一个水稻胚乳特异表达基因的启动子区域的分离克隆及表达模式鉴定

摘要

本发明属于植物基因工程领域。从水稻基因组中克隆了同一胚乳特异表达基因(GeneBank登录号为

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及到水稻中同一胚乳特异性表达基因的不同长度启动子区域的分离克隆及表达模式鉴定。

背景技术

高等生物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。在此过程中基因表达的开启、关闭、表达部位、表达量的高低等都将会受到精细的调控。基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同的调节因素控制，也是在多阶段水平来实现的，即转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。尽管基因表达在高等生物中是多级调控系统，但是转录水平上的调控是最关键的环节。因为转录的起始及其发生频率是基因表达环节中最基本的一步。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，是众多转录因子及RNA聚合酶的最终作用靶标，因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重大意义(Gershon et al.，2008；Gershon et al.，2006；West and Fraser，2005；Hochheimer and Tjian，2003；Wray et al.，2003；Zhang，2003；Courey and Jia，2001；Smale，2001；Tansey，2001；Zhang and Reinberg，2001)。

通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景。自1983年获得第一株转基因烟草以来(Zambryski et al.，1983)，在20多年的时间里，植物基因工程的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为现代生物学和育种学中一项重要的方法和技术。如何让外源基因在植物体内高效、稳定的按照人们的设计初衷来表达可以说是植物基因工程研究的出发点和落脚点。因此，人们在开发一些新的转化技术(如细胞器转化、定向转化等)的同时，越来越注重通过控制目的基因的时空表达来达到相应的转化目的。正因为如此，启动子在植物基因工程中的研究地位也越来越突出。

概括来讲，植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能大致可分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织器官特异型启动子。这种分类大体上反映了它们各自的特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。所谓组织特异型启动子是指除具有一般启动子的结构外，通常还有增强子和沉默子的一般特性。在组织特异型启动子调控下，基因的表达常常只发生在某些特定的器官或组织部位，并常常表现出发育调节的特性。这些启动子的调控往往受到组织细胞生理状态和化学物理信号等物质的诱导，还受到发育阶段的调控，其表达是多种因子相互作用的结果。

果实和种子是植物的生殖器官，也是营养物质主要的储藏场所。利用果实或种子等器官特异性启动子调控基因表达，不仅可提高基因在这些部位的表达量，将生物能耗降到最低，利于表达产物的分离，而且可有目的地提高转基因植物果实或种子的营养或改善其品质。Sandhu等利用E8启动子(成熟果实中乙烯应答性基因的启动子)驱动呼吸道合胞病毒F抗原基因成功转化番茄植株，用果实特异表达抗原喂饲小鼠，可诱导小鼠产生特异的粘膜免疫反应、血清学抗体反应及TH1型细胞免疫反应(Sandhu et al.，2000)。Vasconcelos等用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因，使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加，而且铁蛋白主要积累在胚乳中，不会在食品加工过程中丢失(Vasconcelos et al.，2003)。研究人员在一些单子叶植物的种子储藏蛋白中也分离了一些胚乳特异表达的顺式作用元件，最著名的GCN4元件被认为对维持胚乳特异表达活性是必须的(Wu et al.，1998)。但也有文献报导，GCN4元件仅仅是起到增强启动子在胚乳中的表达强度的作用，其并不能决定启动子胚乳特异表达的特性(Vickers et al.，2006)。另外，一些种子中特异表达的启动子如PsGNS2启动子(Buchner et al.，2002)、FAE1(Rossak et al.，2001)启动子等也有相关的报导。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是禾本科作物功能基因组学研究的模式植物。启动子是精确调控基因表达的“开关”。因此对水稻组织器官特异表达启动子的分离克隆及深入研究，不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，还可以指导转基因育种，创造巨大的经济效益和社会效益，更好的为人类生产生活服务。本发明就是利用有关分子生物学方法，从水稻“明恢63”基因组中分离克隆了同一个胚乳特异表达基因上游不同长度的启动子区域，将不同长度的启动子融合报告基因GUS导入水稻“中花11”中，验证其表达模式，进而鉴定出控制表达量及表达模式区段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有可用于水稻基因工程研究的组织特异表达启动子数目的不足，从水稻“明恢63”(我国广泛应用的优良水稻恢复系)基因组中分离并鉴定出具有胚乳特异表达的启动子，有望将这些启动子用于水稻的基因工程改良。为了便于研究利用，我们创建了EnP2、EnP2-967、EnP2-771、EnP2-591、EnP2-281、EnP2-186、EnP2-155和EnP2-98共8个不同长度的启动子。将这些启动子融合报告基因β-葡糖醛酸酶基因(以下简称GUS基因)导入水稻“中花11”(中国农业科学院作物研究所商业经营品种)中，验证其表达模式，并进行表达量的测定，为日后利用该启动子奠定了基础。

本发明是这样实现的(技术路线见图1)：

利用华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(http://crep.ncpgr.cn)(Wang et al.，2010)及反转录PCR(以下简称RT-PCR)等方法，从水稻“明恢63”(我国广泛推广应用的优良水稻恢复系)基因组中分离并鉴定出具有胚乳特异性表达的启动子。申请人将其命名为EnP2、EnP2-967、EnP2-771、EnP2-591、EnP2-281、EnP2-186、EnP2-155和EnP2-98。所述的启动子EnP2序列，它是序列表SEQ ID NO：1所示的序列。通过分析该启动子驱动GUS报告基因在转基因水稻中的表达模式发现：该启动子仅在转化植株的胚乳表达，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势；在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达。所述的启动子EnP2-967、EnP2-771、EnP2-591、EnP2-281、EnP2-186、EnP2-155序列，分别是序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示的序列，它们分别是由启动子EnP2截短的核心区967bp、771bp、591bp、281bp、186bp、155bp的序列。这六个片段均具有独立的启动基因表达的功能，并且在转化植株中的表达模式与EnP2相同，即仅在胚乳表达，不过表达量各有区别。所述的启动子EnP2-98序列，它是序列表SEQ ID NO：8所示的序列，是由EnP2-155进一步截短的98bp的序列，分析其驱动GUS报告基因在转基因水稻中表达情况发现，这个区段不再具有独立的启动基因表达的功能。

本发明的具体步骤是：

首先在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(http://crep.ncpgr.cn)(Wang et al.，2010)上发现了一个可能是胚乳特异表达的候选基因，在美国国立生物研究所网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上获得该基因的序列，如SEQ ID NO：9所示，共718bp，以这718bp的序列设计引物来做RT-PCR反应从而进一步确定其表达谱，RT-PCR结果显示：该基因仅在胚乳中表达。在此基础上用特异性引物以PCR的方法从水稻“明恢63”基因组中扩增得到一个被命名为EnP2的启动子候选片段，将该启动子候选片段EnP2与报告基因GUS编码序列构建成融合基因并装载到双元Ti载体DX2181(载体图及多克隆位点等信息见图3)上，装配成EnP2-GUS载体(见图4)，再通过农杆菌介导的遗传转化方法，将EnP2-GUS载体转入水稻受体“中花11”中，同时转化空载体DX2181作为阴性对照，转化花椰菜花叶病毒35S启动子驱动GUS(CaMV35S-GUS)作为阳性对照。获得转基因植株后通过组织化学染色及GUS活性定量分析，考察该启动子在胚乳发育各时期的表达变化，进而验证和克隆该启动子。检测结果表明：该启动子仅在转化植株的胚乳表达，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势；在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达。采用片段缺失的方法，我们构建了7个来源于EnP2的5’端缺失片段连接GUS的表达载体，同样通过农杆菌介导的遗传转化方法将其转入水稻受体“中花11”中，分析这7个片段的表达模式，结果显示：来源于该启动子的六个区段(EnP2-967、EnP2-771、EnP2-591、EnP2-281、EnP2-186和EnP2-155)均具有独立的启动基因表达的功能，并且在转化植株中的表达模式与EnP2相同，即仅在胚乳表达，不过表达量各有区别；由EnP2-155进一步截短的EnP2-98区段则不再具有独立的启动基因表达的功能。

本发明的优点在于：

(1)本发明鉴定了胚乳特异表达的启动子EnP2及控制其表达量及表达模式的核心区域，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。

(2)本发明可以直接应用于水稻胚乳特异表达的启动子的鉴定和克隆。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1，公开了本发明克隆的的水稻胚乳特异表达启动子EnP2的核苷酸序列，长度为1176bp。

序列表SEQ ID NO：2是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子EnP2-967应用的核苷酸序列，长度为967bp。

序列表SEQ ID NO：3是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子EnP2-771应用的核苷酸序列，长度为771bp。

序列表SEQ ID NO：4是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子EnP2-591应用的核苷酸序列，长度为591bp。

序列表SEQ ID NO：5是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子EnP2-281应用的核苷酸序列，长度为281bp。

序列表SEQ ID NO：6是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子EnP2-186应用的核苷酸序列，长度为186bp。

序列表SEQ ID NO：7是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子EnP2-155应用的核苷酸序列，长度为155bp。

序列表SEQ ID NO：8是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子EnP2-98研究的核苷酸序列，长度为98bp。

序列表SEQ ID NO：9是本发明克隆的水稻胚乳特异表达启动子EnP2在基因组中所驱动的基因(Genebank登录号为gb：AK107215.1)的核苷酸序列，长度为718bp。

序列表SEQ ID NO：10是本发明克隆的水稻胚乳特异表达启动子EnP2在基因组中所驱动的基因(Genebank登录号为gb：AK107215.1)编码的氨基酸序列，长度为160个氨基酸。

图1：实现本发明的技术路线图。

图2：利用RT-PCR的方法来分析EnP2在基因组中所驱动的基因(gb：AK107215.1)的表达模式。上下列分别表示的为内参水稻Actin1基因和目的基因(gb：AK107215.1)在各个组织中的表达情况。

图3：表示双元载体DX2181结构示意图。该载体是在pCAMBIA1380的基础上改造而来，在多克隆位点处以相反的方向分别构建了一个GUS基因和EGFP基因。

图4：构建好的以DX2181为骨架的表达载体简图。图中：a为阴性对照，即DX2181空载体，无启动子驱动GUS基因表达；b为阳性对照，即用CaMV35S启动子来驱动GUS基因表达；c为EnP2及其系列缺失片段来驱动GUS基因表达。LB、RB分别为DX2181中T-DNA的左边界和右边界；hyg为潮霉素抗性筛选基因；gusA为报告基因GUS(β-葡萄糖苷酸酶)；egfp为报告基因EGFP(增强的绿色荧光蛋白)；MCS表示多克隆位点；35sP表示CaMV35S启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)；EnP2-X表示EnP2及其系列缺失片段；箭头方向表示基因或启动子表达的方向。

图5：由EnP2驱动GUS基因的转化植株的各个组织的组织化学染色。图中：a为叶片；b为叶鞘；c为茎杆；d为种子(含胚与胚乳)；e为根；f为花。

图6：由EnP2及其系列缺失片段驱动GUS基因的转化植株的成熟种子的组织化学染色。图中P2、P2-7、P2-6、P2-5、P2-4、P2-3、P2-2、P2-1分别表示的是启动子片段EnP2、EnP2-967、EnP2-771、EnP2-591、EnP2-281、EnP2-186、EnP2-155和EnP2-98的表达情况；红色小箭头仅起提示作用。

图7：由EnP2及其系列缺失片段驱动GUS基因的转化植株的种子在不同发育时期的GUS活性定量检测。图例中的DAF表示开花后天数(days after flowering)；DX2181表示阴性对照。

具体实施方式

实施例1：胚乳特异表达候选基因(gb：AK107215.1)的表达谱验证

材料准备：本发明所用材料是籼稻品种(Oryza sativa ssp.indica)明恢63(我国广泛应用的优良水稻恢复系)，种植方法是水培。营养液成分如下所示：1.44mM NH₄NO₃，0.3mM NaH₂PO₄，0.5mM K₂SO₄，1.0mMCaCl₂，1.6mM MgSO₄，0.17mM NaSiO₃，50μm Fe-EDTA，0.06μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄，15μM H₃BO₃，8μMMnCl₂，0.12μM CuSO₄，0.12μM ZnSO₄，29μM FeCl₃，40.5μM Citric acid，pH5.5(Yoshida et al.，1976)。在孕穗期取叶片、叶鞘、茎杆、根、穗，受精14天后取胚乳。RNA提取采用Trizol Reagent(Invitrogen，Carisbad，CA，USA)方法。总RNA经1.4％琼脂糖胶电泳检测和浓度测定确认质量合格(18S、28S两条主带清晰无拖尾，OD260/OD280＝1.8-2.0)后方可进行后续试验。将各个组织的RNA反转录成cDNA，置于-20℃冰箱保存。反转录使用的试剂盒是Promega公司的M-MLV，按照产品说明书操作即可。

首先在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(http://crep.ncpgr.cn)(Wang et al.，2010)中发现了一个可能是胚乳特异表达的候选基因，所对应的探针号是Os.8224.1.S1_at，芯片显示在胚乳发育的7，14，21天均高量表达，在其他组织无表达或表达量很低。该探针所表征的基因在TIGR上的登录号是LOC_Os07g11330，在NCBI上的基因号为gb：AK107215.1，基因功能注释为“可能的过敏原蛋白(putative allergenic protein)”。基因大小为718bp，mRNA大小为718bp，编码160个氨基酸(见序列表SEQ ID NO：10)。设计能扩增部分mRNA的RT-PCR引物(YRJTZ2F：GTGTTGCTCCCGGTAGTTGT，YRJTZ2R：GCGTTTCATGTCGCCTCT，扩增大小为351bp)，以水稻“明恢63”的叶片、叶鞘、茎杆、根、穗、胚乳的RNA反转录产物为模板，以水稻Actin1为内参(扩增引物为actin1F：GCCACACTGTCCCCATCTAT，actin1R：GCGACCACCTTGATCTTCAT)。PCR反应条件：94℃5min，94℃30sec，55.5℃30sec，72℃50sec，30个循环，72℃7min。PCR产物经0.8％琼脂糖胶电泳检测。检测结果见附图2。结果显示，候选基因gb：AK107215.1在胚乳中表达，在其他组织不表达。

实施例2：胚乳特异表达启动子EnP2候选片段及相应缺失片段的获得(相应分子生物学常规操作参考《分子克隆实验指南(第二版)》(J.萨姆布鲁克等，1996))

明恢63基因组DNA的抽提：在明恢63分蘖盛期取新鲜叶片用于抽提其基因组DNA，具体方法为Murray报道的CTAB法(Murray and Thompson.1980)，抽提出的DNA完全溶解后置于-20℃冰箱保存。

在生物信息学网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提取候选基因gb：AK107215.1的上游序列，具体来讲是-1085至+91(转录起始点为+1)区间共计1176bp作为启动子候选片段。将其命名为EnP2。利用PCR法，以抽提的明恢63基因组DNA为模板，通过设计特异引物(EnP2F：AAGCTTGTAACTAGATGACGTTATTTGA；EnP2R：GGATCCTCTCAATCCTCAATGAGTGGT)来扩增EnP2，为了后续构建载体的方便，左右引物分别添加HindIII、BamHI酶切位点(以下划线部分表示)及相应的保护碱基(以阴影区表示)。PCR反应条件：94℃5min，94℃1min，62℃40sec，72℃2min，30个循环，72℃7min。

取EnP2的PCR产物用0.8％琼脂糖电泳检测。剩余的PCR产物用于做TA克隆。使用的试剂盒为Promega公司的T-Vctor系统。反应体系为5.0μl，具体如下：EnP2 PCR产物1.9μl、T-Vctor 0.3μl、2倍缓冲液(以下简写为buffer)2.5μl、T₄ligase 0.3μl。

连接产物于16℃低温水浴10h，然后电转化(1800伏，电击2-3秒)入大肠杆菌DH5α(该菌株为商业化的大肠杆菌菌株)，37℃复苏40min，涂含氨苄霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的平板，37℃培养过夜，挑选白斑用含Amp的LB培养基来扩大培养。抽提所摇菌的质粒，用HindIII和BamHI双酶切来筛选阳性克隆。酶切体系为20.0μl，具体如下：质粒3.0μl、10×K buffer2.0μl、HindIII0.1μl、BamHI0.1μl、ddH₂O14.8μl，37℃反应4h，酶切产物用0.8％琼脂糖电泳检测。挑选阳性克隆用ABI3730进行测序。测序结果显示来源于明恢63基因组的EnP2序列与NCBI上报道日本晴的序列100％相同。

7个5’缺失片段与全长启动子共用同一个右引物(EnP2R：GGATCCTCTCAATCCTCAATGAGTGGT)，左引物根据它们最终的扩增片段大小分别命名为EnP2F-967(AAGCTTTATCTTCGCAGGCGGAAGTT)、EnP2F-771(AAGCTTGCTTGCGATAATGCTTTTCC)、EnP2F-591(AAGCTTGCCTCTCAAGAT TGCAGTACA)、EnP2F-281(AAGCTTGCCTTCCATAACTATGTGTC)、EnP2F-186(AAGCTTTATGAATCCACTTTAGCCAAC)、EnP2F-155(AAGCTTCCAGATGATGCCTAGATTAGC)和EnP2F-98(CCCAAGCTTGCTAATCACTCATGCTAAAAG)。在每条左引物5′端都引入HindIII酶切位点(以下划线部分表示)及相应的保护碱基(以阴影区表示)。PCR模板为测序正确的TA-EnP2质粒。得到扩增产物之后，后续操作按照构建TA-EnP2的方法进行。

实施例3：胚乳特异表达启动子EnP2候选片段及相应缺失片段的转化载体构建(相应分子生物学常规操作参考《分子克隆实验指南(第二版)》(J.萨姆布鲁克等，1996))

(1)酶切载体DX2181。DX2181载体是在pCAMBIA1380(该载体是澳大利亚CAMBIA(Center forthe Application of Molecular Biology to International Agriculture，CAMBIA)实验室在全世界公开交流使用的载体)的基础上改造而来，在多克隆位点处以相反的方向分别构建了一个GUS基因和EGFP基因，载体图及多克隆位点等信息见图3。用HindIII、BamHI双酶切DX2181，酶切产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司生产)回收，电泳检测其酶切完整性，置于-20℃冰箱保存。

(2)酶切EnP2及相应缺失片段的TA克隆质粒。用HindIII、BamHI双酶切经过测序为正确的EnP2及相应缺失片段的TA克隆质粒，酶切产物用0.8％琼脂糖电泳分离，然后目标带用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司生产)回收，电泳检测其酶切完整性，置于-20℃冰箱保存。

(3)将酶切回收的EnP2及相应缺失片段构建到载体DX2181上(见附图4)，电转化入大肠杆菌DH5α。酶切检测与测序后将构建好的载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105菌株(该菌株为商业化的农杆菌菌株)，构成可用于转化的工程菌株。然后通过农杆菌介导的遗传转化法(林拥军等，2002)转化水稻品种“中花11”。

实施例4：农杆菌介导的遗传转化

农杆菌介导的遗传转化方法主要参照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法(林拥军等，2002)。转化受体为水稻品种″中花11″的成熟种子所诱导产生的胚性愈伤组织。经过预培养、侵染、共培养、筛选得到具有潮霉素抗性的愈伤，再经过分化、生根、练苗和移栽，得到转基因植株。本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基配制过程中所涉及到得的主要试剂的名称及缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N₆max(N₆大量元素成分溶液)；N₆mix(N₆微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N₆培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

硝酸钾(KNO₃)            28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)      4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)       4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)     1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)     1.66g

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制：

碘化钾(KI)            0.08g

硼酸(H₃BO₃)           0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)   0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)   0.15g

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

3)铁盐(Fe_2-EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)：

将3.73克乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)：

烟酸(Nicotinic acid)        0.1g

维生素B1(Thiamine HCl)      0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl)    0.1g

甘氨酸(Glycine)             0.2g

肌醇(Inositol)              10g

加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(按照10X浓缩液配制)：

硝酸铵(NH₄NO₃)        16.5g

硝酸钾(KNO₃)          19.0g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)    1.7g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)   3.7g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)    4.4g

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(按照100X浓缩液配制)：

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)    2.23g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)    0.86g

硼酸(H₃BO₃)            0.62g

碘化钾(KI)             0.083g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)  0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)    0.0025g

氯化钴(CoCl₂·6H₂O)    0.0025g

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

称取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

称取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取IAA 100mg，用1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

称取AS 0.392g，加入DMSO 10ml溶解，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液配制：

称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同)      100ml

N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)     10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10ml

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10ml

2，4-D贮存液(取上述制备好的)                2.5ml

脯氨酸(Proline)                             0.3g

CH                                          0.6g

蔗糖                                        30g

Phytagel                                    3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

N6max母液(10X)         100ml

N6mix母液(100X)        10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)   10ml

维生素贮存液(100X)     10ml

2，4-D贮存液           2.0ml

脯氨酸                 0.5g

CH                     0.6g

蔗糖                   30g

Phytagel               3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X)        12.5ml

N6mix母液(100X)       1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)  2.5ml

维生素贮存液(100X)    2.5ml

2，4-D贮存液          0.75ml

CH                    0.15g

蔗糖                  5g

琼脂粉                1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X)    12.5ml

N6mix母液(100X)   1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)    2.5ml

维生素贮存液(100X)      2.5ml

2，4-D贮存液            0.75ml

CH                      0.2g

蔗糖                    5g

琼脂粉                  1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X)          5ml

N6mix母液(100X)         0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)    0.5ml

维生素贮存液(100X)      1ml

2，4-D贮存液            0.2ml

CH                      0.08g

蔗糖                    2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。使用前加入1ml无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X)         25ml

N6mix母液(100X)        2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)   2.5ml

维生素贮存液(100X)     2.5ml

2，4-D贮存液           0.625ml

CH                     0.15g

蔗糖                   7.5g

琼脂粉                 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50mg/ml)和400微升CN(250mg/ml)分装倒入培养皿中(25ml/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400mg/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250mg/l)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X)    25ml

N6mix母液(100X)   2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)    2.5ml

维生素贮存液(100X)      2.5ml

6-BA贮存液              0.5ml

KT贮存液                0.5ml

NAA贮存液               50微升

IAA贮存液               50微升

CH                      0.15g

蔗糖                    7.5g

琼脂粉                  1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。使用前溶解培养基，250微升HN(50mg/ml)250微升CN(250毫g/ml)，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X)        100ml

N6mix母液(100X)       10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)  10ml

维生素贮存液(100X)    10ml

6-BA贮存液            2ml

KT贮存液              2ml

NAA贮存液             0.2ml

IAA贮存液             0.2ml

CH                    1g

蔗糖                  30g

Phytagel              3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X)        50ml

MSmix母液(100X)       5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)  5ml

维生素贮存液(100X)    5ml

蔗糖                  20g

Phytagel              3g

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)愈伤诱导

a.将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

b.用灭菌水洗种子4-5次；

c.将种子放在诱导培养基上；

d.将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4)农杆菌培养

a.在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(该菌株购自CAMBIA公司商业化的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

b.将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

5)农杆菌侵染

a.将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

b.调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

c.将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

d.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸于；然后放在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

6)愈伤洗涤和选择培养

a.灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

b.浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

c.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

d.转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

7)分化

a.将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

b.转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(1500-2000Lux)下培养，培养温度26℃。

8)生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照(1500-2000Lux)下培养2-3周，培养温度26℃。

9)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

实施例5：PCR法检测转基因阳性植株

转化苗移入温室后，待其返青，然后分单株取1-2cm幼嫩叶片，抽提其基因组DNA为模板，用PCR法检测阳性植株。扩增片段为报告基因gus的部分片段，大小为699bp。引物序列为GUS-F：GGGCGAACAGTTCCTGATTA，GUS-R：AACGTATCCACGCCGTATTC。PCR反应条件：94℃5min，94℃50sec，57℃40sec，72℃50sec，30个循环，72℃7min。PCR产物经0.8％琼脂糖胶电泳检测。通过此法，可剔除阴性植株。

小量叶片基因组DNA的提取方法：取适量幼嫩叶片，加800μl 1.5×CTAB研磨，转入1.5ml离心管中；65℃水浴30min；加入600μL氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)上下颠倒数次(约15min)，下层液相呈深绿色为止；室温下12000r/min离心10min；取500μL上清于一新1.5ml离心管，加入预冷的95％乙醇1mL，混匀后置-20℃，30min；室温下12000r/min离心10min，去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100μL ddH₂O溶解，备用。

实施例6：GUS组织染色法分析EnP2候选片段及相应缺失片段各种组织中的表达模式

分别取经PCR检测(参考实施例5的方法)为阳性的EnP2-GUS转化植株(10株以上)的根、叶片、叶鞘、茎杆、颖壳、花、种子切成约0.5CM长度的适当大小，浸入约200μl的GUS染液，37℃过夜，然后用75％浓度的酒精脱色，观察是否有蓝色出现。染色液的配方参照Jefferson等报道的方法(Jefferson等，1987)。结果表明：EnP2候选片段仅在转化植株的胚乳表达，在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达(见附图5)。这些结果证实，EnP2为一个胚乳特异表达的启动子。

用同样的办法分析了EnP2的系列缺失片段驱动下的GUS在各种组织中的表达模式(见图6)。结果表明：启动子EnP2-967、EnP2-771、EnP2-591、EnP2-281、EnP2-186、EnP2-155均具有独立的启动基因表达的功能，并且在转化植株中的表达模式与EnP2相同，即仅在胚乳表达，不过表达量各有区别。同时发现，由EnP2-155进一步截短的EnP2-98则不再具有独立的启动基因表达的功能，在各个组织中均未检测到表达。

实施例7：启动子EnP2及相应缺失片段胚乳组织GUS活性定量检测

取EnP2及相应缺失片段经GUS组织化学染色为阳性(参考实施例6)植株及转空载体DX2181植株的T0代种子，统一播种。待其开花受精后7天、14天、21天时取胚乳组织，抽提其总蛋白，然后测定其GUS活性(见图7)。具体方法参考Bradford及Jefferson等报道的方法(BradfordM，1976；Jefferson等，1987)。结果表明：所有启动子片段(除EnP2-98外)和阴性对照DX2181相比，均有显著差异，这和组织化学染色结果是吻合的。较其它片段而言，全长启动子EnP2的表达量最高(在各个发育时期均是如此)，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势。对所有的转化片段来讲，GUS活性在开花受精后7天的表达量都要高于14天和21的表达量；同时从图上可以发现开花受精后7天的GUS活性从EnP2到EnP2-967以及EnP2-281到EnP2-186有一个急剧下降的现象；而开花受精后14天及21天的GUS活性的急剧下降则出现在EnP2-771到EnP2-591。可以据此推测启动子EnP2是一个在胚乳发育前期高量表达的特异表达启动子；在胚乳发育早期1176-967及281-186这两个区段中可能存在控制其表达量的顺式作用元件；在胚乳发育的中后期771-591这个区段中可能存在控制其表达量的顺式作用元件。同时结合GUS组织染色及GUS活性定量检测的结果发现，由EnP2-155进一步截短的EnP2-98则不再具有独立的启动基因表达的功能，说明在从EnP2-155到EnP2-98可能存在控制启动子表达模式的顺式作用元件。

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序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>华中农业大学

<120>一个水稻胚乳特异表达基因的启动子区域的分离克隆及表达模式鉴定

<130>

<141>2010-04-01

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

 

<210>1

<211>1176

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1176)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1176)

<223>

<400>1

gtaactagat gacgttattt gaagtgacaa tgtaaaacaa tattgtaata tatatatttt     60

ggcaacactt ttgatttatg caatataagt agatttctca gtaccaaatg cttgataata    120

ttccaatata tgtacctgca agaatttcta ataaataatt taaaagtaat ttacggccaa    180

attatattta aatttcaata ttttctacct atcttcgcag gcggaagttt tcttttttgc    240

aagcggacga ttcctatttt cgcaggcgga ccggactagc caacgtccgt ctgcgaaaat    300

tatcttcgca ggcggacggc ctccccgcct gcgaagatcg gcgatcttca tagtcgttgg    360

cttacaggcg gacggccgcc ccgcctgcga agaccctttt cggccgcttg cgataatgct    420

tttcctagta gtgcaaattg caacgggaaa agttatagca gacaatattt ctagccttta    480

atttgcaaca tttttcaaca aagtgattat gcgtacgtgc ttcttatgtc catataaata    540

taattccgtg ccttgttaat atatctctgt tatccaactg cctaggcctc tcaagattgc    600

agtacaacaa aaaaaaaaag taggtgaaag actgaacgtg cacatcaaag ctatcttata    660

tatgaatttt gtttttcaga aaactccaat atatgcttga tcaggcacgt atatacagag    720

aacgcacacg ttatttaatt ttctgaatct agtgttgccg ctttctttac tgcatacttt    780

gtagcttgca gagcattctt tttaacaata tttgttctga agtatcattt ttttgtttat    840

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agctacatat ataaaaccac tcattgagga ttgaga                             1176

 

<210>2

<211>967

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(967)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(967)

<223>

<400>2

tatcttcgca ggcggaagtt ttcttttttg caagcggacg attcctattt tcgcaggcgg     60

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attgaga                                                              967

 

<210>3

<211>771

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(771)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(771)

<223>

<400>3

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cactttagtc ttagtagcta catatataaa accactcatt gaggattgag a             771

 

<210>4

<211>591

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(591)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(591)

<223>

<400>4

gcctctcaag attgcagtac aacaaaaaaa aaaagtaggt gaaagactga acgtgcacat     60

caaagctatc ttatatatga attttgtttt tcagaaaact ccaatatatg cttgatcagg    120

cacgtatata cagagaacgc acacgttatt taattttctg aatctagtgt tgccgctttc    180

tttactgcat actttgtagc ttgcagagca ttctttttaa caatatttgt tctgaagtat    240

catttttttg tttatcaaat tggaccacta tacaaaaagc catggaaata aagatcaaaa    300

tatttttgtt gccttccata actatgtgtc tgttagtagt ttatgcattt attttcttgc    360

acggaagaat gaaaatgggt ttaaacaatt aaagagtgtg gtccatatga atccacttta    420

gccaactttt ttttccccag atgatgccta gattagctgt gaatcacaat aaatatttca    480

ttcaaaacca caagctaatc actcatgcta aaagttttgt gtccattctt gaatcactat    540

cactttagtc ttagtagcta catatataaa accactcatt gaggattgag a             591

 

<210>5

<211>281

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(281)

<223>

<400>5

gccttccata actatgtgtc tgttagtagt ttatgcattt attttcttgc acggaagaat     60

gaaaatgggt ttaaacaatt aaagagtgtg gtccatatga atccacttta gccaactttt    120

ttttccccag atgatgccta gattagctgt gaatcacaat aaatatttca ttcaaaacca    180

caagctaatc actcatgcta aaagttttgt gtccattctt gaatcactat cactttagtc    240

ttagtagcta catatataaa accactcatt gaggattgag a                        281

 

<210>6

<211>186

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(186)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(186)

<223>

<400>6

tatgaatcca ctttagccaa cttttttttc cccagatgat gcctagatta gctgtgaatc     60

acaataaata tttcattcaa aaccacaagc taatcactca tgctaaaagt tttgtgtcca    120

ttcttgaatc actatcactt tagtcttagt agctacatat ataaaaccac tcattgagga    180

ttgaga                                                               186

 

<210>7

<211>155

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(155)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(155)

<223>

<400>7

ccagatgatg cctagattag ctgtgaatca caataaatat ttcattcaaa accacaagct     60

aatcactcat gctaaaagtt ttgtgtccat tcttgaatca ctatcacttt agtcttagta    120

gctacatata taaaaccact cattgaggat tgaga                               155

 

<210>8

<211>98

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(98)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(98)

<223>

<400>8

gctaatcact catgctaaaa gttttgtgtc cattcttgaa tcactatcac tttagtctta     60

gtagctacat atataaaacc actcattgag gattgaga                             98

 

<210>9

<211>718

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(718)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(128)..(610)

<223>

<400>9

actcatgcta aaagttttgt gtccattctt gaatcactat cactttagtc ttagtagcta     60

catatataaa accactcatt gaggattgag aataattaaa attttctgca acaacaatag    120

aaagaaa atg gct ttc atc aag gta gtg ttc tcg gtg ttg ctc ccg gta      169

        Met Ala Phe Ile Lys Val Val Phe Ser Val Leu Leu Pro Val

        1               5                   10

gtt gtc tcc atg ctc gtg gca acg acg aca atg gcg gat cac cgt ggc      217

Val Val Ser Met Leu Val Ala Thr Thr Thr Met Ala Asp His Arg Gly

15                  20                  25                  30

cag gtg gtt tat acc ccc ggg cag cta tgc gct gcc gga cgg ggc tac      265

Gln Val Val Tyr Thr Pro Gly Gln Leu Cys Ala Ala Gly Arg Gly Tyr

                35                  40                  45

ccg atg tac ccg ctg ccc cgc tgc cgg gcg ctg gcg aag cgc cag tgc      313

Pro Met Tyr Pro Leu Pro Arg Cys Arg Ala Leu Ala Lys Arg Gln Cys

            50                  55                  60

gcc ggc ggt gcc gtg gac gag caa gtc cgg caa gac tgc tgc cgg cag      361

Ala Gly Gly Ala Val Asp Glu Gln Val Arg Gln Asp Cys Cys Arg Gln

        65                  70                  75

ctc gcc gcc atc gac gac agc ttc tgt agg tgc ccc gcg ctg agc cac      409

Leu Ala Ala Ile Asp Asp Ser Phe Cys Arg Cys Pro Ala Leu Ser His

    80                  85                  90

atg ttg gtt gga atg tac aag gag ctc ggt gca ccc gct aaa ggg caa      457

Met Leu Val Gly Met Tyr Lys Glu Leu Gly Ala Pro Ala Lys Gly Gln

95                  100                 105                 110

ccc atg gac gag gtg ttc cct ggc tgc cgg aga ggc gac atg aaa cgc      505

Pro Met Asp Glu Val Phe Pro Gly Cys Arg Arg Gly Asp Met Lys Arg

                115                 120                 125

gtg gcg gcg agc ctc ccg gcg ttt tgc aat gta gac att ccc att ggc      553

Val Ala Ala Ser Leu Pro Ala Phe Cys Asn Val Asp Ile Pro Ile Gly

            130                 135                 140

att ggt ggt gtt tgc tac tgg ctg agt tat cct atg aac ccc gcg act      601

Ile Gly Gly Val Cys Tyr Trp Leu Ser Tyr Pro Met Asn Pro Ala Thr

        145                 150                 155

ggc cac taa gaaatagcta ccttgtgtgt cttgtgtggt acctatataa              650

Gly His

    160

ttagtgtttc cttttgcttg gaaacatata tatgtggtga ataaatgatg aactctgata    710

gtcttatg                                                             718

 

<210>10

<211>160

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>10

Met Ala Phe Ile Lys Val Val Phe Ser Val Leu Leu Pro Val Val Val

1               5                   10                  15

Ser Met Leu Val Ala Thr Thr Thr Met Ala Asp His Arg Gly Gln Val

            20                  25                  30

Val Tyr Thr Pro Gly Gln Leu Cys Ala Ala Gly Arg Gly Tyr Pro Met

        35                  40                  45

Tyr Pro Leu Pro Arg Cys Arg Ala Leu Ala Lys Arg Gln Cys Ala Gly

    50                  55                  60

Gly Ala Val Asp Glu Gln Val Arg Gln Asp Cys Cys Arg Gln Leu Ala

65                  70                  75                  80

Ala Ile Asp Asp Ser Phe Cys Arg Cys Pro Ala Leu Ser His Met Leu

                85                  90                  95

Val Gly Met Tyr Lys Glu Leu Gly Ala Pro Ala Lys Gly Gln Pro Met

            100                 105                 110

Asp Glu Val Phe Pro Gly Cys Arg Arg Gly Asp Met Lys Arg Val Ala

        115                 120                 125

Ala Ser Leu Pro Ala Phe Cys Asn Val Asp Ile Pro Ile Gly Ile Gly

    130                 135                 140

Gly Val Cys Tyr Trp Leu Ser Tyr Pro Met Asn Pro Ala Thr Gly His

145                 150                 155                 160