一种禽蛋蛋黄中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的联产工艺

摘要

本发明涉及禽蛋蛋黄中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的一种联产工艺。根据禽蛋黄中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的理化性质，设计出实验方案，使得水溶性的免疫球蛋白和脂溶性高密度脂蛋白充分分离。先将鸡蛋黄加水稀释，静置后抽滤，得到上清液和沉淀两个组分。在上清液絮凝沉淀等处理后，将上清采用中空纤维膜过滤获得免疫球蛋白。将蛋黄沉淀用盐洗涤，中速离心得高密度脂蛋白粗品。重溶后用硫酸铵两次沉淀，两次中速离心得到沉淀即为高密度脂蛋白。所获产物用多种方法鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工、精细化工、食品工程、食品添加剂，农副产品深加工和保健品生产领域。特别涉及一种联产禽蛋黄蛋中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的提取纯化工艺。

背景技术

禽蛋蛋黄中含有多种功能性蛋白，其中用处较广的主要为水溶性的免疫球蛋白(IgY)和脂溶性的高密度脂蛋白(HDLP)。免疫球蛋白的研究和应用越来越广泛，包括免疫沉淀、免疫荧光、酶联免疫吸附测定、免疫印迹、免疫电镜等；目前已有从蛋黄仅生产免疫球蛋白的企业，且所生产的免疫球蛋白已用于生产儿童奶粉等。禽蛋蛋黄中高密度脂蛋白是一种具有清除血管壁上胆固醇等作用，阻止动脉粥样硬化发生发展。目前从蛋黄制备高密度脂蛋白在国内尚未实现产业化。此外，已公开发表的制备高密度脂蛋白方法都是采用超高速离心分离纯化，其缺点是设备昂贵，处理量低，能耗高，无法用于工业化生产。目前没有从禽蛋黄中制备免疫球蛋白和高密度脂蛋白的联产工艺。

为了充分利用生产材料，提高禽蛋深加工的附加值，本发明从鸡蛋黄中联产水溶性的免疫球蛋白和脂溶性的高密度脂蛋白，并对制备得到的样品进行了鉴定。

发明内容：一种禽蛋蛋黄中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的提取纯化联产工艺。

禽蛋是指家养的各地方品种鸡、鸭、鹅，和火鸡、山鸡、家鸽、鹌鹑、鸵鸟、孔雀等产的蛋。

1.前处理：根据禽蛋黄中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的性质，设计出实验方案，使得水溶性的免疫球蛋白和脂溶性高密度脂蛋白充分分离，形成互不干扰的两个组分。为两种蛋白的联产做好准备。

2.提取纯化：

2.1免疫球蛋白的提取纯化：采用硫酸铵沉淀和聚乙二醇8000絮凝相结合的方法分离得到免疫球蛋白。

2.2高密度脂蛋白的提取纯化：采用低浓度盐洗涤，再利用硫酸铵沉淀的方法得出较纯的高密度脂蛋白。

3.鉴定：

3.1免疫球蛋白的鉴定：

3.1.1还原与非还原法SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：利用免疫球蛋白是由轻重链组成的四聚体，采用非还原性上样缓冲液和还原性上样缓冲液进行电泳，可以分别得出免疫球蛋白整个分子的SDS-PAGE条带和免疫球蛋白的轻重链的SDS-PAGE条带。由此推断目标蛋白的分子量。

3.1.2Western blotting鉴定：利用酶标抗体进行IgY免疫原性实验，DAB显色得到条带。由此判断IgY的属性。

3.1.3MALDI-TOF-MS/MS检测序列鉴定：通过序列比对鉴定蛋白与数据库中序列一致性判断目标蛋白IgY的一级结构。

3.2高密度脂蛋白的鉴定：

3.2.1.采用不同的蛋白染色方法，可染出高密度脂蛋白的脂成分，磷成分，糖成分，从而断定目标蛋白所含化学组份。

3.2.2.MALDI-TOF-MS/MS检测序列鉴定：通过序列比对鉴定蛋白与数据库中序列一致性断定目标蛋白HDLP的一级结构。

附图说明

1.鸡蛋黄中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的分离结果SDS-PAGE电泳图，图中条带2为免疫球蛋白，纯度为74.1％，条带4为高密度脂蛋白，纯度为73.3％。

M：次高分子分子量标准蛋白(D)；1：蛋黄上清用50％硫酸铵沉淀后上清；2：样品经20％硫酸铵沉淀后沉淀免疫球蛋白；3：蛋黄稀释上清；4：样品经50％硫酸铵沉淀后的高密度脂蛋白；5：样品经50％硫酸铵沉淀后的上清液；6：蛋黄沉淀经0.2M NaCl洗涤后沉淀；7：蛋黄沉淀；8：蛋黄稀释液。

下图为Band scan软件分析样品中两种蛋白的含量表。

2.免疫球蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定图，图中条带1采用非还原性上样缓冲液，条带2为还原性上样缓冲液。目标物分子量与理论吻合。

M1：次高分子量标准蛋白(KD)；1：非还原性免疫球蛋白；2：还原性免疫球蛋白；M2：低分子量标准蛋白(KD)

3.免疫球蛋白的Western blotting鉴定结果。将免疫球蛋白进行免疫印迹，1，2为免疫印迹条带。3，4为考马斯亮蓝染色条带。目标条带呈阳性反应。

1、2：分别对应为条带3、4进行Western blotting的免疫显色条带；3：未纯化的稀释蛋黄上清；4：纯化后的免疫球蛋白；M：次高分子量标准蛋白(KD)

4.免疫球蛋白的MALDI-TOF-MS/MS分析截图，目的蛋白与数据库中Ig gamma chain-chicken匹配得分为160，可鉴定目的蛋白为免疫球蛋白。

5.高密度脂蛋白的鉴定电泳图

1：考马斯亮蓝染色样品；M：次高分子量标准蛋白(D)；2：甲基绿染色样品；3：银染染色样品；4：苏丹黑染色样品

6.高密度脂蛋白的MALDI-TOF-MS/MS分析截图，目的蛋白与数据库中Vitellogenin 2precursor匹配得分为1020，可鉴定目的蛋白为高密度脂蛋白。

具体实施方案

实例1、由鸡蛋蛋黄联产免疫球蛋白和高密度脂蛋白

实验材料：

新鲜鸡蛋(购于本地市场)；甲基绿，北京恒业中远化工有限公司；苏丹黑B，北京恒业中远化工有限公司；5-磺基水杨酸，化学纯，军事医学科学院；硝酸银，北京益利精细化学品公司；其余试剂均为国产分析纯。

冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；JB-2型恒温磁力搅拌器：上海雷磁仪器厂新泾分厂；LGJ10-C型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂等。

实验方法：

1.鸡蛋黄中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的制备工艺

1.1鸡蛋预处理：将鸡蛋黄从鸡蛋中取出后，按1∶30体积比(V/V)加去离子水稀释，静置12h，经抽滤，得到上清液和沉淀两个组分。

1.2上清制备免疫球蛋白

在上清液中加入三聚磷酸钠1.5％(W/V)和氯化钙1.5％(W/V)进行絮凝，静置12h，再取其上清液加入硫酸铵至20％饱和度得沉淀，重溶沉淀后加入5％聚乙二醇8000絮凝并弃沉淀，将上清采用中空纤维膜过滤后，获得免疫球蛋白。

1.3沉淀物中高密度脂蛋白的分离

将蛋黄沉淀用0.1M NaCl进行洗涤，搅拌12h后，在8000r/min，4℃离心30min，沉淀为高密度脂蛋白粗品。将沉淀用0.5M氯化钠溶液溶解后加入35％硫酸铵(W/V)沉淀，8000r/min，4℃离心30min，取上清液再加入15％硫酸铵(W/V)沉淀，8000r/min，4℃离心30min，得到沉淀即为高密度脂蛋白。

2免疫球蛋白和高密度脂蛋白的鉴定

2.1免疫球蛋白鉴定

2.1.1还原与非还原法SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

利用还原性和非还原性两种上样缓冲液分别与免疫球蛋白样品按体积比1∶1混合进行SDS-PAGE电泳(3％的浓缩胶和5％的分离胶)鉴定免疫球蛋白。

还原性上样缓冲液：0.5M Tris-HCl(pH6.8)2.0mL，甘油(丙三醇)2.4mL，20％(W/V)SDS 1.0mL，β-巯基乙醇0.2mL，0.1％(W/V)溴酚兰0.4mL双蒸水4.0mL；非还原性上样缓冲液：0.5M Tris-HCl(pH6.8)2.0mL，甘油(丙三醇)2.4mL，20％(W/V)SDS1.0mL，0.1％(W/V)溴酚兰0.4mL双蒸水4.2mL。

低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶B(97.4KD)、牛血清白蛋白(66.2KD^\)、兔激动蛋白(43KD)、牛碳酸酐(31KD)、胰蛋白酶抑制剂(20.1KD)、鸡蛋清溶菌酶(14.4KD)；次高分子量蛋白标准蛋白：肌球蛋白重链(200KD)、钙调素结合蛋白(130KD)、兔磷酸化酶B(97.4KD)、牛血清白蛋白(66.2KD)、兔激动蛋白(43KD)。

电泳条件：电流25mA，时间4h，上样量20μL。

结果表明，非还原性上样缓冲液电泳条带在180KD的位置有明显条带，说明在非还原性条件下，免疫球蛋白中的二硫键没被破坏，保持蛋白完整性。还原性上样缓冲液电泳条带在180KD处没有条带，而在22KD和70KD分别出现了条带。这是因为还原性缓冲液中的巯基乙醇可以破坏免疫球蛋白中的二硫键，将免疫球蛋白分离成70KD的重链和22KD的轻链，由此可以鉴定该蛋白条带为免疫球蛋白。将制得的免疫球蛋白用非还原性SDS-PAGE电泳，高密度脂蛋白进行SDS-PAGE电泳后，采用Band scan软件分析样品中两种蛋白的含量。将免疫球蛋白进行非还原性SDS-PAGE后，180KD位置有较高浓度的免疫球蛋白，经Bandscan软件分析，纯度为74.1％。，而分离出的高密度脂蛋白经软件分析后，纯度为73.3％。

2.1.2Western blotting鉴定

将分离前后的目的蛋白样品进行非还原性SDS-PAGE电泳，在次高分子量标准蛋白两侧对称上样，25mA恒流电泳4h，切下其中一侧将其进行考马斯亮蓝染色，另一侧用半干法从凝胶转移至硝酸纤维素膜上，采用Towbin作为转膜缓冲液，电流为1.2mA/cm²，4℃下恒流转膜2h。将膜37℃烘干，放入牛血清白蛋白封闭液(3％牛血清白蛋白溶于PBST缓冲液中)封闭1h，用PBST缓冲液(pH7.4的磷酸缓冲液，0.05％吐温-20)洗涤5min×5，浸泡于含有0.125％兔抗鸡IgG的PBST缓冲液中，室温下孵育1h，用PBST缓冲液洗涤5min×5，用二氨基联苯胺溶液(0.05mol/L Tris，0.0035％H₂O₂，0.5g/L DAB)显色数分钟，PBST缓冲液终止反应。

对比考马斯亮蓝染色的蛋白条带，在目的蛋白转膜的对应位置，添加辣根过氧化酶标记兔抗鸡IgG孵育后，通过DAB显色出现了棕色沉淀，这可以说明该位置有辣根过氧化酶标记兔抗鸡IgG特异性的结合，进而证明该蛋白是免疫球蛋白。

2.1.3MALDI-TOF-MS/MS检测序列鉴定

将电泳后胶的相应位置切下，用双蒸水洗净，切成1毫米见方的胶粒，送样进行检测。

将测序结果软件分析，NCBI数据库中蛋白肽段序列比对，得出分析图。Reference下列出的是鉴定出的蛋白名称，Score下列出的是被鉴定蛋白的综合得分(即被鉴定蛋白与数据库中蛋白序列的匹配程度，分数越高，表明该样品真实性越大，一般30分以上即可较确定的认定一种蛋白；30分以下则有可能是另一种蛋白)。目的蛋白与数据库中Ig gamma chain-chicken匹配得分为160，可鉴定目的蛋白为免疫球蛋白。

2.2高密度脂蛋白鉴定

2.2.1高密度脂蛋白染色鉴定

根据高密度脂蛋白同时含糖、含磷和含脂的特性，分别使用脂蛋白、磷蛋白和糖蛋白的电泳染色方法鉴定高密度脂蛋白。

取样品电泳得到四个相同的凝胶条带，分别进行考马斯亮蓝、苏丹黑B、甲基绿、硝酸银糖染色。

(1)考马斯亮蓝染色

将电泳条带用凝胶固定液(甲醇400mL，乙酸100mL，去离子水500mL)固定30min，再用考马斯亮蓝染色液(乙酸100mL，Coomassie blue 0.25g，去离子水900mL)染色30min，经蒸馏水洗涤后，放入凝胶脱色液(甲醇50mL，乙酸50mL，去离子水400mL)中脱色至条带清晰。

(2)脂蛋白分析

将电泳条带蒸馏水洗涤后，放入1％苏丹黑的染色液(2g苏丹黑溶于20mL丙酮，再加入15mL乙酸和165mL水)中染色12h，然后再用脱色液(甲醇/冰醋酸/蒸馏水＝5∶5∶1)进行脱色，直至背景清晰。

(3)磷蛋白分析

将电泳条带在0.5M CaCl₂配制的10％磺基水杨酸(SSA)中固定2h，双蒸水洗涤后放入60℃的0.5M NaOH溶液中固定30min，再用1％钼酸铵洗涤2次，每次10min，然后在1MHNO₃配制的1％钼酸铵溶液中染色30min，最后用7％乙酸配制的0.5％甲基绿染色液染色30min，10％SSA脱色至背景较浅而磷蛋白条带清晰为止。

(4)糖蛋白分析

将电泳条带在含10％醋酸和25％异丙醇的溶液中固定30min，经蒸馏水洗涤后放入7.5％醋酸溶液中浸泡30min，然后用1％高碘酸4℃固定1h。取出条带用双蒸水洗涤6次，每次5min，之后放入0.2％硝酸银溶液(新鲜配制)中反应30min，马上用双蒸水洗涤(不超过5s)，在含2.3％Na₂CO₃，0.01％甲醛及0.001％硫代硫酸钠的溶液中显色15min，加入2.5％醋酸终止反应。

电泳结果可知，样品经考马斯亮蓝染色后，样品中所有蛋白均可出现条带，根据分子量推断出高密度脂蛋白的条带。其中甲基绿染色条带显色证明此蛋白为磷蛋白；改良银染染色条带显色证明此蛋白为糖蛋白；苏丹黑条带显色证明此蛋白为脂蛋白。实验结果证明目标蛋白就是同时含磷、含糖、含脂的高密度脂蛋白。

2.2.2MALDI-TOF-MS/MS检测序列鉴定

将电泳后胶的相应位置切下，用双蒸水洗净，切成1毫米见方的胶粒，送样进行检测。

将测序结果软件分析，NCBI数据库中蛋白肽段序列比对，得出分析图。Reference下列出的是鉴定出的蛋白名称，Score下列出的是被鉴定蛋白的综合得分(即被鉴定蛋白与数据库中蛋白序列的匹配程度，分数越高，表明该样品真实性越大，一般30分以上即可较确定的认定一种蛋白；30分以下则有可能不是一种蛋白)。目的蛋白与数据库中Vitellogenin 2precursor匹配得分为1020，可鉴定目的蛋白为高密度脂蛋白。