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导入有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶基因的转化体、和使用该转化体的黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的制备方法

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本发明的课题在于，以高效率大量生产能够更准确地测定葡萄糖量的新型FAD-GDH。本发明提供一种转化体，导入有编码黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的DNA，所述DNA选自以下的(a)～(f)：(a)编码以序列编号20表示的氨基酸序列的DNA；(b)由以序列编号19表示的碱基序列的DNA；(c)具有与以序列编号19表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA；(d)编码以序列编号34表示的氨基酸序列的DNA；(e)由以序列编号33表示的碱基序列的DNA；(f)具有与以序列编号33表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。另外，本发明还提供使用该转化体的黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的制备方法。

著录项

公开/公告号CN101889077A

专利类型发明专利
公开/公告日2010-11-17

原文格式PDF
申请/专利权人天野酶株式会社;
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申请/专利号CN200880117736.X
发明设计人结城健介;中西雄二;
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申请日2008-10-03
分类号C12N1/19(20060101);C12N1/15(20060101);C12N9/04(20060101);C12N15/09(20060101);C12P21/02(20060101);C12Q1/32(20060101);C12Q1/54(20060101);
代理机构11227 北京集佳知识产权代理有限公司;
代理人苗堃;金世煜
地址日本爱知县
入库时间 2023-12-18 01:05:14

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2014-12-03

未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N1/19 授权公告日:20130626 终止日期:20131003 申请日:20081003

专利权的终止
2013-06-26

授权

授权
2011-01-05

实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/19 申请日:20081003

实质审查的生效
2010-11-17

公开

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说明书

技术领域

本发明涉及导入有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶(在本说明书中也称为“FAD-GDH”)基因的转化体、和使用该转化体的FAD-GDH的制备方法。

背景技术

近年来，使用电化学的生物传感器的简易型自身血糖测定器得到广泛使用。生物传感器为在绝缘性的基板上形成电极、酶反应层的传感器。作为在此使用的酶，可以列举葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖氧化酶(GO)等。使用GO的方法被指出存在以下问题：容易受测定样品中的溶存氧的影响，溶存氧对测定结果有影响。

另一方面，作为不受溶存氧的影响且在不存在NAD(P)条件下作用于葡萄糖的酶，已知以吡咯喹啉醌(PQQ)为辅酶的GDH(PQQ-GDH)(例如参照专利文献1～3)。但是，在PQQ-GDH中，存在以下问题：(1)PQQ容易与酶解离，(2)对于葡萄糖的选择性低，和(3)由于一般存在于膜组分中，因此伴随其提取、分离操作存在困难等。

另外，近年来，有报告在医院使用简易血糖自身测定器的患者中发生低血糖等病症的例子。之后的调查、分析结果确定这样的病例的原因为，PQQ-GDH与作为输液成分而含有的麦芽糖反应，显示出比实际的血糖值要高的值(医药品·医疗用具等安全性情报206号(Pharmaceuticals andMedical Devices Safety Information No.206)，平成16年(2004年)10月，厚生劳动省医药食品局)。基于这样的情况，迫切期望开发特异性地与葡萄糖作用，特别是对麦芽糖的作用性低的血糖测定用酶。

此外，除PQQ-GDH之外，作为不受溶存氧的影响且在不存在NAD(P)条件下作用于葡萄糖的酶，还已知以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅酶的葡萄糖脱氢酶(即，FAD-GDH)。至此，由米曲霉(Aspergillus oryzae)(非专利文献1～4)和土曲霉(Aspergillus terreus)(专利文献4)分别获得FAD-GDH。但是，很难说这些FAD-GDH的生产量在供给于工业利用上有足够的生产量。

专利文献1：日本特开2000-350588号公报

专利文献2：日本特开2001-197888号公报

专利文献3：日本特开2001-346587号公报

专利文献4：国际公开第2004/058958号小册子

非专利文献1：Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.I.Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone，T.C.Bak，and R.Sato，Biochim.Biophys.Acta，139，265-276(1967).

非专利文献2：Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.II.Purification and physical and chemical properties，T.C.Bak，Biochim.Biophys.Acta，139，277-293(1967).

非专利文献3：Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.III.General enzymatic properties，T.C.Bak，Biochim.Biophys.Acta，146，317-327(1967).

非专利文献4：Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.IV.Histidyl residue as an active site，T.C.Bak，and R.Sato，Biochim.Biophys.Acta，146，328-335(1967).

发明内容

本发明人的研究小组以取得能够更准确地测定葡萄糖量的新型FAD-GDH和其生产菌为目的，关注于以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅酶的FAD-GDH。并且，以微生物为对象进行广泛地筛选，结果取得FAD-GDH生产性优异的米曲霉(Aspergillus oryzae)。另外，成功纯化该菌株生产的FAD-GDH，也成功确定其各性状。通过确定的各性状，可知该FAD-GDH为新型的酶。另外，可知该FAD-GDH对葡萄糖的选择性优异，而且不容易受在反应体系中存在的溶存氧的影响，能够更准确地测定样品中葡萄糖量。进一步进行研究，结果成功确定上述菌株保有的FAD-GDH的氨基酸序列和编码其的基因序列。这些研究成果已经提出国际申请(国际申请编号PCT/JP2007/060694)。

本发明的课题在于，在以上的背景下，以高效率大量生产能够更准确地测定葡萄糖量的新型FAD-GDH。

本发明人为了解决上述课题进行了深入研究。即，分析编码源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的基因，查明碱基序列的特定部分对FAD-GDH酶的最适pH、pH稳定性、温度稳定性、底物特异性和微生物的FAD-GDH生产能力，换言之，对酶的功能方面和生产性的影响。基于该观点制备微生物的转化体，结果成功取得FAD-GDH的生产性极高的转化体，从而完成本发明。本发明如下所述。

[1]一种转化体，导入有编码黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的DNA，所述DNA选自以下的(a)～(f)：

(a)编码以序列编号20表示的氨基酸序列的DNA；

(b)由以序列编号19表示的碱基序列构成的DNA；

(c)具有与以序列编号19表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA；

(d)编码以序列编号34表示的氨基酸序列的DNA；

(e)由以序列编号33表示的碱基序列构成的DNA；

(f)具有与以序列编号33表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

[2]根据[1]所述的转化体，是将属于曲霉属或酵母菌属的宿主微生物进行转化而成的。

[3]根据[1]所述的转化体，是将米曲霉进行转化而成的。

[4]根据[1]所述的转化体，是将酿酒酵母进行转化而成的。

[5]一种黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的制备方法，包含以下步骤(1)和(2)而成：

(1)将[1]～[4]中任一项所述的转化体在产生上述DNA编码的蛋白质的条件下进行培养的步骤；

(2)将产生的上述蛋白质回收的步骤。

[6]一种葡萄糖测定方法，其特征在于，使用以[5]所述的制备方法制备的黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，测定样品中的葡萄糖。

[7]一种葡萄糖测定用试剂，其特征在于，包含以[5]所述的制备方法制备的黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶。

[8]一种葡萄糖测定用试剂盒，包含[7]所述的葡萄糖测定用试剂。

附图说明

图1：pFG2的构成。

图2：pFGP2的构建流程。

图3：培养滤液中的FAD-GDH活性的比较。

图4：属于米曲霉的各菌株的FAD-GDH生产能力的比较。ND为检测限以下(未检测出)。

图5：编码源自米曲霉BB-56和RIB40的FAD-GDH的DNA序列的序列比对图。

图6：源自米曲霉BB-56和RIB40的FAD-GDH的氨基酸序列的序列比对图。

图7：编码源自属于米曲霉的9菌株的FAD-GDH的DNA序列的序列比对图。

图8：源自属于米曲霉的9菌株的FAD-GDH的氨基酸序列的序列比对图。

图9：FAD-GDH的最适pH比较。(A)源自米曲霉BB-56的FAD-GDH，(B)源自米曲霉RIB40的重组FAD-GDH。

图10：FAD-GDH的pH稳定性的比较。(A)源自米曲霉BB-56的FAD-GDH，(B)源自米曲霉RIB40的重组FAD-GDH。

图11：FAD-GDH的温度稳定性的比较。(A)源自米曲霉BB-56的FAD-GDH，(B)源自米曲霉RIB40的重组FAD-GDH。

图12：FAD-GDH的底物特异性的比较。表中的数值表示相对活性(％)。

图13：转化体(酵母)的FAD-GDH生产能力的比较。在用源自RIB40的FAD-GDH的cDNA进行转化的酵母的菌体外和菌体内都未检测出FAD-GDH活性。

图14：在用编码源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的cDNA进行转化的酵母的培养上清液中所含的FAD-GDH在SP琼脂糖中的溶出结果。

图15：在用编码源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的cDNA进行转化的酵母的培养上清液中所含的FAD-GDH在SP琼脂糖中的溶出结果。

图16：SP琼脂糖区分和源自野生型米曲霉RIB40的FAD-GDH在除去糖链后的电泳图的比较。泳道1：米曲霉BB-56纯化FAD-GDH(无处理)，泳道2：米曲霉BB-56纯化FAD-GDH(内切糖苷酶H处理)，泳道3：源自米曲霉BB-56的FAD-GDH(用转化了的酵母表达，无处理)，泳道4：源自米曲霉BB-56的FAD-GDH(用转化了的酵母表达并进行内切糖苷酶H处理)，泳道5：源自米曲霉RIB40的FAD-GDH(用转化了的酵母表达，无处理)，泳道6：源自米曲霉RIB40的FAD-GDH(用转化了的酵母表达并进行内切糖苷酶H处理)。

具体实施方式

(用语)

本发明中的“编码蛋白质的DNA”是指，使其表达时能得到该蛋白质的DNA，即，具有对应于该蛋白质的氨基酸序列的碱基序列的DNA。因此，也考虑到密码子的简并。

本说明书中的用语“分离”可以与“纯化”交换使用。涉及本发明的酶(FAD-GDH)而使用时的“分离”是指，在本发明的酶是源自天然材料时，在该天然材料中实质上不含有该酶以外的成分(特别是实质上不含有夹杂蛋白质)的状态。具体的是，例如在本发明分离的酶中，夹杂蛋白质的含量以重量换算计，不到全部的约20％，优选不到约10％，更优选不到约5％，进一步优选不到约1％。另一方面，本发明的酶为利用基因工程方法进行制备时的用语“分离”是指，实质上不含有源自所使用的宿主细胞的其它成分或培养液等的状态。具体的是，例如在本发明分离的酶中，夹杂成分的含量以重量换算计，不到全部的约20％，优选不到约10％，更优选不到约5％，进一步优选不到约1％。此外，只要没有明确表明与其不同的意思，在本说明书中简单记载为“黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶”的情况意味着“分离状态的黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶”。对于代替黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶而使用的用语“FAD-GDH”和“酶”，也是同样的。

对于DNA，在使用时的“分离”是指，在最初天然存在的DNA的情况下，典型的是，由在天然状态中共存的其它核酸分离的状态。其中，也可以含有在天然状态中相邻的核酸序列(例如启动子区域的序列、终止子序列等)等一部分其它的核酸成分。例如，在基因组DNA的情况下的“分离”状态中，优选实质上不含有在天然状态中共存的其它的DNA成分。另一方面，在cDNA分子等利用基因工程的方法制备的DNA的情况下的

“分离”状态中，优选实质上不含有细胞成分或培养液等。同样地，在通过化学合成制备的DNA的情况下的“分离”状态中，优选实质上不含有dNTP等前体(原材料)或在合成过程中使用的化学物质等。此外，只要没有明确表明与其不同的意思，在本说明书中仅记载为“DNA”的情况意味着分离状态的DNA。

(导入有编码FAD-GDH的DNA的转化体)

本发明的第一局面在于，提供导入有编码新型FAD-GDH的DNA的转化体。在本发明的转化体中，以如下DNA作为外源性分子而存在：(a)编码以序列编号20表示的氨基酸序列的DNA、(b)由以序列编号19表示的碱基序列构成的DNA、(c)具有与以序列编号19表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA、(d)编码以序列编号34表示的氨基酸序列的DNA、(e)由以序列编号33表示的碱基序列构成的DNA、(f)具有与以序列编号33表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

以序列编号20表示的氨基酸序列是本发明人成功鉴定的、米曲霉BB-56具有的FAD-GDH的氨基酸序列。编码以序列编号20表示的氨基酸序列的DNA的具体例为，由以序列编号19表示的碱基序列构成的DNA。其中，一般的，对编码某种蛋白质的DNA的一部分实施改变时，改变后的DNA编码的蛋白质存在具有与改变前的DNA编码的蛋白质相同的功能的情况。即，存在DNA序列的改变对编码的蛋白质的功能实质上没有影响，编码的蛋白质功能在改变前后得以维持的情况。因此，在本发明的一个实施方式中，导入了具有与以序列编号19表示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有FAD-GDH活性的蛋白质的DNA((c))。其中，“同源的碱基序列”是指，与以序列编号19表示的核酸在一部分上不同，但通过该不同其编码的蛋白质的功能(在此是FAD-GDH活性)实质上不受影响的碱基序列。

同源DNA的具体例为，对与以序列编号19表示的碱基序列互补的碱基序列，在严格条件下进行杂交的DNA。其中，“严格条件”是指，所谓的形成特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件。这样的严格条件是本领域技术人员公知的，例如，可以参照Molecular Cloning(Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)或Current protocols inmolecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)进行设定。作为严格条件，例如可以列举使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15MNaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))，在约42℃～约50℃下进行温育，之后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃下洗涤的条件。作为更优选的严格条件，例如可以列举作为杂交液，使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5)的条件。

作为同源DNA的其它具体例，可以列举将以序列编号19表示的碱基序列作为基准，由含有一个或多个碱基的取代、缺失、插入、附加或倒位的碱基序列构成，编码具有FAD-GDH活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以在多个部位发生。其中，“多个”是指，根据在该DNA编码的蛋白质的立体构造上的氨基酸残基的位置、种类不同而异，例如为2～40碱基，优选为2～20碱基，更优选为2～10碱基。以上这样的同源DNA例如可以通过以下得到：利用限制酶处理、通过核酸外切酶、DNA连接酶等的处理、指定位置突变导入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)、随机突变导入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 13，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York)所致的变异导入等，改变具有以序列编号19表示的碱基序列的DNA，以使其包含碱基的取代、缺失、插入、附加和/或倒位。另外，通过紫外线照射等其它方法也能得到同源DNA。

作为同源DNA其它的例子，可以列举由以SNP(单核苷酸多态性)为代表的多态性引起的、认为与如上所述碱基不同的DNA。

导入本发明的转化体的DNA通过以本说明书或附加的序列表所示的序列信息为参考，使用标准的基因工程方法、分子生物学方法、生物化学方法等可以以分离的状态制备。具体而言，可以由适当的丝状菌类、酵母菌类的基因组DNA文库或cDNA文库，或丝状菌类、酵母菌类的菌体内提取液，适当利用可以对本发明的基因特异性杂交的寡核苷酸探针·引物进行制备。寡核苷酸探针·引物可以使用市售的自动化DNA合成装置等容易地合成。此外，为制备本发明的基因，对于所使用的文库的制作方法，例如可以参照Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。

例如，如果是具有以序列编号19表示的碱基序列的基因，则可以利用以该碱基序列或其互补序列的全部或一部分为探针的杂交法进行分离。另外，可以利用使用以与该碱基序列的一部分特异性杂交的方式设计的合成寡核苷酸引物的核酸扩增反应(例如PCR)进行扩增和分离。

并且，本发明人成功鉴定的FAD-GDH(具有序列编号20的氨基酸序列的酶。以下，称为“本酶”)具有以下的性状(详细参考之前提交的国际申请PCT/JP2007/060694)。首先，本酶催化以下的反应，即，在电子受体存在下将葡萄糖的羟基氧化生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应。另外，通过SDS-聚丙烯酰胺电泳测得的本酶的分子量为约100kDa，通过凝胶过滤测得的本酶的分子量为约400kDa(四聚物)。

另一方面，本酶的底物特异性优异，选择性地对D-葡萄糖起作用。详细来说，本发明的FAD-GDH对麦芽糖的反应性非常低，对D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖等的反应性也非常低。具体而言，将对D-葡萄糖的反应性定为100％时，对于这些底物的反应性都在5％以下。在本发明的优选的实施方式中，对于麦芽糖的反应性为1％以下或实质上未发现。在更优选的实施方式中，对于D-果糖的反应性和对于D-半乳糖的反应性的任一个都为1％以下或实质上未发现。具有以上这样优异的底物特异性的本酶优选作为用于准确测定样品中的葡萄糖量的酶。即，根据本酶，即使在样品中存在麦芽糖、半乳糖等的夹杂物时，也能更准确地测定目的的葡萄糖量。因此，本酶可以说适用于预料或担心在样品中存在这样的夹杂物的用途(典型的是测定血液中的葡萄糖量)，而且，还可适用于包括该用途的各种用途，即也可以说适用性高。

如上所述，本酶由米曲霉BB-56株取得。此外，该菌株保藏于下述的规定的保藏机构，可以容易地得到。

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)

保藏日：2006年5月17日

保藏编号：NITE BP-236

明确由米曲霉BB-56株取得的本酶还具有以下的性状(详细参考之前提交的国际申请PCT/JP2007/060694)。

(4)最适pH：7附近

(5)最适温度：60℃附近

(6)pH稳定性：在pH3.0～7.0的范围稳定

(7)温度稳定性：在40℃以下稳定

(8)Km值：对于D-葡萄糖的Km值为约8mM

(9)等电点(pl)：6.4附近

如上所述，判断本酶对于葡萄糖具有选择性并具有高亲和性，而且稳定性优异，适用于对葡萄糖传感器等的应用、实用化。

本发明的转化体典型的是通过使用导入的DNA或含有该DNA的DNA构建物(含有载体的形态)的转化(transformation)进行制备。在通过载体进行转化时，优选使用表达型载体。“表达型载体”是指，能够将插入其的核酸导入目的细胞(宿主细胞)内，且在该细胞内可以使其表达的载体。表达型载体通常包含表达插入的核酸所必需的启动子序列。另外，优选含有促进表达的增强子序列。还可以使用含有选择标记的表达型载体。在使用所述表达型载体时，可以利用选择标记确认表达型载体是否导入(及其程度)。

本发明的基因对载体的插入、选择标记基因的插入(需要的情况下)、启动子的插入(需要的情况下)等可以参照标准的DNA重组技术(例如，可以参照Molecular Cloning，Third Edition，1.84，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，使用限制酶和DNA连接酶的公知的方法)来进行。

转化可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法(Potter，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7161-7165(1984))、脂质体转染法(Felgner，P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))、显微注射法(Graessmann，M.& Graessmann，A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73,366-370(1976))、Hanahan方法(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.166，557-580(1983))、醋酸锂法(Schiestl，R.H.et al.，Curr.Genet.16，339-346(1989))、原生质体-聚乙二醇法(Yelton，M.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81，1470-1474(1984))等进行实施。

作为宿主细胞，可以示例大肠菌等的细菌细胞、丝状菌细胞(例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger))、酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))。

优选的是，将属于曲霉属的微生物或属于酵母菌属的微生物用作宿主。作为属于曲霉属的微生物，可以示例米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，但是考虑具有准确表达酶蛋白质所必需的结构，作为基因供给种最优选米曲霉。另一方面，作为属于酵母菌属的微生物，可以示例酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母，但最优选酿酒酵母。

(FAD-GDH的制备方法)

本发明的第二方面是提供使用上述转化体来制备FAD-GDH的方法。在本发明的制备方法中，首先在产生由导入到其中的基因编码的蛋白质的条件下培养上述转化体(步骤(1))。培养方法和培养条件只要能生产目的的酶即可，没有特别限定。即，以生产本酶作为条件，可以适当设定适合于使用的转化体的培养的方法、培养条件。以下，作为培养条件，示例培养基、培养温度和培养时间。

作为培养基，为所使用的转化体能够生长的培养基即可，任何种培养基都可以。例如，可以使用添加了葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等的碳源，还有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、醋酸铵、或者蛋白胨、酵母抽提物、玉米浆、酪蛋白水解物、麸皮、肉膏等的氮源，还有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等的无机盐的培养基。为了促进所使用的转化体的生长，还可以在培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的pH调整为例如约3～8，优选为约5～7左右，培养温度通常为约10～50℃，优选约为25～35℃左右，在1～15日，优选为3～7日左右在需氧条件下进行培养。作为培养方法，例如可以利用震荡培养法、利用发酵罐的需氧深部培养法。

接着培养步骤，回收产生的蛋白质(即，FAD-GDH)(步骤(2))。在由培养液回收FAD-GDH时，例如通过过滤培养上清液、离心处理等除去不溶物后，适当组合利用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等的盐析、透析、各种色谱等进行分离、纯化，由此可以得到目的FAD-GDH。另一方面，在由菌体内回收时，例如通过加压处理、超声波处理等破碎菌体后，与上述相同地进行分离、纯化，由此可以得到目的FAD-GDH。此外，还可以通过过滤、离心处理等预先由培养液回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。

此外，在各纯化工序中，原则上以FAD-GDH活性为指标进行区分，进入后续的步骤。但是，在通过预试验等，已经可以设定适当的条件的情况下，不限于此。

FAD-GDH的纯化度没有特别限定，但例如可以纯化至比活度为50～160(U/mg)，优选比活度为100～160(U/mg)的状态。另外，最终的形态可以是液体状也可以是固体状(包含粉体状)。

(FAD-GDH的用途)

本发明的其它方面涉及用上述的制备方法制备的FAD-GDH的用途。在该方面中，首先提供使用FAD-GDH的葡萄糖测定法。在本发明的葡萄糖测定法中，利用通过FAD-GDH的氧化还原反应测定样品中的葡萄糖量。本发明例如用于血糖值的测定、食品(调味品或饮料等)中的葡萄糖浓度的测定等。另外，在发酵食品(例如食用醋)或发酵饮料(例如啤酒或酒)的制造工序中，为了调查发酵度也可以利用本发明。在FAD-GDH中，作为辅酶的FAD通常结合至GDH，由此在测定时不需要添加辅酶，可以构建简便的测定体系。

本发明另外提供包含用上述制备方法制备的FAD-GDH的葡萄糖测定用试剂。该试剂用于上述本发明的葡萄糖测定法。

本发明还提供用于实施本发明的葡萄糖测定法的试剂盒(葡萄糖测定用试剂盒)。本发明的试剂盒除包含用上述制备方法制备的FAD-GDH的葡萄糖测定用试剂之外，还包含反应用试剂、缓冲液、葡萄糖标准液等任意的要素。另外，本发明的葡萄糖测定试剂盒通常附带使用说明书。

以下，通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明不受这些实施例的限定。在本实施例中，只要没有特别记载，作为限制酶和其它基因操作用酶使用TAKARA BIO公司或东洋纺织株式会社的制品。此外，酶的反应条件等依照附带的使用说明书。另外，碱基序列的确定使用ABIPRISM^TM 310 Genetic Analyzer、BigDye Terminator v3.1 CycleSequencing Kit(Applied Biosystems公司)，PCR反应使用GeneAmp PCRSystem 9600(PerkinElmer Japan公司)进行。另外，对于这些装置和用于本实施例的装置、基因操作用制品，只要没有特别记载，依照各个制品附带的使用说明书的推荐条件实施操作。

实施例1

<米曲霉BB-56的培养>

按照以下顺序，培养米曲霉BB-56，生产FAD-GDH。将包含以下组成的预培养的培养基50mL分装在300mL容积的三角烧瓶中，在121℃、0.12MPa下灭菌20分钟。将该培养基冷却到室温后，接种米曲霉BB-56，在30℃、200rpm条件下培养3天。

(预培养的培养基组成)

酵母抽提物(Becton，Dickinson Company)0.2％(w/v)

大豆蛋白胨(DMV公司)1.0％(w/v)

葡萄糖(和光纯药工业株式会社)2.0％(w/v)

KH₂PO₄(和光纯药工业株式会社)0.1％(w/v)

MgSO₄·7H₂O(Sigma-Aldrich日本公司)0.05％(w/v)

培养基pH5.7

FAD-GDH的生产在包含以下组成的主培养的培养基中进行。将该主培养基50mL分装在300mL容积的三角烧瓶中，在121℃、0.12MPa条件下灭菌20分钟。将该培养基冷却到室温后，接种上述预培养的培养液1mL，在30℃、200rpm条件下进行4天主培养，生产FAD-GDH。

(主培养的培养基组成)

葡萄糖15.0％(w/v)

Meast P1G(ASAHI FOOD & HEALTHCARE公司)3.0％(w/v)

大豆蛋白胨6.0％(w/v)

KH₂PO₄0.3％(w/v)

K₂HPO₄(和光纯药工业株式会社)0.2％(w/v)

4mM氢醌(和光纯药工业株式会社)

培养基pH6.0

实施例2

<源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的纯化>

在以下条件下进行FAD-GDH的纯化。将如上所述得到的培养液通过硅藻土过滤除去培养液中的菌体和其他固形成分。将通过该操作得到的澄清液用超滤膜进行脱盐、浓缩。用90％饱和硫酸铵对该浓缩液进行盐析处理，利用超滤膜将离心上清液进行脱盐、浓缩。将该脱盐、浓缩液用于以10mM Mcllvaine缓冲液pH5.5平行化了的CM Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences公司)，使FAD-GDH吸附在柱上。用10mMMcllvaine缓冲液pH5.5将柱洗净后，用含有0.1M NaCl的10mM Mcllvaine缓冲液pH5.5使FAD-GDH溶出，回收FAD-GDH活性部分。用超滤膜将回收的活性部分浓缩，将该浓缩液用于以含有2.5M硫酸铵的10mMK₂HPO₄-NaOH缓冲液pH6.5平衡化了的辛基-琼脂糖凝胶，使FAD-GDH吸附在柱上。用含有2.5M硫酸铵的10mM K₂HPO₄-NaOH缓冲液pH6.5将柱洗净后，将同一缓冲液中的硫酸铵的浓度阶段性地变为2.0、1.5、1.0、0.5M，由此使FAD-GDH溶出。回收FAD-GDH的活性部分，用超滤膜进行脱盐、浓缩。将该脱盐、浓缩液用于以20mM K₂HPO₄-NaOH缓冲液pH6.5平衡化了的DEAE Sepharose^TM CL-6B，用20mM K₂HPO₄-NaOH缓冲液pH6.5将FAD-GDH溶出。该部分通过超滤膜进行脱盐、浓缩，由此得到FAD-GDH的纯化酶制品。

实施例3

<源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的部分氨基酸序列的鉴定>

如下所述鉴定源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的部分氨基酸序列。

(1)FAD-GDH的等电点区分

将在实施例2得到的纯化FAD-GDH溶液3mL加入透析管中，浸渍在纯化水中，在4℃过夜，进行透析。将该透析样品供给于甘油密度梯度电泳。柱容量110mL，使用两性载体(Pharmalyte 3-10 for IEF(AmershamBiosciences公司))，在5℃、400V的低电压下通电48小时。通电后，将样品回收，测定各部分的pH和FAD-GDH活性，收集活性部分。

(2)部分氨基酸序列分析用样品的制备

将在上述(1)得到的纯化FAD-GDH供给于使用凝胶PAG Mini“DAIICHI”7.5(第一化学药品株式会社)的SDS-PAGE。将转印缓冲液1(0.3M三羟甲基氨基甲烷(pH10.4)、20％甲醇)、转印缓冲液2(30mM三羟甲基氨基甲烷(pH10.4)、20％甲醇)、转印缓冲液3(40mM 6-氨基己酸(pH7.6)、20％甲醇)用作转印缓冲液，将泳动后的凝胶转印到PVDF膜上。用考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)R-250将转印后的转印膜染色，检测相当于FAD-GDH的条带，切出。将切出的膜用作N末端氨基酸序列分析用样品。同样地，用考马斯亮蓝R-250将SDS-PAGE后的凝胶染色，检测相当于FAD-GDH的条带，切出。将该切出的凝胶用作内部氨基酸序列的分析用样品。由分析结果明确N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列。

实施例4

<同源性检索>

利用N末端氨基酸序列的同源性检索如下进行。从日本专利特开2005-176602的申请人得到日本专利特开2005-176602所公开的米曲霉RIB40的基因信息中的全CDS序列，使用数据库软件Kiroku Ver.3(WORLD FUSION公司)实施利用在实施例3明确的N末端氨基酸序列的同源性检索。结果，认定与葡萄糖氧化酶前体(Glucose OxidasePrecursor)具有相同性的氨基酸序列(日本特开2005-176602的序列表中的序列编号20494)之间具有高同源性。在该序列(日本特开2005-176602的序列表中的序列编号20494)中也存在与在实施例3鉴定的FAD-GDH的内部氨基酸序列分析相一致的区域。通过这些事实表明，日本特开2005-176602的序列表中的序列编号20494(序列编号1)对应于FAD-GDH的氨基酸序列。

实施例5

<源自米曲霉BB-56的染色体DNA的提取>

使用装有YPD培养基(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、pH6.5)100ml的坂口瓶在30℃下将米曲霉BB-56培养过夜后，将培养液过滤，得到菌体。将该菌体冷冻干燥，使用研钵将该干燥菌体约0.3g与药匙1杯的海砂一起进行粉碎，在提取缓冲液(Extraction buffer(1％溴化十六烷基三甲基铵、0.7M NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、1％β-巯基乙醇)12ml中悬浊。在室温旋转搅拌30分钟后，添加等量的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v/v)溶液，搅拌后进行离心分离(1500g、5分钟、室温)得到上清液。在该上清液中添加等量的氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)溶液，搅拌后进行离心分离(1500g、5分钟、室温)得到上清液。在该上清液中稳定地添加等量的异戊醇，进行离心分离(20000g、10分钟、4℃)。用70％乙醇将得到的沉淀(析出的染色体DNA)洗净，真空干燥得到染色体DNA。将该染色体DAN溶解在TE(组成)4ml中，添加10mg/ml RNaseA(Sigma-Aldrich日本公司)200μl，在37℃下温育30分钟。接着，添加20mg/ml蛋白酶K、重组体、PCR Grade(Roche-Diagnostics公司)溶液40μl，在37℃下温育30分钟后，添加等量的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v/v)溶液。搅拌后，进行离心分离(1,500g、5分钟、室温)得到上清液。进行2次该洗净操作后，在上清液中添加等量的氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)溶液并搅拌，进行离心分离(1500g、5分钟、室温)。在得到的上清液中添加1/10容量的3M NaOAc(pH4.8)和2倍容量的乙醇，在-80℃下析出染色体DNA。将析出的染色体DNA通过离心处理(20000g、20分钟、4℃)作为沉淀回收。用70％乙醇将回收的染色体DNA洗净后，真空干燥。将干燥的染色体DNA溶解于TE溶液400μl，得到约1mg/ml的染色体DNA溶液。

实施例6

<合成引物的设计>

合成相当于编码日本特开2005-176602的序列表中的以序列编号20494表示的氨基酸序列(序列编号1)的全链长3226bp的源自米曲霉RIB40的基因序列(序列编号2)的5’、3’两个末端的序列的合成引物FG-F、FG-R(序列编号3、4)。

实施例7

<利用PCR法的FAD-GDH基因的扩增>

以在实施例5制备的源自米曲霉BB-56的染色体DNA为模板实施PCR反应。反应使用TAKARA LA Taq，反应液组成依照在附带的使用说明书记载的规定方法。进行添加以使引物(FG-F、FG-R)分别为0.4μM，模板基因组为10ng/μl的浓度。实施PCR反应。反应循环如下。在94℃下反应2分钟后，重复35次(i)-(iii)的反应：(i)在94℃下30秒，(ii)在60℃下30秒，(iii)在72℃下3.5分钟，最后在72℃下进行10分钟反应。反应完毕后将反应液在4℃下保存。

实施例8

<源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因的碱基序列分析>

将实施例7的PCR反应液供给于琼脂糖电泳，将扩增片段(3241bp)与引物分离，使用GENECLEAN III试剂盒(Q-BIOgene公司)由琼脂糖凝胶提取。将提取的扩增片段亚克隆在载体pUC19(TAKARA BIO公司)的SmaI位点上得到pFG2(图1)。分析pFG2中的PCR扩增片段，即，源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的基因的碱基序列。为了分析上述基因的碱基序列，制备合成引物FG-1(序列编号5)、FG-2(序列编号6)、FG-3(序列编号7)、FG-4(序列编号8)、FG-5(序列编号9)、FG-6(序列编号10)、FG-7(序列编号11)、FG-8(序列编号12)、FG-9(序列编号13)、FG-10(序列编号14)、FG-11(序列编号15)、FG-12(序列编号16)、M13-M5(序列编号17)和M13-RV2(序列编号18)。分析碱基序列，结果明确全链长3241bp的源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因的碱基序列(序列编号19)。由该基因序列预测的氨基酸序列示于序列编号20。

实施例9

<源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的高生产株的取得>

源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的高生产株如下取得。

(1)利用PCR法的乳清酸核苷酸脱羧酶(pyrG)基因的扩增

由日本特开2005-176602得到米曲霉RIB40的pyrG基因的序列信息，制备相当于该序列的5’、3’两个末端的合成引物PYR-F、PYR-R(序列编号21、22)。以在实施例5制备的源自米曲霉BB-56的染色体DNA为模板实施PCR反应。反应使用TAKARA LA Taq，反应液组成依照在附带的使用说明书记载的方法。制备反应液以使引物PYR-F和PYR-R分别为0.4μM，模板的染色体DNA为10ng/μl，实施PCR反应。PCR反应条件为，在94℃下反应2分钟后，重复35次(i)-(iii)的反应：(i)在94℃下30秒，(ii)在58℃下30秒，(iii)在72℃下2分钟，最后在72℃下进行10分钟反应。反应完毕后将反应液在4℃下保存。

(2)表达型载体的构建

将上述PCR反应液供给于琼脂糖电泳，将扩增的pyrG基因片段(1884bp)与引物分离，使用GENECLEAN III试剂盒(Q-BIOgene公司)由琼脂糖凝胶提取。利用限制酶SalI和HindIII将提取的pyrG基因片段的两个末端消化。使用DNA连接试剂盒Ver.2.1将该限制酶处理了的DNA片段与用SalI、HindIII处理的pFG2连接，制作pFGP2(图2)。将pFGP2导入大肠菌DH5感受态细胞，得到大肠菌的转化体。

(3)基因片段的制备

培养上述大肠菌的转化体，由菌体提取质粒pFGP2。利用限制酶HpaI、HindIII将提取的pFGP2消化后，供给于琼脂糖电泳分离出约5kbp的DNA片段，使用GENECLEAN III试剂盒(Q-BIOgene公司)由琼脂糖凝胶提取。与预想相同，确认该5kbp的DNA片段为源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因与pyrG连接的DNA片段。

(4)源自米曲霉(Aspergillus oryzae)BB-56的尿苷要求株的取得

将米曲霉BB-56在YPD培养基(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂、pH6.5)上培养，使胞子寄生。将寄生的胞子在含有0.01％Tween80的0.9％NaCl水溶液中悬浊，得到胞子悬浊液。对胞子悬浊液进行紫外线照射以诱发突变后，将胞子悬浊液撒在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的最低限度培养基(0.052％KCl、0.152％KH₂PO₄、0.6％NaNO₃、0.1％微量元素溶液(0.004％Na₂B₄O₇·10H₂O、0.04％CuSO₄·5H₂O、0.08％FePO₄·nH₂O、0.103％MnSO₄·5H₂O、0.08％Na₂MoO₄·2H₂O、0.8％ZnSO₄·7H₂O)、0.2％尿苷、1％葡萄糖、0.052％MgSO₄·7H₂O、0.1％5-FOA、2％琼脂、pH6.5)上，得到5-FOA耐性株。通过Belser等的方法(Methods in Enzymology Vol.51 P.135)确认5-FOA耐性株有无乳清酸磷酸核糖基转移酶活性和乳清酸核苷酸脱羧酶活性，得到表现出乳清酸核苷酸脱羧酶活性缺失的尿苷要求性的变异株。

(5)对尿苷要求株的转化

将如上得到的源自米曲霉BB-56的尿苷要求株在含有尿苷的YPD培养基(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％尿苷、pH6.5)中在30℃下培养过夜后，使培养液通过玻璃滤器得到菌体，将该菌体悬浊在原生质体调制液(0.8M NaCl、10mM磷酸钠缓冲液pH6.0、3mg/ml Yatalase^TM、0.3mg/ml Novozymes 234(Novo Nordisk Pharma公司))中，在30℃、78rpm条件下处理1小时30分钟，进行原生质体化处理。用滤器将该原生质体悬浊液过滤，将滤液离心分离(780g、5分钟、室温)得到沉淀。将该沉淀悬浊在10mL的0.8M NaCl中，将离心分离(780g、5分钟、室温)得到的沉淀悬浊在10ml的0.8M NaCl中。通过显微镜观察测量该悬浊液的原生质体数后，进行离心分离(780g、5分钟、室温)，将沉淀悬浊在SolI(0.8M NaCl、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl pH8.0)中，制备约2×10⁸/ml的原生质体溶液。在该原生质体溶液中添加1/5容量的聚乙二醇(PEG)溶液(25％PEG 6000、50mM CaCl₂、10mM Tris-HCl pH8.0)，进行混合。将该混合液200μl分装，添加上述制备的FAD-GDH基因和pyrG基因连接而成的5kbp的基因片段的溶液(19μg/μl)13μl，悬浊后在冰中静置30分钟。在该悬浊液中添加PEG溶液(25％PEG 6000、50mM CaCl₂、10mM Tris-HCl pH8.0)1mL，悬浊，在室温下静置15分钟。进一步添加SolI 8.5mL，悬浊并进行离心分离(780g、5分钟、室温)，将由此得到的沉淀在SolI1.2mL中悬浊，得到原生质体悬浊液。将该悬浊液0.2mL移至培养皿后，注入再生培养基(0.052％KCl、0.152％KH₂PO₄、0.6％NaNO₃、0.1％微量元素溶液、21.86％山梨糖醇、1％葡萄糖、0.052％MgSO₄·7H₂O、2％琼脂、pH6.5)使其固化。在30℃下培养5～7天后，将生成的转化体在最低限度培养基(0.052％KCl、0.152％KH₂PO₄、0.6％NaNO₃、0.1％微量元素溶液、1％葡萄糖、0.052％MgSO₄·7H₂O、2％琼脂、pH6.5)中单菌分离，得到导入了包含源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因和pyrG的约5kbp的连接DNA片段的米曲霉转化体。

实施例10

<FAD-GDH生产性的确认>

培养在实施例9得到的转化体，确认FAD-GDH的生产性。

(1)转化体的培养

将包含以下组成的预培养的培养基分装在三角烧瓶中，灭菌。在上述培养基上分别接种米曲霉BB-56、在实施例9得到的转化体，在30℃、200rpm条件下进行3天预培养。

(预培养的培养基组成)

酵母抽提物(Becton，Dickinson公司)0.2％(w/v)

大豆蛋白胨(DMV公司)1.0％(w/v)

葡萄糖(和光纯药工业株式会社)2.0％(w/v)

KH₂PO₄(和光纯药工业株式会社)0.1％(w/v)

MgSO₄·7H₂O(Sigma-Aldrich日本公司)0.05％(w/v)

pH5.7

将包含以下组成的主培养的培养基分装在三角烧瓶中，灭菌。冷却后，接种上述预培养后的培养液1mL，在30℃、200rpm条件下进行4天主培养。培养完毕后，将培养液过滤，测定各滤液的FAD-GDH活性。

(主培养的培养基组成)

葡萄糖15.0％(w/v)

Meast P1G(ASAHI FOOD & HEALTHCARE公司)3.0％(w/v)

大豆蛋白胨6.0％(w/v)

KH₂PO₄0.3％(w/v)

K₂HPO₄(和光纯药工业株式会社)0.2％(w/v)

4mM氢醌(和光纯药工业株式会社)

pH6.0

(2)FAD-GDH活性的测定

FAD-GDH在电子受体存在下催化将葡萄糖的羟基氧化而生成D-葡萄糖酸-δ-内酯的反应。FAD-GDH活性的测定在以下的反应体系中进行。

(1)D-葡萄糖+PMS→D-葡萄糖酸-δ-内酯+还原型PMS

(2)2还原型PMS+NTB→2PMS+二甲(diformazan)

此外，式中的PMS表示吩嗪硫酸甲酯(Phenazine methanesulfate)，NTB表示硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazorium blue)。

在反应(1)中，伴随葡萄糖的氧化生成还原型PMS，进一步在反应(2)中，在570nm波长处测定通过利用还原型PMS的NTB的还原而生成的二甲。

酶的活性通过下述计算式算出。

此外，式中的Vt表示总液量，Vs表示样品量，20.1表示每0.5μmole二甲的吸光度系数(cm²/0.5μmole)，1.0表示光路长(cm)，Df表示稀释倍数。

将含有0.22％(w/v)Triton X-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.52.55mL、1M D-葡萄糖溶液0.09mL、3mM PMS溶液0.2mL和6.6mM NTB溶液0.1mL混合，在37℃下保温5分钟后，添加上述培养滤液0.1mL，开始反应。与酶反应进行的同时，生成在570nm处具有吸收的二甲。测定每1分钟在570nm处吸光度的增加，测定FAD-GDH活性(图3)。结果，FAD-GDH活性在源自米曲霉BB-56的培养滤液中为1.97u/mL，在源自转化体的培养滤液中为38.8u/mL。通过转化，酶的生产性大幅提高约20倍。将该转化体命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)56-T。该转化体保藏于下述的规定保藏机构，可以容易地得到。

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)

保藏日：2007年10月22日

保藏编号：NITE BP-438

实施例11

<属于米曲霉的各菌株的FAD-GDH生成能力的比较>

比较包括米曲霉BB-56的9种米曲霉，即，米曲霉BB-56、米曲霉RIB40、米曲霉IAM2603、米曲霉IAM2609、米曲霉IAM2628、米曲霉IAM2683、米曲霉IAM2736、米曲霉IAM2706和米曲霉NBRC30113的FAD-GDH的生产能力。培养和FAD-GDH活性的测定依照实施例1和实施例10的方法。其结果为，在源自米曲霉RIB40和米曲霉IAM2609的培养液中，极微弱地具有FAD-GDH活性，但活性在检测限以下(图4)。

实施例12

<源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因和源自其它米曲霉的FAD-GDH基因的比较>

将在实施例8明确的源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的碱基序列和编码日本特开2005-176602的序列表中的以序列编号20494表示的氨基酸序列(序列编号1)的全链长3226bp的源自米曲霉RIB40的基因序列(序列编号2)进行比较，由此可知在编码不含内含子的氨基酸的区域中，在两者之间存在18个碱基(6个氨基酸)的不同区域(图5、6)。依照实施例5的方法制备属于米曲霉的8种菌株，即，米曲霉RIB40、米曲霉IAM2603、米曲霉IAM2609、米曲霉IAM2628、米曲霉IAM2683、米曲霉IAM2736、米曲霉IAM2706和米曲霉NBRC30113的各自的染色体DNA，以这些染色体DNA为模板，依照实施例7的方法实施PCR反应。依照实施例8的方法将这些PCR反应液回收，使用合成引物FG-1(序列编号5)确定源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因和源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因的18个碱基(6个氨基酸)的不同区域的碱基序列。将这些基因序列与在实施例8中确定的源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因序列(序列编号19)进行比较。结果，在表示为序列编号31的碱基序列部分(对应的氨基酸序列表示为序列编号32)中，表明在实施例11中活性在检测限以下的米曲霉RIB40和米曲霉IAM2609只有18个碱基(6个氨基酸)不同(图7、8)。

由此启示，明确了的上述18个碱基(6个氨基酸)对FAD-GDH的生产和酶的稳定性有某种影响。

实施例13

<研究利用源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因的转化体的FAD-GDH生产能力>

(1)源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因的扩增

由日本特开2005-176602公开的基因信息得到源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因的序列信息，制备相当于其5’、3’两末端序列的合成引物FG-E22(序列编号23)、FG-R-Sal(序列编号24)。FG-E22具有限制酶EcoT22I的识别部位，FG-R-Sal具有限制酶SalI的识别部位。以在实施例11制备的源自米曲霉RIB40的染色体DNA为模板实施PCR反应。反应使用TKARA LA Taq。调制PCR反应，以使引物FG-E22、FG-R-Sal分别为0.4μM，模板基因组为10ng/μl。反应为，在96℃下反应2分钟后，重复35次(i)-(iii)的反应：(i)在94℃下30秒，(ii)在53℃下30秒，(iii)在72℃下3分30秒，最后在72℃下进行10分钟反应。反应完毕后将反应液在4℃下保存。利用限制酶EcoT22I和SalI将PCR扩增片段消化后，供给于琼脂糖电泳，将PCR扩增片段和引物分离，使用GENECLEAN III试剂盒(Q-BIOgene公司)由琼脂糖凝胶提取PCR扩增片段，即源自米曲霉RIB40株的FAD-GDH基因片段。

(2)高表达启动子片段的制备

以包含在日本特开2003-319786中公开的高表达启动子基因片段的pKF-PCSPb为模板实施PCR反应。反应使用TKARA LA Taq。加入引物以使合成taaPf(序列编号25)、taaEcoT22R(序列编号26)分别为1μM，模板质粒为0.5ng/μl的浓度，实施PCR反应。反应循环为，在94℃下2分钟后，重复30次包括以下的反应：(i)在94℃下30秒，(ii)在60℃下30秒，(iii)在72℃下2分钟，最后在72℃下进行10分钟反应。反应完毕后将样品在4℃下保存。利用限制酶EcoRI和EcoT22I将PCR扩增片段消化后，供给于琼脂糖电泳，将PCR扩增片段和引物分离，使用GENECLEAN III试剂盒(Q-BIOgene公司)由琼脂糖凝胶提取PCR扩增片段，即高表达启动子基因片段。

(3)质粒pCS-FG的制备

使用DNA连接试剂盒Ver.2.1将如上所述制备的源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因、高表达启动子基因片段、和EcoRI及SalI处理的质粒pUC118(TAKARA BIO公司)连接，将构建质粒pCS-FG的pCS-FG导入大肠菌DH5株感受态细胞，得到大肠菌的转化体。培养该转化体，使用GenElute^TM Plasmid Miniprep试剂盒(Sigma-Aldrich日本公司)得到质粒pCS-FG。

(4)质粒pCFPT的制备

以如上所述制备的pCS-FG作为模板实施PCR反应。反应使用KOD-plus。调制PCR反应液，以使合成引物FGH-F(序列编号27)和FGH-R(序列编号28)分别为0.4μM，pCS-FG模板质粒为0.5ng/μl的浓度。反应循环为，在96℃下2分钟后，重复30次(i)-(iii)的过程：(i)在94℃下30秒，(ii)在54℃下30秒，(iii)在68℃下3分30秒，最后在68℃下进行10分钟反应。反应完毕后将样品在4℃下保存。用限制酶HindIII将PCR扩增片段消化后，供给于琼脂糖电泳，分离为PCR扩增片段和引物，使用GENECLEAN III试剂盒(Q-BIOgene公司)由琼脂糖凝胶提取该扩增片段。另一方面，用HindIII将载体pPTRI(TAKARA BIO公司)消化后，用碱性磷酸酯酶(E.coli C75)进行5’脱磷酸化处理。使用DNA连接试剂盒Ver.2.1将该5’磷酸化载体与上述PCR扩增片段连接，构建质粒pCFPT。将该pCFPT导入大肠菌DH5感受态细胞，得到大肠菌的转化体。将该转化体进行培养，使用QI Afilter^TM Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN公司)提取质粒pCFPT。

(5)向米曲霉RIB40株的转化

米曲霉RIB40的原生质体溶液的制备依照实施例9的方法。另外，向原生质体的基因的导入除了导入的基因为1.8μg/μl的pCFPT溶液10μl以外，依照实施例9的方法。导入基因后的原生质体的再生如下进行。将基因导入后的原生质体悬浊液0.2mL移至培养皿，注入再生培养基(0.052％KCl、0.152％KH₂PO₄、0.6％NaNO₃、0.1％微量元素溶液、21.86％山梨糖醇、1％葡萄糖、0.052％MgSO₄·7H₂O、0.5μg/ml吡啶代噻唑硫胺素、2％琼脂、pH6.5)使其固化为板状。在30℃下培养5～7天后，将生成的吡啶代噻唑硫胺素耐性株在含有0.5μg/ml吡啶代噻唑硫胺素的最低限度培养基(0.052％KCl、0.152％KH₂PO₄、0.6％NaNO₃、0.1％微量元素溶液、1％葡萄糖、0.052％MgSO₄·7H₂O、0.5μg/ml吡啶代噻唑硫胺素、2％琼脂、pH6.5)中单菌分离，得到在染色体上具有多个源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因的转化体#75。

实施例14

<源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的纯化>

依照实施例10的方法培养在实施例13制备的转化体#75，得到培养液。通过使用该培养液5.0L的硅藻土过滤来除去培养液中的菌体和其他固形成分。用超滤膜将通过该操作得到的上清液5.4L脱盐、浓缩，同时交换缓冲液为10mM Mcllvaine缓冲液pH5.0，制备pH4.7、电导率1.34mS/cm的溶液600mL。将该浓缩液用于以10mM Mcllvaine缓冲液pH5.0平衡化了的SP Sepharose^TM Fast Flow，使FAD-GDH吸附在柱上。用10mMMcllvaine缓冲液pH5.0将柱洗净后，用含有0.1M NaCl的10mM Mcllvaine缓冲液pH5.0使FAD-GDH溶出，回收FAD-GDH活性部分。将FAD-GDH活性部分合并，用超滤膜进行脱盐、浓缩，同时交换缓冲液为20mMKH₂PO₄-NaOH缓冲液pH6.5，制备pH6.3、电导率2.80mS/cm的浓缩液300mL。将该浓缩液用于以20mM KH₂PO₄-NaOH缓冲液pH6.5平衡化了的DEAE Sepharose^TM CL-6B，用20mM K₂HPO₄-NaOH缓冲液pH6.5将柱洗净。全部回收柱流过液(カラムパススル一)、洗涤液，回收柱未吸附部分。利用超滤膜将该部分浓缩，由此得到源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的纯化酶溶液。提高转化的酶的生产性并由大量培养液进行纯化，由此艰难地成功得到0.01u/mL的纯化FAD-GDH溶液。

实施例15

<FAD-GDH的最适pH的比较>

比较在实施例2制备的源自米曲霉BB-56的FAD-GDH与在实施例14制备的源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的最适pH。

将含有0.22％(w/v)Triton X-100的100mM Mcllvaine缓冲液(pH调整为4.5、5.0、6.0、7.0或8.0)2.55mL、1MD-葡萄糖溶液0.1mL、3mMPMS溶液0.2mL和6.6mM NTB溶液0.1mL混合，在37℃下保温5分钟后，将该混合溶液以每个150μl分装在96孔微量培养板孔中，添加源自米曲霉BB-56或源自米曲霉RIB40的纯化FAD-GDH溶液5μl，开始反应。测定由酶反应生成的二甲在570nm的吸光度，测定每1分钟的二甲的生成量，由此测定酶活性。测定使用POWERSCAN HT(大日本制药株式会社)。源自米曲霉BB-56的纯化FAD-GDH的最适pH在7附近(图9A)，源自米曲霉RIB40的纯化FAD-GDH的最适pH为6.0(图9B)。该结果表示，两种酶的最适pH不同。

实施例16

<FAD-GDH的pH稳定性比较>

将源自米曲霉BB-56或源自米曲霉RIB40的纯化FAD-GDH溶液分别用0.1M醋酸缓冲液pH3、同一缓冲液pH4、0.1M Mcllvaine缓冲液pH4.5、同一缓冲液pH5.0、同一缓冲液pH6.0、同一缓冲液pH7.0、同一缓冲液pH8.0或0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液pH9.5稀释，在各pH中在37℃下处理30分钟。将各处理液用0.2M KH₂PO₄-NaOH缓冲液pH6.5稀释，用与实施例15相同的方法测定FAD-GDH活性。作为对照，还测定用0.1MKH₂PO₄-NaOH缓冲液pH6.5稀释的冰冷保存的纯化FAD-GDH的活性，以该活性为100％，算出相对活性。结果，源自米曲霉BB-56的纯化FAD-GDH在pH3.0-7.0的范围内保持80％以上的活性(图10A)。另一方面，源自米曲霉RIB40的纯化FAD-GDH的pH稳定性表明，只在pH4.0-5.0的范围内稳定，稳定的pH范围窄(图10B)。

实施例17

<FAD-GDH的温度稳定性的比较>

将源自米曲霉BB-56或源自米曲霉RIB40的纯化FAD-GDH用含有0.22％(w/v)Triton X-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液pH6.5稀释，在各指定温度，即4、30、40、50或60℃下处理20分钟。在冰中冷却后，对各处理液用与实施例15相同的方法测定FAD-GDH活性。作为对照，也测定未进行热处理的酶的FAD-GDH活性，以该活性为100％，算出相对活性。结果，源自米曲霉BB-56的纯化FAD-GDH在到40℃为止基本保持100％的活性(图11A)。另一方面，源自米曲霉RIB40的纯化FAD-GDH在30℃以上条件下活性急剧降低(图11B)。

实施例18

<FAD-GDH的底物特异性的比较>

将含有0.22％(w/v)Triton X-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)2.55mL、1M底物(D-葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、木糖、麦芽三糖、麦芽六糖、或麦芽五糖)溶液0.09mL、3mM PMS溶液0.2mL和6.6mM NTB溶液0.1mL混合，在37℃下保温5分钟后，将该混合溶液以每个150μl分装在96孔微量培养板孔中，添加源自米曲霉BB-56或源自米曲霉RIB40的纯化FAD-GDH溶液5μl(活性)，开始反应。测定由酶反应生成的二甲在570nm的吸光度，测定每1分钟的二甲的生成量，由此测定酶活性。测定使用POWERSCAN HT(大日本制药株式会社)。以对于D-葡萄糖的反应速度为100％，算出对于各底物的相对活性。结果，源自米曲霉RIB40的纯化FAD-GDH不仅对于葡萄糖，对于麦芽糖、半乳糖、麦芽六糖也起作用，表明与源自米曲霉BB-56的FAD-GDH相比，底物特异性低(图12)。

以上，由实施例15～18的结果可知，在源自米曲霉BB-56的FAD-GDH基因序列与源自米曲霉RIB40的FAD-GDH基因序列之间不相同的18个碱基序列(6个氨基酸)对酶的pH稳定性、热稳定性、底物特异性有影响。

实施例19

<导入了FAD-GHD的cDNA的酵母的转化体的制备>

(1)源自米曲霉BB-56或米曲霉RIB40的cDNA的制备

将包含以下组成的培养基50mL分装在300mL容积的三角烧瓶中，在121℃下灭菌20分钟。冷却后，分别接种米曲霉BB-56或米曲霉RIB40，在30℃、200rpm条件下进行3天培养。

(培养基组成)

葡萄糖15.0％(w/v)

Meast P1G(ASAHI FOOD&HEALTHCARE公司)3.0％(w/v)

大豆蛋白胨6.0％(w/v)

KH₂PO₄0.3％(w/v)

K₂HPO₄(和光纯药工业株式会社)0.2％(w/v)

4mM氢醌(和光纯药工业株式会社)

pH6.0

将通过过滤培养后的培养液回收的菌体在液氮中急速冷冻，进行粉碎。在该粉碎菌体中加入TRIzol试剂(Invitrogen公司)2ml，进一步进行粉碎。将粉碎菌体回复至室温，将粉碎菌体的悬浊液收集在1.5ml容量的试管中，依照附带的使用说明书记载的方法，得到全RNA。接着，使用MicroFastTrack2.0试剂盒(Invitrogen公司)依照附带的使用说明书记载的方法，纯化mRNA。使用Takara RNA LA PCR^TM试剂盒(AMV)ver.1.1将该mRNA逆转录，得到cDNA溶液。

(2)FAD-GDH的cDNA的制备

以如上所述制备的2种cDNA作为模板通过PCR反应使FAD-GDH的cDNA扩增。反应使用KOD-plus，反应液组成依照在附带的使用说明书记载的方法。引物为FADGDH-1(序列编号29)、FADGDH-2(序列编号30)分别为1μM，在反应体系中加入上述cDNA溶液1μl作为模板cDNA，实施PCR反应。反应循环为，在94℃下2分钟反应后，重复35次(i)-(iii)的反应：(i)在94℃下30秒，(ii)在60℃下30秒，(iii)在68℃下2分钟。反应完毕后将反应液在4℃下保存。

(3)酵母转化体的制备

利用限制酶HindIII和BamHI分别将如上所述得到的2种FAD-GDH的cDNA片段消化。将限制酶反应后的反应液供给于琼脂糖电泳，分离目的片段，使用GENECLEAN III试剂盒(Q-BIOgene公司)由琼脂糖凝胶提取。将这些DNA片段分别与预先用限制酶HindIII和BamHI处理的酵母表达型载体pYES2(Invitrogen公司)连接，由此制备具有源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的cDNA的pYESGDH和具有源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的cDNA的pYES2-RFGC。上述连接使用DNA连接试剂盒Ver.2.1进行。将pYESGDH和pYES2-RFGC分别导入酿酒酵母INVSc株(Invitrogen公司)，得到转化体。上述转化通过附带的说明书记载的醋酸锂法进行。

(4)转化导入的cDNA片段的碱基序列的确认

确认目的cDNA片段正确地导入上述两种转化体。将在上述(3)得到的用限制酶HindIII和BamHI消化的2种FAD-GDH的cDNA片段与用限制酶HindIII和BamHI处理的载体pBR322(东洋纺织株式会社)连接，由此构建(i)具有源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的cDNA的pGDH和(ii)具有源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的cDNA的pRFGC。上述连接使用DNA连接试剂盒Ver.2.1进行。将pGDH和pRFGC分别导入大肠菌DH5株感受态细胞，得到大肠菌的转化体。分别培养这2种转化体，使用GenElute^TM Plasmid Miniprep试剂盒(Sigma-Aldrich日本公司)得到质粒pGDH和pRFGC。依照实施例8的方法确定pGDH和pRFGC的碱基序列。结果确认，pGDH为缺失序列编号19的启动子序列、终止子序列和内含子序列的序列(图5上段的cDNA序列)，且具有第4个的碱基序列C取代为G的cDNA片段(序列编号33)。上述碱基的取代是由限制酶Ncol识别部位的导入生成的。序列编号33对应的氨基酸序列(序列编号34)只在第2个氨基酸取代为Val上与序列编号20不同。另一方面确认，pRFGC为缺失序列编号2的启动子序列、终止子序列和内含子序列的序列(图5下段的cDNA序列)，且具有第4个的碱基序列C取代为G的cDNA片段。上述碱基的取代是由限制酶Ncol识别序列的导入生成的。由以上结果确认，在上述(4)得到的酵母的转化体分别正确地导入(i)源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的cDNA和(ii)源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的cDNA。

实施例20

<利用酵母的转化体的FAD-GDH的生产和酵母生产能力的比较>

培养在实施例19得到的2种转化体，生产FAD-GDH。培养通过在附带的说明书推荐的利用半乳糖的诱导培养法进行。为了确认在培养后的菌体外和菌体内的FAD-GDH的生产，测定培养上清液和菌体破碎液的FAD-GDH活性。FAD-GDH活性的测定如下进行。

(FAD-GDH活性的测定)

将含有0.22％(w/v)Triton X-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)2.55mL、1M D-葡萄糖溶液0.09mL、3mM PMS溶液0.2mL和6.6mM NTB溶液0.1mL混合，在37℃下保温5分钟后，将该混合溶液150μl分装在96孔微量培养板孔中，添加上述培养上清液或菌体破碎液，即用源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的cDNA转化的酵母或用源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的cDNA转化的酵母的培养上清液或菌体破碎液5μl，开始反应。测定由酶反应生成的二甲在570nm的吸光度，测定每1分钟的二甲的生成量，由此测定FAD-GDH活性。测定使用POWERSCAN HT(大日本制药株式会社)。

结果，在用源自米曲霉BB-56的cDNA转化的酵母中，在菌体外和菌体内都检测出FAD-GDH活性。另一方面，在用源自米曲霉RIB40的cDNA转化的酵母中，在菌体外和菌体内都未检测出FAD-GDH活性(图13)。

实施例21

<FAD-GDH的纯化>

尝试由在实施例20得到的2种培养上清液纯化FAD-GDH。将各自的培养上清液供给于以10mM醋酸钠缓冲液pH5.0作为透析外液的透析。将透析后的溶液用于以10mM醋酸钠缓冲液pH5.0平衡化了的HiTrap^TMSP Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Bio-Sciences公司)，使FAD-GDH吸附在柱上。用10mM醋酸钠缓冲液pH5.0将柱洗净后，用含有0.1M NaCl的10mM醋酸钠缓冲液pH5.0将FAD-GDH溶出，回收表现出FAD-GDH活性的部分。FAD-GDH活性的测定依照实施例20的方法。

结果表明，源自米曲霉BB-56的FAD-GDH几乎全部由柱吸附溶离部分检测出(图14)。另一方面表明，源自米曲霉RIB40的FAD-GDH在柱未吸附部分和柱吸附部分上都未检测出活性(图15)。

实施例22

<FAD-GDH的糖链的除去>

在实施例21的纯化操作中得到的纯化酶部分中，将源自米曲霉BB-56的FAD-GDH活性的比活度最高的部分NO.18(图14)、源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的纯化部分NO.18(图15)和在实施例2制备的由源自野生型米曲霉BB-56的培养上清液纯化的FAD-GDH用作糖链除去的样品。将各样品在含有0.1Mβ-巯基乙醇和0.02％SDS的50mM醋酸缓冲液pH5.5中煮沸5分钟，添加内切糖苷酶H处理(Roche-Diagnostics公司)0.05U，在37℃下反应过夜。反应后，将反应液供给于使用PhastSystem(GEHealthcare Bio-Sciences公司)的SDS-PAGE，依照使用说明书附带的方法对凝胶进行银染色。结果表明，导入了编码源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的cDNA的酵母生产与源自野生型米曲霉BB-56的FAD-GDH相同的蛋白质(图16的泳道1～4)。另一方面表明，导入了编码源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的cDNA的酵母不表达FAD-GDH(图16的泳道5和6)。

以上，由各实施例的结果可知，在编码源自米曲霉BB-56的FAD-GDH的基因与编码源自米曲霉RIB40的FAD-GDH的基因之间不相同的18个核酸碱基(6个氨基酸)对FAD-GDH的最适pH、pH稳定性、温度稳定性、底物特异性和利用野生型、转化体的酶的生产能力产生影响。

产业上的可应用性

根据本发明的转化体，能够以高效率大量生产底物特异性优异的FAD-GDH。由本发明的转化体生产的FAD-GDH能够更准确地测定葡萄糖量，适用于血糖值的测定或食品(调味品或饮料等)中葡萄糖浓度的测定等。

本发明不受上述发明的实施方式和实施例说明的任何限定。在不脱离本申请要求保护的范围的记载、本领域技术人员容易想到的范围内的各种变化方式也包含在本发明中。

在本说明书中明示的论文、公开特许公报和特许公报等的内容是援引其所有内容的引用。

IP 1025924P

序列表

<110>天野酶株式会社

结城健介

中西雄二

<120>导入有黄素腺嘌呤二核昔酸结合型葡萄糖脱氢酶基因的转化体、

和使用该转化体的黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的制备方法

<130>P07118P

<t50>JP P2007-308072

<151>2007-11-28

<160>34

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>588

<212>PRT

<213>米曲霉

<400>1

Met Leu Phe Ser Leu Ala Phe Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ala Thr Ala

1 5 10 15

Ser Pro Ala Gly Arg Ala Lys Asn Thr Thr Thr Tyr Asp Tyr Ile Val

20 25 30

Val Gly Gly Gly Thr Ser Gly Leu Val Val Ala Asn Arg Leu Ser Glu

35 40 45

Asn Pro Asp Val Ser Val Leu Leu Leu Glu Ala Gly Ala Ser Val Phe

50 55 60

Asn Asn Pro Asp Val Thr Asn Ala Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Phe Gly

65 70 75 80

Ser Ala Ile Asp Trp Gln Tyr Gln Ser Ile Asn Gln Ser Tyr Ala Gly

85 90 95

Gly Lys Gln Gln Val Leu Arg Ala Gly Lys Ala Leu Gly Gly Thr Ser

100 105 110

Thr Ile Asn Gly Met Ala Tyr Thr Arg Ala Glu Asp Val Gln Ile Asp

115 120 125

Val Trp Gln Lys Leu Gly Asn Glu Gly Trp Thr Trp Lys Asp Leu Leu

130 135 140

Pro Tyr Tyr Leu Lys Ser Glu Asn Leu Thr Ala Pro Thr Ser Ser Gln

145 150 155 160

Val Ala Ala Gly Ala Ala Tyr Asn Pro Ala Val Asn Gly Lys Glu Gly

165 170 175

Pro Leu Lys Val Gly Trp Ser Gly Ser Leu Ala Ser Gly Asn Leu Ser

180 185 190

Val Ala Leu Asn Arg Thr Phe Gln Ala Met Glu Asp Val Asn Gly Gly

195 200 205

Lys Met Arg Gly Phe Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Leu Asp Val Asp Leu

210 215 220

Asn Val Arg Glu Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Tyr Phe Pro Tyr Asp Asp

225 230 235 240

Arg Lys Asn Leu His Leu Leu Glu Asn Thr Thr Ala Asn Arg Leu Phe

245 250 255

Trp Lys Asn Gly Ser Ala Glu Glu Ala Ile Ala Asp Gly Val Glu Ile

260 265 270

Thr Ser Ala Asp Gly Lys Val Thr Arg Val His Ala Lys Lys Glu Val

275 280 285

Ile Ile Ser Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Leu Ile Leu Glu Leu Ser

290 295 300

Gly Val Gly Asn Pro Thr Ile Leu Lys Lys Asn Asn Ile Thr Pro Arg

305 310 315 320

Val Asp Leu Pro Thr Val Gly Glu Asn Leu Gln Asp Gln Phe Asn Asn

325 330 335

Gly Met Ala Gly Glu Gly Tyr Gly Val Leu Ala Gly Ala Ser Thr Val

340 345 350

Thr Tyr Pro Ser Ile Ser Asp Val Phe Gly Asn Glu Thr Asp Ser Ile

355 360 365

Val Ala Ser Leu Arg Ser Gln Leu Ser Asp Tyr Ala Ala Ala Thr Val

370 375 380

Lys Val Ser Asn Gly His Met Lys Gln Glu Asp Leu Glu Arg Leu Tyr

385 390 395 400

Gln Leu Gln Phe Asp Leu Ile Val Lys Asp Lys Val Pro Ile Ala Glu

405 410 415

Ile Leu Phe His Pro Gly Gly Gly Asn Ala Val Ser Ser Glu Phe Trp

420 425 430

Gly Leu Leu Pro Phe Ala Arg Gly Asn Ile His Ile Ser Ser Asn Asp

435 440 445

Pro Thr Ala Pro Ala Ala Ile Asn Pro Asn Tyr Phe Met Phe Glu Trp

450 455 460

Asp Gly Lys Ser Gln Ala Gly Ile Ala Lys Tyr Ile Arg Lys Ile Leu

465 470 475 480

Arg Ser Ala Pro Leu Asn Lys Leu Ile Ala Lys Glu Thr Lys Pro Gly

485 490 495

Leu Ser Glu Ile Pro Ala Thr Ala Ala Asp Glu Lys Trp Val Glu Trp

500 505 510

Leu Lys Ala Asn Tyr Arg Ser Asn Phe His Pro Val Gly Thr Ala Ala

515 520 525

Met Met Pro Arg Ser Ile Gly Gly Val Val Asp Asn Arg Leu Arg Val

530 535 540

Tyr Gly Thr Ser Asn Val Arg Val Val Asp Ala Ser Val Leu Pro Phe

545 550 555 560

Gln Val Cys Gly His Leu Val Ser Thr Leu Tyr Ala Val Ala Glu Arg

565 570 575

Ala Ser Asp Leu Ile Lys Glu Asp Ala Lys Ser Ala

580 585

<210>2

<211>3226

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>2

taggttttgt cacagccagg gtccgcgaaa accttactag cataaatcaa ccaccaaaca 60

cagtattcgg accgggtcta gttgcgatat cttcgttaac ggaatctgga ctctggtgta 120

atttcggagt ggacgtcggg agaatgatcc ttgggcttca tagcgcggcg atcaggtcaa 180

tgaggcaatt ttaggcctat tggagacttc ggatcctaga cattctgccg agccactttg 240

cctagactat tcctgacggg tcgggacttc accggtgaat gaattactcg gtatgccgat 300

tctgaataat accttaataa tgggaatttg atccactttt gggttcttcg ctaccacaga 360

gatgcgcact aaagattatt tgggcttagc tcgaatgtcc ctaacagtag cgtgtattgc 420

atcgtgctcg ctatagattg cagaaccata atctgagttt gagaacgtgt caactctcct 480

attaatcaat gaaagggaaa ggatgtgata tctaggagtg gaagattgag ctagcataga 540

taatatgggt ttaatcttcg tatgagatag agtaatagac ctttcgctgc tagagagcat 600

accacgcaaa gataatgcaa cgaagggacc ctcaactcga tcttatcaga tcagaaacgt 660

ccaccagttg cggcagaatt ccgcacagca gtattcgatt gatggaccca ctagcatgag 720

ctgataaatc catatctgct gaaacattag cttgcttaga agttgcttat ggatcattag 780

cttcattaac tggaggcagg atttgcagag aacttcacta tgatgcaatt caatcaccgt 840

gccgatagta cccagcagta aggtgaacgg aacccttcga attagactaa aatcaaaaaa 900

tatcatgcag tcatggactg catatataat ggttgatgcc agcctttttg cgaaaggatc 960

ttcttcaagg cggacagaga tcgacgcttg acatccaaac atgctcttct cactggcatt 1020

cctgagtgcc ctgtcgctgg ccacggcatc accggctgga cgggccaaga acactacgac 1080

atacgactac atcgttgtgg gaggcggcac aagtggtctt gtggtcgcaa atcgcctttc 1140

tgagaacccc gatgtctccg ttcttctgct tgaggccggt gcttctgtgt tcaacaaccc 1200

ggacgtaacc aacgctaacg gttatggatt ggcctttggc tcggccatcg actggcagta 1260

ccagtctatt aaccaaagct atgcaggagg taaacagcaa gttctgcgtg ctggtaaggc 1320

ccttggagga accagtacaa tcaatggtat gcttctatgg atgatctctt agtcggcatg 1380

gaccactgac gaccacagga atggcctata cccgcgcaga ggatgtccag attgacgttt 1440

ggcagaaact tggaaacgaa ggttggacgt ggaaagatct cctaccatac tacctgaaga 1500

gtgaaaactt gacggcccct accagctctc aggttgctgc tggcgctgct tataaccctg 1560

ccgtgaatgg aaaagaaggt cctctcaagg tcggctggtc gggaagcctg gcctccggta 1620

atctgtcagt tgctctgaac cgtacgttcc aagccatgga ggatgtcaat ggaggcaaga 1680

tgcgtggctt caacatctac ccatccaccc tcgacgttga cctcaatgtc cgcgaagatg 1740

cagcccgggc atactacttc ccttatgatg acaggaagaa ccttcacctg ctggagaaca 1800

ccactgccaa ccgccttttc tggaagaacg gctctgctga ggaagctatt gcggatggtg 1860

tcgagatcac ctccgctgat ggcaaggtca ctcgtgtgca tgcaaagaaa gaggtcatca 1920

tctctgctgg tgccctgcgg tctcctctca ttctcgagct ttcaggagtt ggaaacccaa 1980

cgtaagtgtt ccactgatgc cagcccctct ctatcaccgt ctctgaccct cgtagcatcc 2040

tcaaaaagaa caacataacc ccacgtgtcg atctccccac cgttggggag aacctccaag 2100

accagttcaa caacggcatg gctggcgaag gatacggcgt ccttgccggt gcctcaaccg 2160

tgacctaccc ttccatctcc gacgtcttcg gtaacgagac tgactctatc gttgcatctc 2220

tccgatctca actctccgac tacgccgccg cgaccgtcaa ggtcagcaac ggccacatga 2280

agcaggagga ccttgagcgc ctctaccagc tccaatttga cctcatcgtc aaggacaagg 2340

tccctatcgc cgagatcctc ttccaccccg gtggtggaaa cgccgtgtcc tccgaattct 2400

ggggcttgct tcccttcgcc cgtggcaaca tccacattag ctccaatgac ccgactgctc 2460

ccgccgccat caaccctaac tactttatgt tcgaatggga cggcaagagc caggccggta 2520

tcgccaagta catcaggaag attctccgca gcgcaccatt gaacaaactt attgcgaagg 2580

aaaccaagcc cggtctctct gagattccgg ccactgctgc ggatgagaag tgggttgaat 2640

ggctcaaggc taactgtaag ttgaatcctt tcttggcttc gatggtgagt ctgacgtgag 2700

ctctctagat cgttccaact tccaccccgt cggaactgct gccatgatgc ctcgttccat 2760

tggtggcgtt gttgataacc gtctccgggt ctatggtacc agcaatgttc gcgtcgtaga 2820

tgcgtctgtc ctgcccttcc aggtttgcgg ccacttggtt agcacgcttt atgccgttgc 2880

cgagcgcgct tccgacttga ttaaggagga tgcgaagagt gcttagtttg gtagataaag 2940

ctgcattatc gtagggacag tgtcccgtac caattcgtgc accgtatgaa gagagaaagt 3000

ggtttcagaa ttgggttgtc aaatgtggat ttctgtttca ttgtttaatg tattattagt 3060

ctggattttg tggctgtttg aatgcagtga ctcttggtta cataatttga tacggggtat 3120

gttcgcttgt tcagtcatcg cacgtgtaat gtatggcata cctaggttat tggtaactca 3180

tattacaaaa ttgaagagaa cgagagatcg aagtatttcc catggc 3226

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-F

<400>3

taggttttgt cacagccagg gtccg 25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-R

<400>4

gccatgggaa atacttcgat ctctc 25

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-1

<400>5

agtgaaaact tgacggcc 18

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-2

<400>6

ttcaggagtt ggaaaccc 18

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-3

<400>7

tatgttcgaa tgggacgg 18

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-4

<400>8

agaacgtgtc aactctcc 18

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-5

<400>9

tatgcatttc tcactggc 18

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-6

<400>10

gattgtactg gttcctcc 18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-7

<400>11

tgcaccgtat gaagagag 18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-8

<400>12

ttgctggtac catagacc 18

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-9

<400>13

ttgctgacct tgacggtc 18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-10

<400>14

attgaggtca acgtcgag 18

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-11

<400>15

gcacggtgat tgaattgc 18

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物FG-12

<400>16

tctgtggtag cgaagaac 18

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物M13-M5

<400>17

cgaaaggggg atgtgctg 18

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物M13-RV2

<400>18

cttccggctc gtatgttg 18

<210>19

<211>3241

<212>DNA

<213>米曲霉

<400>19

taggttttgt cacagccagg gtccgcgaaa accttactag cataaatcaa ccaccaaaca 60

cagtattcgg accgggtcta gttgcgacat cttcgttaac ggaatctgga ctctggtgta 120

atttcggagt ggacgtcggg agaatgatcc ttgggtttca tagcgcggcg atcaggtcaa 180