长双歧杆菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹泻中的应用

摘要

一种长双歧杆菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹泻中的应用，其特征是：粘附抑制蛋白Aip阻抑致病菌粘附定植于肠道，而不影响益生菌的粘附，从而防治致病菌引发的腹泻，维持肠道微生态平衡。本发明的优点是：可以克服副作用大和耐药性，粘附抑制蛋白Aip制备成防治腹泻的功能性产品，并不杀死致病菌本身，而是阻抑其粘附胃肠道，使之失去定植复制的条件，被排出体外，故而安全可靠，也不存在耐药性转移等问题，是治疗腹泻的新思路。

说明书

技术领域

本发明涉及一种长双歧杆菌的应用，尤其涉及一种长双歧杆菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹泻中的应用。

背景技术

人类胃肠道寄居的400余种肠内菌群，这些微生物菌群通过群体感应来保持相对数量，相互竞争营养和空间，发挥其生理功能。近年来，食源性致病菌(单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157等)引起的疾病爆发呈增长趋势。这些致病菌通过食物链进入人体胃肠道，粘附肠粘膜后扩增繁殖，入侵肠上皮细胞，被单核巨噬细胞吞噬，并随之扩散到局部淋巴结，最后到达内脏器官，从而引起疾病的发生，如单核增生李斯特菌是自然界存在的一种强致病菌，100个CFU就能导致死亡。

粘附是肠道致病菌引发腹泻的前提，抑制致病菌的粘附，使之成为过路菌被排出体外，让其丧失在肠道繁殖的条件，从而达到防治腹泻的目的。双歧杆菌在体外与致病菌竞争黏附上皮细胞中处于一定的优势。Moroni等发现在与双歧杆菌竞争黏附过程中，弱入侵型、中等入侵型和强入侵型的单核增生李斯特菌的侵袭力下降了38-90％不等，并且双歧杆菌与单层细胞的预孵育能显著抑制单核增生李斯特菌对细胞的粘附。钟世顺等报道双歧杆菌分泌型黏附素(10-30μg/ml)的30min预孵育能明显抑制产毒大肠杆菌或肠出血大肠杆菌对Lovo细胞的黏附。

益生菌与致病菌竞争共同黏附位点，导致空间占位效应，是益生菌抑制致病菌黏附的重要方式。asialo-GM1是致病菌及非致病菌黏附人类及动物粘膜表面的重要糖类物质，约氏乳杆菌La1对肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌的抑制作用即源于其占据了致病菌的黏附位点。Mukai等发现路氏乳杆菌和幽门螺杆菌菌竞争相同的糖基位点，路氏乳杆菌的黏附占据肠上皮细胞的黏附位点后导致幽门螺杆菌失去黏附位点而被排出体外。因此，肠道细胞表面糖类物质作为益生菌和致病菌的共同定向结合位点在抑菌机理中起着重要的作用。另一方面，益生菌通过与致病菌竞争糖基的不同部位，起到空间排阻的效果，达到抑制致病菌的目的。大肠杆菌I型偏好黏附上皮细胞中的甘露糖α1-3甘露糖位点，此位点并不是某些约氏乳杆菌菌株的黏附位点，约氏乳杆菌对于大肠杆菌I型的抑制是可能是由于其占据上述位点的附近糖基位点，引起菌体的空间排阻效应，而影响致病菌的结合。

目前治疗腹泻普遍采用的是抗生素疗法，抗生素有一定副作用，同时可能导致耐药株的产生，从而进一步增加治疗难度。近年来，人们在研究替代抗生素治疗腹泻方面做了大量的工作，尤其是通过益生菌来预防和治疗致病菌引起的感染，更是目前研究的热点。益生菌通过黏附、竞争、排斥、占位及产生抗菌物质等机制，抑制胃肠道内的致病菌，保持原籍菌群的优势，从而促进人体和动物体的健康。本发明就是通过来源长双歧杆菌的粘附抑制蛋白Aip竞争致病菌在肠道细胞的结合位点，阻抑致病菌粘附肠道，达到防治腹泻的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种长双歧杆菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹泻中的应用，Aip具有较强的抑制致病菌粘附肠上皮细胞的能力，且不影响益生菌的粘附功能，使用安全、无残留、不产生抗药性。

本发明是这样来实现的，其特征是：粘附抑制蛋白Aip阻抑致病菌粘附定植于肠道，而不影响益生菌的粘附，从而防治致病菌引发的腹泻，维持肠道微生态平衡。

所述的粘附抑制蛋白Aip的制备方法为：

(1)将新鲜培养的长双歧杆菌按1％接入300mL MRS液体培养基，37℃、厌氧培养16-18h，8000rpm离心3min，收集发酵液上清；

(2)分别按照15％和75％饱和度用硫酸铵分级沉淀上清，最后沉淀用20mLPBS重悬，脱盐，真空冷冻干燥；

(3)取1ml 0.5mg/ml的粗蛋白用预装离子柱Hitrap Q FF进行离子交换层析，首先用起始缓冲液平衡层析柱，所述的起始缓冲液为0.025mol/L磷酸钾缓冲液和0.001mol/L EDTA的混合物并调节pH为8.0，用洗脱缓冲液进行线性浓度梯度洗脱，流速为1ml/min，分别收集各洗脱峰，电泳检测，确定目的峰所在，所述的洗脱缓冲液为0.025mol/L磷酸钾缓冲液、1mol/L氯化钾和0.001mol/L EDTA的混合物并调节pH为8.0；

(4)收集的目的峰再用分子筛柱HitrapSuperdex75进行分离，流动相为Millipore超纯水，流速为0.5ml/min，收集各流出峰，电泳检测，确定目的峰所在。

本发明的优点是：可以克服副作用大和耐药性，粘附抑制蛋白Aip制备成防治腹泻的功能性产品，并不杀死致病菌本身，而是阻抑其粘附胃肠道，使之失去定植复制的条件，被排出体外，故而安全可靠，也不纯在耐药性转移等问题，是治疗腹泻的新思路。

附图说明

图1为本发明从长双歧杆菌发酵液中分离纯化Aip的电泳检测图谱

图2为本发明Aip的核酸序列与氨基酸序列。

图3为本发明构建Aip表达载体的酶切验证图。

图4为本发明基因工程表达与纯化Aip的电泳检测图谱。

图5为本发明验证Aip粘附肠上皮细胞的实验图。

图6为本发明显微镜观察Aip抑制单核增生李斯特菌粘附肠上皮细胞图。

图7为本发明显微镜观察Aip抑制大肠杆菌O157:H7粘附肠上皮细胞图。

图8为本发明活菌计数测定Aip抑制单核增生李斯特菌粘附肠上皮细胞图。

图9为本发明活菌计数测定Aip抑制大肠杆菌O157:H7粘附肠上皮细胞图。

图10为本发明活菌计数测定Aip对长双歧杆菌粘附肠上皮细胞的影响图。

图11为本发明活菌计数测定Aip对植物乳杆菌粘附肠上皮细胞的影响图。

具体实施方式

实施例1：

1.将新鲜培养的长双歧杆菌按1％接入300mL MRS液体培养基，37℃、厌氧培养16-18h，8000rpm离心3min，收集发酵液上清。

2.分别按照15％和75％饱和度用硫酸铵分级沉淀上清，最后沉淀用20mLPBS重悬，脱盐，真空冷冻干燥。

3.取1ml 0.5mg/ml的粗蛋白用预装离子柱Hitrap Q FF进行离子交换层析。首先用起始缓冲液(0.025mol/L磷酸钾缓冲液，0.001mol/L EDTA，pH8.0)平衡层析柱，用洗脱缓冲液(0.025mol/L磷酸钾缓冲液，1mol/L氯化钾，0.001mol/L EDTA，pH8.0)进行线性浓度梯度洗脱，流速为1ml/min，分别收集各洗脱峰，电泳检测，确定目的峰所在。

4.收集的目的峰再用分子筛柱HitrapSuperdex75进行分离，流动相为Millipore超纯水，流速为0.5ml/min，收集各流出峰，电泳检测，确定目的峰所在。各纯化步骤中Aip的SDS-PAGE图谱如图1所示，为45kD左右的蛋白，1为蛋白Marker(14-94kDa)；2为过完分子筛柱后的蛋白样品；3为过完离子柱后的蛋白样品；4为硫酸铵分级沉淀的蛋白样品。

实施例2：

1.按实施例1中的方法培养长双歧杆菌，提取基因组DNA。根据GenBank里的序列设计引物Aip-up(5`-GCGAATTCATGACAGTTAAGATTGGTATCAACGG-3`)和Aip-down(5`-CCGCGGCCGCTCACTCGGAGATCTCAGCGA-3`)，扩增Aip基因，基因序列及蛋白序列如图2所示。

2.把扩增的基因用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切处理后，与同样双酶切的表达载体pGEX-4T-1连接，构建重组表达载体pAip-G4，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，验证并测序，如图3所示，1为pGEX-BIF(EcoR Iand Not I digested)；2为DL2000DNA Marker.

3.取新鲜培养的测序正确的阳性克隆菌，按1％接菌量接入300ml LB培养基中，培养至0D₆₀₀＝0.4-0.6，加入0.5mM IPTG，25℃诱导表达。4500rpm离心5min收集菌体后，PBS洗涤菌体三遍。30ml裂解缓冲液(PBS+2mM EDTA)重悬菌体，超声波破碎后，13000rpm离心10min，取上清。同时以带pGEX-4T-1的大肠杆菌DH5α作为对照进行操作。

4.20ml的A缓冲液(PBS+2mM EDTA)进行谷胱甘肽树脂预装柱GSTrapFF的平衡，流速3ml/min。待曲线平稳后，取破碎后的上清上样，流速0.5-1ml/min。

7.待曲线下降平稳后，用B缓冲液(PBS+2mM EDTA+10mM谷胱甘肽)将目的蛋白洗脱，流速1ml/min，收集洗脱峰。

8.超滤管浓缩洗脱液，过脱盐柱Hitrap desalting，纯水洗脱，流速3ml/min，取洗脱峰，真空冷冻干燥后，取部分溶解进行SDS-PAGE电泳鉴定，见图4，1为pGEX-BIF表达蛋白；2为pGEX-4T-1表达蛋白(对照)；3、纯化的Aip表达蛋白；4为Blue Plus蛋白Marker(12kDa-94kDa)

实施例3：

1.按实施例2中的方法纯化到的Aip，采用活泼酯法，取2μM量子点(CdSe/ZnS Core/Shell，Emission＝620nm)用磷酸二氢钠-HCl缓冲液(0.2M，pH 5.0)重悬，加入1.52mg碳二亚胺(carbodiimide，EDAC)和0.86mgN-hydroxysulfosuccinimide(Suflo-NHS)，25℃反应40min。

2.用NaOH调pH至7.8，加入Aip融合蛋白1mg，25℃反应3h后，4℃放置过夜。10000rpm离心10min取上清后，再40000rpm(＝100，000g)for30min，取沉淀，用500μLPBS溶液溶解，4℃保存待用。同样方法标记GST蛋白作为对照。

3.取95μL肠上皮细胞HT-29(10⁴个/mL)与5μL与量子点标记的Aip蛋白混匀后，37℃孵育2h后，3000rpm离心5min，取沉淀，洗涤三遍后，100μLPBS重悬。

4.取5μL混合液点于载玻片上，荧光显微镜下450nm激发观察发现Aip蛋白能够粘附肠上皮细胞，如图5所示，A为标记量子点的GST；B为标记量子点的Aip。量子点标记的GST蛋白作为对照。

实施例4：

1.按实施例2中的方法纯化到的Aip，取50μL肠上皮细胞HT-29(10⁴个/mL)与50μL30μg/mL Aip融合蛋白，混匀后，37℃孵育2h。

2.3000rpm离心5min，取沉淀，洗涤三遍后，30μLPBS重悬，涂布载玻片表面，阴干后，加热固定，加入3％BSA溶液封闭1h。

3.洗涤干净后，取新鲜培养的单核增生李斯特菌液滴加于固定的细胞表面，37℃孵育1h后，洗去未结合的菌体，进行革兰氏染色，再显微观察。GST蛋白作为对照进行同样地处理。发现经Aip处理的肠上皮细胞后，单核增生李斯特菌结合的数量明显比对照少，如图6所示，A为Aip；B为GST。

实施例5：

1.按实施例2中的方法纯化到的Aip，取50μL肠上皮细胞HT-29(10⁴个/mL)与50μL30μg/mL Aip融合蛋白，混匀后，37℃孵育2h。

2.3000rpm离心5min，取沉淀，洗涤三遍后，30μLPBS重悬，涂布载玻片表面，阴干后，加热固定，加入3％BSA溶液封闭1h。

3.洗涤干净后，取新鲜培养的大肠杆菌O157:H7菌液滴加于固定的细胞表面，37℃孵育1h后，洗去未结合的菌体，进行革兰氏染色，再显微观察。GST蛋白作为对照进行同样地处理。发现经Aip处理的肠上皮细胞后，大肠杆菌O157:H7结合的数量明显比对照少，如图7所示，A为Aip；B为GST。

实施例6：

1.按实施例2中的方法纯化到的Aip，取50μL肠上皮细胞HT-29(104个/mL)与50μL不同浓度的Aip融合蛋白(5，30，50μg/mL)混匀后，37℃孵育2h。

2.3000rpm离心5min，取沉淀，洗涤三遍后，30μLPBS重悬，涂布于甲醇活化的PVDF膜上(1×1.5cm²)，阴干后，加入3％BSA溶液中封闭1h，PBST洗膜三遍。

3.同时取新鲜培养的单核增生李斯特菌液稀释至10⁴个/mL后，取500μL与处理过的膜37℃孵育30min，取出膜，剩余的菌液进行活菌计数。GST蛋白作为对照进行同样地处理。

4.按照下列公式计算粘附抑制率：

粘附抑制率(％)＝(总菌体-剩余菌体)×100/总菌体

结果制成图8，显示随着Aip蛋白浓度增加，抑制单核增生李斯特菌的效果加强。

实施例7：

1.按实施例2中的方法纯化到的Aip，取50μL肠上皮细胞HT-29(104个/mL)与50μL不同浓度的Aip融合蛋白(5，30，50μg/mL)混匀后，37℃孵育2h。

2.3000rpm离心5min，取沉淀，洗涤三遍后，30μLPBS重悬，涂布于甲醇活化的PVDF膜上(1×1.5cm²)，阴干后，加入3％BSA溶液中封闭1h，PBST洗膜三遍。

3.同时取新鲜培养的大肠杆菌0157:H7菌液稀释至10⁴个/mL后，取500μL与处理过的膜37℃孵育30min，取出膜，剩余的菌液进行活菌计数。GST蛋白作为对照进行同样地处理。

4.按照下列公式计算粘附抑制率：

粘附抑制率(％)＝(总菌体-剩余菌体)×100/总菌体

结果制成图9，显示随着Aip蛋白浓度增加，抑制大肠杆菌0157:H7的效果加强。

实施例8：

1.按实施例2中的方法纯化到的Aip，取50μL肠上皮细胞HT-29(104个/mL)与50μL不同浓度的Aip融合蛋白(5，30，50μg/mL)混匀后，37℃孵育2h。

2.3000rpm离心5min，取沉淀，洗涤三遍后，30μLPBS重悬，涂布于甲醇活化的PVDF膜上(1×1.5cm²)，阴干后，加入3％BSA溶液中封闭1h，PBST洗膜三遍。

3.同时取新鲜培养的长双歧杆菌液稀释至10⁴个/mL后，取500μL与处理过的膜37℃孵育30min，取出膜，剩余的菌液进行活菌计数。GST蛋白作为对照进行同样地处理。

4.按照下列公式计算粘附抑制率：

粘附抑制率(％)＝(总菌体-剩余菌体)×100/总菌体

结果制成图10，显示Aip蛋白不影响长双歧杆菌对肠上皮细胞的粘附。

实施例9：

1.按实施例2中的方法纯化到的Aip，取50μL肠上皮细胞HT-29(104个/mL)与50μL不同浓度的Aip融合蛋白(5，30，50μg/mL)混匀后，37℃孵育2h。

2.3000rpm离心5min，取沉淀，洗涤三遍后，30μL PBS重悬，涂布于甲醇活化的PVDF膜上(1×1.5cm²)，阴干后，加入3％BSA溶液中封闭1h，PBST洗膜三遍。

3.同时取新鲜培养的植物乳杆菌液稀释至10⁴个/mL后，取500μL与处理过的膜37℃孵育30min，取出膜，剩余的菌液进行活菌计数。GST蛋白作为对照进行同样地处理。

4.按照下列公式计算粘附抑制率：

粘附抑制率(％)＝(总菌体-剩余菌体)×100/总菌体

结果制成图11，显示Aip蛋白不影响植物乳杆菌对肠上皮细胞的粘附。