状根，2周后，从子叶外植体伤口处产生红色的根，产生毛状根的子叶外植体百分数约为19％；

d、将步骤c的毛状根剪取3cm，转入含头孢噻肟钠800mg/L的1/2MS固体培养基上，进行单根离体培养，每7d继代一次，逐渐降低抗生素浓度，直至无菌为止，再用PCR技术对毛状根进行遗传转化鉴定，确定毛状根株系；对毛状根进行PCR(聚合酶链式反应)检测，以确定T-DNA的插入，以发根农杆菌MSU440菌株为阳性对照，非转化根为阴性对照，设计rolC基因的引物，利用PCR技术，从毛状根的总DNA中扩增到586bp的特异DNA片段，从分子水平证明了RiT-DNA已整合入新疆紫草的染色体组中；

同时将经过PCR扩增的呈阳性的新疆紫草毛状根中rolC基因进行正反链测序，结果两个序列有97％相吻合，其中正向测序序列与GENEBANK中Slightom J.L.等报道的pRiA4质粒rolC基因序列完全一致，同源性达到100％，进一步确认了rolC基因被整合进了新疆紫草毛状根中；

新疆紫草毛状根的生长

e、将步骤d毛状根接种于50mL无铵的SH基本培养基上，加入酸水解酪蛋白0.8g/L、肌醇1g/L和蔗糖25g/L，pH值5.8，温度25±1℃，转速为110r/min的条件下进行振荡、黑暗培养14d；

新疆紫草毛状根生产紫草素

f、将步骤e除菌完全、生长速度快、PCR检测呈阳性的毛状根接种于50mL含0.8g/L酸水解酪蛋白和蔗糖23g/L的M-9液体培养基中培养10d，添加大孔吸附树脂NKA-91g/瓶，pH值为5.8，温度25±1℃，转速110rpm的条件下进行振荡黑暗培养，28d为一个培养周期，取出毛状根，50℃烘干，研磨成粉90目，用浓度95％乙醇浸提3次，合并提取液，浓缩，即可得到紫草膏，用分光光度法测定毛状根中紫草素含量为干重的1-1.5％。

实施例3

a、将新疆紫草种子用75％酒精消毒60s，再用0.1％升汞表面消毒灭菌10min，无菌水充分漂洗后过夜，再用500mg/L的头孢噻肟钠浸泡60min，接种在1/2MS固体培养基上至萌发，再将无菌苗幼嫩子叶切成0.5cm²的小块，并接种在1/2MS固体培养基上温度25℃±1℃，黑暗环境培养20d，得到所需的无菌苗待用；

切取子叶周围切除无菌苗幼嫩子叶，接种在1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗环境预培养2d，待用；

b、将发根农杆菌按常规方法接于YEB固体培养基上，黑暗培养2d后，挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，温度28℃，转速150r/min，振荡培养一昼夜，所得菌液置于温度4℃，转速5000r/min的离心机中离心10min，所得菌体再用MS液体培养基重悬后用于感染；

c、将子叶外植体置于步骤b的发根农杆菌菌液中，于室温下浸泡15min取出，用无菌滤纸吸干表面多余水分和菌液，与1/2MS固体培养基中共培养2d后，转接在含头孢噻肟钠1000mg/L的1/2MS固体培养基上，温度25℃±1℃，黑暗培养形成毛状根，2周后，从子叶外植体伤口处产生红色的根，产生毛状根的子叶外植体百分数约为19％；

d、将步骤c的毛状根剪取2.5cm，转入含头孢噻肟钠1000mg/L的1/2MS固体培养基上，进行单根离体培养，每7d继代一次，逐渐降低抗生素浓度，直至无菌为止，再用PCR技术对毛状根进行遗传转化鉴定，确定毛状根株系；对毛状根进行PCR(聚合酶链式反应)检测，以确定T-DNA的插入，以发根农杆菌MSU440菌株为阳性对照，非转化根为阴性对照，设计rolC基因的引物，利用PCR技术，从毛状根的总DNA中扩增到586bp的特异DNA片段，从分子水平证明了RiT-DNA已整合入新疆紫草的染色体组中；

同时将经过PCR扩增的呈阳性的新疆紫草毛状根中rolC基因进行正反链测序，结果两个序列有97％相吻合，其中正向测序序列与GENEBANK中Slightom J.L.等报道的pRiA4质粒rolC基因序列完全一致，同源性达到100％，进一步确认了rolC基因被整合进了新疆紫草毛状根中；

新疆紫草毛状根的生长

e、将步骤d毛状根接种于50mL无铵的1/2MS液体培养基中，加入1g/L酸水解酪蛋白、肌醇1g/L和30g/L的蔗糖，pH值6.0，温度25±1℃，转速为-120r/min的条件下进行振荡、黑暗培养15d；

新疆紫草毛状根生产紫草素

f、将步骤e除菌完全、生长速度快、PCR检测呈阳性的毛状根接种于50mL含1g/L酸水解酪蛋白和蔗糖30g/L的M-9液体培养基中培养15d，添加大孔吸附树脂NKA-91g/瓶，pH值为6.0，温度25±1℃，转速120rpm的条件下进行振荡、黑暗培养，30d为一个培养周期，取出毛状根，50℃烘干，研磨成粉100目，用浓度95％乙醇浸提3次，合并提取液，浓缩，即可得到紫草膏，用分光光度法测定毛状根中紫草素含量为干重的1-1.5％。