一种预防顺铂所致肾细胞凋亡及贫血的中药组合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种预防顺铂所致肾细胞凋亡及贫血的中药组合物及其制备方法。该中药组合物的组分包括下列重量份的原料药：人参5-10重量份，黄芪20-30重量份，生地20-30重量份，白术10-15重量份，当归10-30重量份，枸杞子10-15重量份，何首乌10-30重量份，女贞子10-15重量份，茯苓10-15重量份，柴胡6-10重量份，郁金10-15重量份，薏米15-30重量份。其制备方法包括以下步骤：1)将原料药洗净、烘干；2)将原料药用凉水浸泡4-6小时，再在常压下煎煮2-3小时，将所得煎液静置12-28小时，取上清液浓缩成浸膏，制粒、干燥，得到中药组合物。本发明的药物组合物是减轻DDP的肾毒性和血液毒性的有效药物，并且可增强顺铂的抗瘤活性，可配合顺铂在多种恶性肿瘤治疗中使用。

说明书

技术领域

本发明涉及中药组合物及其制备方法，特别是涉及一种用于预防顺铂所致肾细胞凋亡及贫血的中药组合物及其制备方法。

背景技术

顺铂(DDP)是一种广泛应用的抗癌药物。临床研究表明：DDP抗癌作用强，与其他抗癌药物无交叉抗药性等特性，在多种恶性肿瘤的治疗中取得了显著的疗效，它是目前较有希望的一种抗癌药物。但DDP有明显的毒性：

毒性之一：临床应用DDP治疗肿瘤患者常常出现贫血、Hb水平下降，Hb在肿瘤治疗中发挥着不可忽视的作用。有研究发现，Hb有一氧化氮(NO)合成酶抑制剂和NO清除剂的作用，可以减轻NO对血管的扩张作用，降低肿瘤组织的血流量，使肿瘤生长所需的营养来源受限。另有研究发现，Hb可以明显改善肿瘤细胞的乏氧状态，提高肿瘤细胞化疗和放疗的敏感性。因此维持恶性肿瘤放化疗治疗中Hb的正常水平，对提高疗效，改善患者生存质量具有很重要的价值。

目前，临床上对于化疗引起的贫血主要有两种治疗方法：输血与注射重组人红细胞生成素(rHuEpo)。输血是传统的方法，也是缓解贫血最快的方法，但输血有许多危险，如急性输血反应、输血急性肺损伤、菌血症、传播病毒、引起同种免疫和免疫减弱等，因而可能延误病人的治疗或刺激肿瘤生长。大量的研究表明，rHuEpo可有效地改善DDP等化疗引起的贫血，促进红系祖细胞的分化和增殖，同时避免了反复输血及由于输血带来的不良反应，为患者的化疗和康复创造了条件。在贫血纠正的同时，患者的食欲改善，营养物质摄入增加，红细胞生成素亦可部分纠正患者体内的异常氨基酸代谢，从而使患者的营养状况得到改善。但在应用rHuEpo治疗肾性贫血的过程中，也出现了一些不可忽视的问题。如：在开始应用rHuEpo的数周到数月内，大约25％的病人会发生高血压或原有的高血压加重，通常可用降压药物或增加透析超滤得以纠正。此外，在接受rHuEpo治疗的病人中动静脉瘘血栓形成的危险性可能增加。另有试验指出某些案例中，为调节血红素浓度到正常水平需要使用rHuEpo标准剂量的3～5倍，不仅增加了治疗费用也使产生副作用的可能性加大，且并不是在所有患者中血红素浓度等指标都有所改善，有时可能恶化。

毒性之二：DDP进入体内后易于在肾脏外髓的近端小管上皮细胞，特别是S3段蓄积，28％～36％的患者接受初始剂量的顺铂(50～100mg/m²)而引起急性肾功能衰竭，主要表现为肾小管上皮细胞生化和细胞功能紊乱，包括抑制蛋白合成、氧化应激、线粒体损伤、细胞骨架重构、细胞间黏附的变化以及肾小管上皮细胞的凋亡。研究表明，DDP诱导的肾小管上皮细胞凋亡是DDP产生肾毒性的一种重要机制，因此抑制肾小管上皮细胞凋亡是预防和治疗顺铂肾毒性的重要措施，减少顺铂肾毒性的发生，才能更加有利于肿瘤的治疗。

临床实践表明，大剂量DDP治疗多种肿瘤的疗效比小剂量治疗效果更好，但其肾毒性也较大，由于DDP所致肾功能衰竭发生死亡的病例报道时有所见，为此，国内外学者致力于各种预防减轻DDP肾毒性，提高临床疗效的研究，研究表明：氨磷汀、川芎嗪可抑制顺铂引起肾细胞凋亡，对减轻DDP肾毒性有一定的作用。目前，临床对于大剂量DDP肾毒性主要采用水化利尿方法，疗效显著，但因需要静脉点滴液体较多，不少患者难以耐受而中止治疗。

一些中药不仅具有抗肿瘤作用，而且在减轻抗癌药物引起的毒副反应方面具有非常好的效果，采用中医药抗肿瘤及减轻化疗药物副作用的研究在我国已经十分普遍。如中国专利200510002104.7一种用于癌症辅助治疗的中药组合物及其制备方法，公开了是一种用于癌症放疗、化疗辅助治疗的中药组合物，其主要以香菇多糖、山药、鸡血藤辅以茯苓、白术、枸杞子、阿胶和地黄八种中药原料组配，用于减轻放疗、化疗引起的恶心，食欲不振，血象变化等毒副反应，并可增强机体免疫功能和抵抗力。中药复方防治DDP肾毒性的研究不多，杨成雄等采用院方制剂虫草洋参胶囊作为顺铂化疗的肾保护剂，明显改善了肾功能(中国医院药学杂志2007，27(8)：1103-1104)，该制剂中使用的冬虫夏草、西洋参、紫河车等几味中草药。周世文等应用十全大补汤加减方对顺铂所致的肾损伤有明显的防治作用(中国医院药学杂志1996，16(10)：438-440)，该汤剂中使用人参、黄芪、当归、丹参、大黄等。这些中药组方从某些方面虽然减轻了DDP的毒副反应，但对于一些明显的毒副作用如DDP诱发的贫血和肾细胞凋亡针对性不强。

发明内容

本发明提供了一种疗效确切的用于预防DDP所致肾细胞凋亡和贫血，并具有抗癌增效作用的中药组合物。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种预防顺铂所致肾细胞凋亡及贫血的中药组合物，该中药组合物的组分包括下列重量份的原料药：人参5-10重量份，黄芪20-30重量份，生地20-30重量份，白术10-15重量份，当归10-30重量份，枸杞子10-15重量份，何首乌10-30重量份，女贞子10-15重量份，茯苓10-15重量份，柴胡6-10重量份，郁金10-15重量份，薏米15-30重量份。

优选的各原料药的重量配比为：人参5重量份，黄芪20重量份，生地20重量份，白术10重量份，当归10重量份，枸杞子15重量份，何首乌10重量份，女贞子10重量份，茯苓10重量份，柴胡10重量份，郁金10重量份，薏米15重量份。

优选的各原料药的重量配比为：人参10重量份，黄芪30重量份，生地20重量份，白术15重量份，当归10重量份，枸杞子10重量份，何首乌10重量份，女贞子10重量份，茯苓10重量份，柴胡10重量份，郁金10重量份，薏米15重量份。

优选的各原料药的重量配比为：人参5重量份，黄芪20重量份，生地20重量份，白术10重量份，当归30重量份，枸杞子10重量份，何首乌20重量份，女贞子10重量份，茯苓10重量份，柴胡6重量份，郁金15重量份，薏米15重量份。

优选的各原料药的重量配比为：人参5重量份，黄芪20重量份，生地30重量份，白术10重量份，当归10重量份，枸杞子15重量份，何首乌15重量份，女贞子15重量份，茯苓10重量份，柴胡6重量份，郁金10重量份，薏米15重量份。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等，必要时还可加入香味剂、甜味剂及色素等。

本发明的第二个目的是提供一种制备上述预防顺铂所致肾细胞凋亡及贫血的中药组合物的方法。

本发明所提供的制备方法，可包括以下步骤：

1)将原料药洗净、烘干；

2)将原料药用凉水浸泡4-6小时，再在常压下煎煮2-3小时，将所得煎液静置12-28小时，取上清液浓缩成浸膏，制粒、干燥，得到预防顺铂所致贫血的中药组合物。

本发明中药组合物还涵盖所有适宜的剂型。该中药组合物可以制成胶囊、水丸、片剂、颗粒剂、粉剂、口服液、注射液等任何一种制剂学上可接受的药物形式，优选为胶囊或水丸。

本发明药物组合物的推荐剂量为成人(按60kg体重计算)每日135g，相当于2.25g生药/日/kg体重。

动物实验结果证明：本发明的药物能预防顺铂所致肾细胞凋亡的发生，还通过健脾益气补肾活血的方法预防顺铂所致贫血的发生，效果显著，且不影响顺铂的抗瘤活性，与DDP同用可从根本上达到增效减毒的目的，且无不良反应及副作用。本发明的各组分均为常见中草药，成本低，在减轻了患者病痛的同时，还降低了患者的经济负担。此外，该药具有服用方便，生产成本低廉的优点，便于进行推广应用。本发明将在顺铂所致肾细胞凋亡及贫血的预防中发挥巨大作用。

附图说明

图1显示肾皮质细胞凋亡变化的比较

图2显示正常对照组肾组织切片(HE10×40)

图3显示DDP组肾组织切片(HE10×10)

图4显示中剂量中药组肾组织切片(HE 10×20)

图5显示正常对照组肾皮质细胞(TEM×5000)

图6显示DDP组肾皮质细胞(TEM×5000)

图7显示注射7天时DDP组肾皮质细胞(TEM×6000)

图8显示注射7天时DDP组肾皮质细胞(TEM×5000)

图9显示注射7天时DDP组肾皮质细胞(TEM×6000)

图10显示注射7天时中剂量中药组近曲小管(TEM×4000)

具体实施方式

临床上应用顺铂化疗的患者常常表现头晕目眩，周身乏力，气短懒言，面色萎黄，腰膝酸软，小便减少，下肢水肿，食欲减退，恶心呕吐，舌质淡或淡红，脉多沉细。从中医角度分析这是由于化疗毒性药物攻伐肿瘤同时损伤脾胃，累及肾阳，运化失常，肾髓失养，血液生化源泉不充，升降失调，清浊不分，清气不升，浊阴不降。治疗宜于健脾益气，温肾壮阳，调补脾肾，补充肾髓，运化水谷，生化血液，升清降浊。

本发明在祖国传统医学的基础上，结合现代药理学研究技术，对筛选出的具有健脾益气、补肾活血的作用的中草药物合理配伍，获得了一种预防顺铂所致肾细胞凋亡及贫血的中药组合物。在复方组配过程中，需要特别考虑各原料药物之间的协同性，形成了疗效确切且稳定性良好的中药组方。

本发明提供的中药组合物的组分包括下列重量份的原料药：人参5-10重量份，黄芪20-30重量份，生地20-30重量份，白术10-15重量份，当归10-30重量份，枸杞子10-15重量份，何首乌10-30重量份，女贞子10-15重量份，茯苓10-15重量份，柴胡6-10重量份，郁金10-15重量份，薏米15-30重量份。

在本发明药组合物中，使用人参、黄芪、当归、何首乌补益气血，枸杞子、生地、女贞子补肾填精生血，白术、茯苓、薏米健脾利湿，郁金、柴胡疏肝理气，使气血流通，调和肝脾以促进后天化源，正方合用，明显减轻了DDP诱发的贫血和肾细胞凋亡。其中，单味药的药性功用分别为：

人参：人参意在实全身元气于化疗之先，以增强机体对化疗药物的耐受性、适应性。人参具有促进免疫功能、抗肿瘤及降血糖作用，人参还能促进造血功能，并有抗疲劳、兴奋中枢神经等作用。

黄芪：黄芪具有益气补肾、利水脱毒、扶正祛邪的功效。黄芪中富含的黄芪皂甙、黄芪多糖、异黄酮类化台物及硒元素等，能清除自由基.清除过氧化脂质，减轻过氧化物酶对细胞膜的损害，因而能提高肾脏抗氧化能力，改善脂质异常所造成的进行性肾损害，阻止肾小球硬化及功能改变；黄芪含21种氨基酸，参与机体多种代谢，其中谷氨酸、甘氨酸是体内合成谷胱甘肽的前体物质，谷胱甘肽作为重金属清除剂及抗氧化剂，能降低顺铂的肾毒性，但不降低其抗瘤活性；黄芪可通过改变机体环核苷酸水平，抑制磷酸二脂酶.保护及双向调节T细胞和B细胞等环节来增强机体的非特异性免疫功能，调节体液免疫和促使细胞免疫趋向于正常，因而能通过免疫修饰和免疫识别减少血浆蛋白一顺铂复合物在肾内的沉积.减少肾脏系膜区的免疫复合物.减轻肾脏病理损害；黄芪具利尿作用，能增加肾血流量，反馈性的抑制肾素一血管紧张素一醛固酮系统，提高肾小管细胞的内在反应性，增加尿量，促进氯化物的代谢，达到改善肾功能的目的。此种作用可能与黄芪所含的甜菜碱、芒柄花素有关。

人参配黄芪能提高机体免疫功能，促进造血功能，皆有抗疲劳、抗缺氧、抗肿瘤、抗衰老作用。

生地：生地具有调节免疫功能能明显提高淋巴细胞DNA和蛋白质的合成，对活性淋巴细胞的白细胞介素-2(IL-2)的产生有明显的增强作用，使低下的细胞免疫功能增强，能保护由于使用了环磷酰胺和地塞米松而引起免疫抑制，其有效成分为多糖类。生地对麻醉犬有降低血压、改善肾功能、降低肾性高血压的作用，其作用机制可能与改变cAMP、cGMP的比值而引起血压下降有关。生地有弱的利尿作用，其利尿机制与强心和扩张肾血管有关，其有效成分为醇苷及其衍生物。生地具有刺激骨髓，增加红细胞、血红蛋白、血小板促进造血细胞功能的作用；生地还有抗肿瘤、抗炎、镇静和促进大鼠肝、肾组织蛋白合成的作用。总之，本品具有止血、强心、利尿、降血糖、抗炎、保肝等作用。

白术：白术具有保肝、促进免疫功能、抗肿瘤及降血糖作用，白术能抗溃疡和促进胃肠蠕动。故配合治疗贫血、糖尿病、肿瘤等有较好疗效。白术能抑制肾小管对电解质和水的吸收而起到利尿作用

当归：当归能改善家兔肾脏缺血后肾小球滤过功能和肾小管重吸收功能，减轻肾损害，促进肾小管病变的恢复。当归有效成分为L-苹果酸钠，L-苹果酸钠可与DDP反应生成氨基铂，能使DDP失去肾毒性，而不影响其抗瘤活性。当归可提高组织SOD活性，清除氧自由基，降低正常及缺血缺氧小鼠脑、肝组织中脂褐质含量和线粒体H₂O₂生成，抑制血小板MDA的生成，提高老年小鼠脑、肝SOD水平，降低老年小鼠脑脂褐质含量，提高老年小鼠的DNA损伤修复能力，延长家蚕、人胎肾细胞和小鼠肾细胞生存时间，提高大鼠耐缺氧能力，拮抗维生素E缺乏性雏鸡脑病，延长其寿命。当归与黄芪配伍有良好的协同作用，具有气血双调、补心益气、养血活血之功效。

枸杞子：枸杞具有良好的抗氧化、延缓衰老、促进免疫、抗辐射损伤、降血脂等作用，一般认为，枸杞子中含有的枸杞多糖是其发挥作用的主要成分，对枸杞多糖的抗氧化活性研究结果表明，枸杞多糖清除羟基自由基、烷基自由基、DPPH自由基能力与Vc接近。枸杞多糖对过氧化氢引起的小鼠睾丸细胞DNA氧化损伤具有明显的保护作用，对氧化应激所致的睾丸细胞DNA损伤具有抑制作用。枸杞多糖可明显提高小鼠体内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性以及显著降低丙二醛和脂褐素的含量。枸杞不同成分的抗氧化能力依次为枸杞干果＞枸杞多糖＞枸杞渣＞甜菜碱。枸杞多糖具有调节细胞免疫和体液免疫的功能，其主要作用表现在对T、B淋巴细胞增殖、T细胞亚群、CTL、NK和M等具有明显的调节作用，对IL-2、IL-6和TNF等细胞因子的产生具有促进作用。枸杞子在抗肿瘤方面也具有重要的作用，枸杞多糖可以简化淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)的细胞诱导和降低IL-2用量，可以增强免疫功能，减轻放化疗副作用，可以促进造血功能，纠正造血紊乱，对钴60照射有对抗作用，并对放疗原发性肺癌有增敏效应

何首乌：何首乌可提高组织SOD活性，清除氧自由基，降低正常及缺血缺氧小鼠脑、肝组织中脂褐质含量和线粒体H₂O₂生成，抑制血小板MDA的生成，提高老年小鼠脑、肝SOD水平，降低老年小鼠脑脂褐质含量，提高老年小鼠的DNA损伤修复能力，延长家蚕、人胎肾细胞和小鼠肾细胞生存时间，提高大鼠耐缺氧能力，拮抗维生素E缺乏性雏鸡脑病，延长其寿命。何首乌可增强机体免疫，拮抗可的松和环磷酰胺的免疫抑制效应，增强正常和疾病模型小鼠的抗疲劳、抗辐射和抗应激能力。

女贞子：女贞子提取液具有明显的抗氧化、抗衰老作用，女贞子多糖能使衰老模型小鼠肝、肾组织中MDA下降，提高SOD及谷胱甘肽过氧化物酶的活力，使脑组织中脂褐质下降。女贞子多糖也可以通过清除·OH，提高SOD及谷胱甘肽过氧化物酶的活力而发挥抗脂质过氧化及抗衰老作用。女贞子中的环烯醚萜类化合物有较强的抗氧化作用，能抑制自由基诱导的红细胞溶血。女贞子提取物对A548等肿瘤细胞有抑制作用，其抗肿瘤作用与其具有抑制肿瘤细胞逆转录酶及多种DNA聚合酶的作用有关。女贞子对特异性和非特异性免疫均有调节作用，女贞子水提液能提高T淋巴细胞的功能，促进PHA、ConA和PWM引起的淋巴细胞增殖。

茯苓：茯苓能抑制肾小管对电解质和水的吸收而起到利尿作用。茯苓也可增强机体免疫，拮抗可的松和环磷酰胺的免疫抑制效应，增强正常和疾病模型小鼠的抗疲劳、抗辐射和抗应激能力。茯苓多糖能不同程度增加老年人血清中T-SOD和Cu-SOD活性，降低MDA含量，具有抗寒、抗疲劳及抗衰老作用。

柴胡：柴胡具有疏散退热、疏肝解郁使气血流通，调和肝脾等功效。柴胡的主要有效成分为柴胡皂苷和挥发油。近代药理研究表明，柴胡具有保肝、提高免疫力、抗肿瘤等作用。

郁金：郁金具有活血行气止痛、清心解郁、利胆退黄、凉血止血之功效。近代药理研究表明，郁金具有保肝、抗自由基损伤、抗癌、提高免疫力作用。

薏米：薏米是我国民间传统的中药，有健脾、补肺、消炎、利尿、渗湿、排脓、镇症和止痛之效。近年来的实验证明，薏米中的薏米酯是一种抗癌物质，对癌细胞有抑制作用，薏米中含有药用价值很高的薏八醇及β-γ，2种谷甾醇，这些特殊成分，也是薏米具有防癌作用的奥秘所在。

本发明所提供的制备方法，将上述原料药按方称取后，用凉水浸泡4-6小时，再在常压下煎煮2-3小时，将所得煎液静置12-28小时，取上清液浓缩成浸膏，制粒、干燥，即得到预防顺铂所致肾细胞凋亡及贫血的中药组合物。

以下以具体实施例进一步说明本发明。下述实施例1-4采用本发明的最佳实验方案，本领域的普通技术人员能够依据本发明公开的内容显而易见地想到一些雷同、替代方案，均应属于本发明的公开内容。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、制备预防顺铂所致贫血的中药组合物

用本发明的方法制备预防顺铂所致贫血的中药组合物，具体方法包括以下步骤：

1)称取原料药：人参50g，黄芪200g，生地200g，白术100g，当归100g，枸杞子150g，何首乌100g，女贞子100g，茯苓100g，柴胡100g，郁金100g，薏米150g。

2)将原料药洗净、烘干。

3)将原料药用凉水浸泡5小时(4-6小时均可)，再在常压下煎煮2.5小时(2-3小时均可)，将所得煎液静置20小时(12-28小时均可)，取上清液浓缩成浸膏，制粒、干燥，装入胶囊或制成水丸，得到预防顺铂所致贫血的中药组合物。

实施例2、制备预防顺铂所致贫血的中药组合物

用本发明的方法制备预防顺铂所致贫血的中药组合物，具体方法包括以下步骤：

1)称取原料药：人参100g，黄芪300g，生地200g，白术150g，当归100g，枸杞子100g，何首乌100g，女贞子100g，茯苓100g，柴胡100g，郁金100g，薏米150g。

2)将原料药洗净、烘干。

3)将原料药用凉水浸泡4小时，再在常压下煎煮3小时，将所得煎液静置28小时，取上清液浓缩成浸膏，制粒、干燥，制成水丸，得到预防顺铂所致贫血的中药组合物。

实施例3、制备预防顺铂所致贫血的中药组合物

用本发明的方法制备预防顺铂所致贫血的中药组合物，具体方法包括以下步骤：

1)称取原料药：人参50g，黄芪200g，生地200g，白术100g，当归300g，枸杞子100g，何首乌200g，女贞子100g，茯苓100g，柴胡60g，郁金150g，薏米150g。

2)将原料药洗净、烘干。

3)将原料药用凉水浸泡6小时，再在常压下煎煮2小时，将所得煎液静置12小时，取上清液浓缩成浸膏，制粒、干燥，装入胶囊，得到预防顺铂所致贫血的中药组合物。

实施例4、制备预防顺铂所致贫血的中药组合物

用本发明的方法制备预防顺铂所致贫血的中药组合物，具体方法包括以下步骤：

1)称取原料药：人参50g，黄芪200g，生地300g，白术100g，当归100g，枸杞子150g，何首乌150g，女贞子150g，茯苓100g，柴胡60g，郁金100g，薏米150g。

2)将原料药洗净、烘干。

3)将原料药用凉水浸泡5.5小时，再在常压下煎煮2.8小时，将所得煎液静置24小时，取上清液浓缩成浸膏，制粒、干燥，制成水丸，得到预防顺铂所致贫血的中药组合物。

实验一、本发明的药物组合物对DDP抗瘤活性的影响

本发明的药物组合物推荐剂量为成人(按60kg体重计算)每日135g，相当于2.25g生药/日/kg体重。实验设三个剂量组，相当于人体推荐量的5倍、10倍、15倍，即每日11.25g生药/kg、22.5g生药/kg、33.75g生药/kg分别为低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组。

(一)实验动物与试剂

实验动物：昆明种小鼠，各半，体重18-22g，购自河北省实验动物中心。

试剂：DDP：注射剂，山东德州制药厂生产。

瘤株：S180型，购自河北省实验动物中心实验动物研究室。

(二)本发明的药物组合物对DDP抗肿瘤作用的试验

昆明鼠腹腔接种S180复苏，第6天取腹水，调细胞浓度为1×10⁸个/mL，按常规方法，分别给50只昆明小鼠接种该瘤液0.2mL，于右前肢腋部皮下，24h后将50只小鼠随机分成5组，生理盐水组，DDP组，低剂量中药组，中剂量中药组，高剂量中药组。生理盐水组一次性注射等容积生理盐水，DDP及三个剂量中药组一次性注射DDP 8mg/kg，同时三个剂量中药组用中药煎剂灌胃，接种瘤液后7天处死小鼠，摘取瘤组织并称重，计算瘤重抑制率。

(三)、结果及分析

参见表1。

表1本发明的药物组合物对DDP抗瘤活性的影响

  组别  瘤重(g)  瘤重抑制率(％)  生理盐水组  1.923±0.68  0  DDP组  0.465±0.23^**  75.8％  低剂量中药组  0.421±0.16^**  76.5％  中剂量中药组  0.382±0.19^**  78.16％  高剂量中药组  0.375±0.26^**  78.42％

由表1可以看出，给荷瘤S180小鼠一次注射DDP 8mg/kg，瘤重抑制率为75.8％，非常显著地小于生理盐水组瘤重(P＜0.01).而DDP+各中药组较单用DDP组瘤重略轻，但差异无显著性(P＞0.05)。

化疗药物毒副作用的预防应以不减弱其抗肿瘤效能为前提。各中药组的瘤体平均重量均小于单用顺铂组，但两者无显著性差异(P＞0.05)。各中药组及单用顺铂组的瘤体平均重量均明显轻于不用顺铂的生理盐水组(P＜0.01)。上述实验结果表明，中药的运用没有降低甚至可能增强了顺铂的抗瘤活性。高剂量中药组的瘤重稍高于中剂量中药组，但两者没有显著性差异(P＞0.05)。说明本发明的药物组合物不影响DDP的抗瘤活性。

实验二、本发明药物组合物在预防顺铂所致贫血的效果实验

本发明药物组合物的推荐剂量为成人(按60kg体重计算)每日135g，相当于2.25g生药/日/kg体重。实验设三个剂量组，相当于人体推荐量的5倍、10倍、15倍，即每日11.25g生药/kg、22.5g生药/kg、33.75g生药/kg分别为低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组。

(一)实验动物与试剂

实验动物：雄性SD大鼠，体重180-220g，购自北京医科大学实验动物中心，合格证号Scxk 11-00-0004。

试剂：DDP注射剂，山东德州制药厂生产。

(二)实验动物分组与处理

实验动物常规喂养一周后，随机分为5组，正常对照组(n＝12)、DDP组(n＝12)、低剂量中药组(n＝12)、中剂量中药组(n＝12)，高剂量中药组(n＝12)。顺铂组和三个中药组一次性尾静脉注射DDP 8mg/kg，正常对照组注射等容积生理盐水，注射DDP当天起，三个中药组用中药煎剂灌胃，灌胃体积为1mL/100g体重，每日一次，连续灌胃21天，分别于第7天、第21天各组动物在清醒状态下心脏取血1.5-2毫升，检测大鼠全血血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)及血清红细胞生成素(Epo)、尿素氮(BUN)的含量。在整个实验过程中，每日记动物饮水量，定期测体重。

(三)统计学分析：采用SPSS进行统计分析，试验数据均以均数±标准差表示。

(四)、结果及分析

1、一般状况

顺铂组大鼠注射顺铂当天或第二天开始出现摄食明显减少，少动闭眼，精神萎靡，卷曲拱背、形体消瘦、毛色失泽。正常对照组生长良好，无上述现象。中剂量中药组基本无上述现象。低剂量中药组和高剂量中药组症状较轻。

2、本发明的药物组合物对DDP引起大鼠全血Hb(g/L)、RBC数目变化的影响

参见表2数据。由表2可见，第21天，DDP组大鼠的Hb、RBC明显低于正常对照组(p＜0.01)，中剂量中药组的Hb、RBC明显高于DDP组(p＜0.05)，低剂量中药组及高剂量中药组的Hb、RBC虽高于DDP组，但与DDP组无显著差异(p＞0.05)。

该项动物实验表明，本发明的中剂量药物组合物可明显减轻DDP引起的大鼠Hb、RBC降低，故可以减轻顺铂引起的大鼠的贫血。

表2各组大鼠全血Hb含量变化的比较

^*与正常组相比    ^**P＜0.01    ^*P＜0.05

#与DDP组相比    ##P＜0.01    #P＜0.05

3、本发明的药物组合物对DDP引起大鼠血清Epo变化的影响

参见表3数据。由表3可见，第7天，DDP组大鼠血清Epo明显低于正常对照组(P＜0.05)，中剂量中药组大鼠血清Epo明显高于DDP组(P＜0.05)，第21天，DDP组大鼠血清Epo明显高于正常对照组(P＜0.05)，中剂量中药组大鼠血清Epo明显低于DDP组(P＜0.05)，低剂量中药组及高剂量中药组大鼠血清Epo虽然与DDP组不同，但差异无显著性(P＞0.05)。

该项动物实验表明，本发明的中剂量药物组合物可明显升高DDP所致大鼠血清Epo的降低，减轻DDP对Epo产生的抑制作用，从而抑制DDP诱发的贫血。

表3各组大鼠BUN含量变化的比较

^*与正常对照组相比  ^**P＜0.01  ^*P＜0.05

#与DDP组相比  ##P＜0.01  #P＜0.05

实验二结果表明，经口给予大鼠不同剂量的本发明的药物组合物可明显减轻DDP所致大鼠的贫血。中剂量中药组Hb、RBC明显高于低剂量中药组和高剂量中药组，证实了在一定范围内剂量与药效呈平行关系这一药效学的基本规律。提示适当剂量的本发明的药物组合物才能更有效地减轻DDP所致大鼠贫血。第7天时，中剂量中药组大鼠血清Epo明显高于DDP组，说明中药能明显减轻DDP对Epo产生的抑制作用，第21天以后中剂量中药组大鼠的血清Epo水平比DDP组明显下降Hb、RBC比DDP组明显升高，提示中药通过减轻DDP对Epo产生的抑制作用，而减轻了DDP诱发的贫血，刺激了骨髓红细胞的生长。

实验三、本发明药物组合物在预防顺铂所致肾细胞凋亡发生的效果

(一)实验动物与试剂

实验动物：雄性SD大鼠，体重180-220g，由北京医科大学实验动物中心提供，合格证号Scxk 11-00-0004。

试剂：DDP注射剂，山东德州制药厂生产

(二)实验动物分组与处理

实验动物常规喂养一周后，随机分为5组，正常对照组(n＝8)、DDP组(n＝8)、低剂量中药组(n＝8)、中剂量中药组(n＝8)，高剂量中药组(n＝8)。顺铂组和三个中药组一次性尾静脉注射DDP 8mg/kg，正常对照组注射等容积生理盐水，注射DDP当天起，三个中药组用中药煎剂灌胃，灌胃体积为1ml/100g体重，每日一次，连续灌胃7天，于第7天各组动物在清醒状态下断头取血，将其收集于不含抗凝剂的小管中，待血液凝固后，离心10分钟(3000转/分)。取血清用于检测大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)的含量。同时迅速剖腹取出双侧肾脏，去包膜，留取肾组织于(1)10％甲醛中固定，石蜡包埋切片，HE染色，光境观察。(2)2.5％戊二醛中固定用于透射电镜检查。(3)70％冷乙醇中固定用于流式细胞检测。(4)其余标本迅速冷藏于-80℃冰箱中备检测其他指标。在整个实验过程中每日记录动物饮食量，定期测体重。

(三)统计学分析：采用SPSS进行统计分析，试验数据均以均数±标准差表示。

(四)实验结果及分析

1、一般状况：

顺铂组大鼠注射顺铂当天或第二天开始出现摄食明显减少，少动闭眼，精神萎靡，卷曲拱背、形体消瘦、毛色失泽。正常对照组生长良好，无上述现象。中剂量中药组基本无上述现象。低剂量中药组和高剂量中药组症状较轻。

2、本发明的药物组合物对DDP引起大鼠血清BUN、Cr含量变化的影响

实验数据参见表4。从表4可见，DDP组大鼠血清BUN、Cr含量均明显高于正常对照组(P＜0.01)，中剂量中药组大鼠血清BUN、Cr含量明显低于DDP组(P＜0.05)。低、高剂量中药组大鼠血清BUN、Cr含量虽然低于DDP组，但无显著性差异(P＞0.05)。

该项动物实验表明，本发明的中剂量药物组合物可明显减轻DDP引起的大鼠BUN、Cr降低，故可以减轻顺铂引起的大鼠的肾毒性。

表4各组大鼠血清BUN、Cr含量的变化

  组别  BUN(mmol/L)  Cr(umol/L)  正常对照组  5.47±0.51  45.64±13.86  DDP组  14.83±3.39^**  96.71±17.91^**

  组别  BUN(mmol/L)  Cr(umol/L)  低剂量中药组  13.21±3.24  88.43±21.11  中剂量中药组  9.28±3.26##  72.24±15.32#  高剂量中药组  11.19±3.51  81.97±14.06

与正常对照组比较 ^**p＜0.01，^*p＜0.05与DDP组比较##p＜0.01，#p＜0.05

3、本发明的药物组合物对DDP引起大鼠肾皮质MDA、SOD含量变化的影响

参见表5数据。从表5可以看出，DDP组大鼠肾皮质MDA含量明显高于正常对照组(P＜0.01)，中剂量中药组大鼠MDA含量明显低于DDP组(P＜0.05)，高、低剂量中药组大鼠MDA含量虽然低于DDP组，但无显著性差异(P＞0.05)。

DDP组大鼠肾皮质SOD活性明显低于正常对照组，中剂量中药组SOD活性明显高于DDP组(P＜0.05)；低、高剂量中药组大鼠肾皮质SOD活性虽然高于DDP组，但无显著性差异(P＞0.05)。

该项动物实验表明，本发明的药物组合物可通过升高肾组织SOD活性，降低氧自由基含量来减轻DDP的肾毒性，表明益气健脾补肾方药具有对肾脏的保护功能，抗氧化功能。

表5各组大鼠肾皮质MDA含量、SOD活性的变化

  组别  SOD(Nu/mgprot)  MDA(nmol/mgprot)  正常对照组  441.02±35.7  2.36±0.19  DDP组  372.7±37.5^**  3.18±0.28^**  低剂量中药组  390.5±36.8  3.09±0.23  中剂量中药组  418.64±38.5#  2.86±0.25#  高剂量中药组  403.21±35.9  2.98±0.29

与正常对照组比较 ^**p＜0.01，^*p＜0.05与DDP组比较##p＜0.01，#p＜0.05

4、本发明的药物组合物对DDP引起大鼠肾细胞凋亡的影响

流式细胞检测结果见图1所示，表明：注射DDP后第7天，DDP组大鼠肾皮质细胞凋亡率含量明显高于正常对照组(P＜0.01)，中剂量中药组大鼠肾皮质细胞凋亡率明显低于DDP组(P＜0.05)，高、低剂量中药组大鼠肾皮质细胞凋亡率虽然低于DDP组，但无显著性差异(P＞0.05)。

肾组织光镜观察：参见图2至图4所示。正常对照组大鼠细胞(参见图2)结构正常；DDP组大鼠细胞(参见图3)中，近曲小管上皮细胞脱落、多发、远曲小管上皮细胞脱落，且管腔空化扩张成大泡，间质中有淋巴细胞浸润，肾小管管腔内可见透明管型。低剂量中药组，高剂量中药组上述病理变化均有所减轻，如肾小管扩张明显变小，中剂量中药组(参见图4)基本上看不见上述病变，接近正常组。

肾组织电镜观察：参见图5-图10所示。正常对照组大鼠肾脏细胞(参见图5)结构正常，胞浆无浓缩，核染色质分布均匀，未见细胞有凋亡特征性变化，线粒体丰富，嵴扁平，成层排列，基质均匀分布，溶酶体较多。DDP组大鼠肾近端小管上皮细胞形态结构主要有以下两方面变化：第一，凋亡细胞增多；细胞凋亡可分为三期：初期：核内染色质从弥散状趋向凝聚及趋边化，同时在核膜周围有许多内空的空泡结构(参见图6)。中期：核变小，核内染色质浓缩、密度增高并积聚核膜周边，染色质边聚呈环状，半月状，胞质内线粒体肿胀，部分嵴溶解，膜破损(参见图7)。晚期：核固缩，变小，染色质呈致密的块状或球状，或破碎成多个小块，胞质内线粒体肿胀，呈空泡样，内质网扩张成囊泡状最后形成凋亡小体，凋亡小体形态不规则，有的外被质膜，有的裸露为电子密度高的团块，或内含破损的核染色质及一些变性崩解的细胞器。有些凋亡小体被邻近的细胞所吞噬(参见图8)。第二，近端小管上皮细胞变性，坏死，细胞表面微绒毛受损，胞质内线粒体肿胀，嵴缺损，溶解空泡化，粗面内质网扩张(参见图9)。中剂量中药组大鼠近曲小管上述改变明显减轻，偶见增大的溶酶体(参见图10)。

实验三结果表明：经口给予大鼠不同剂量的本发明的药物组合物可明显减轻DDP所致大鼠的肾损伤、肾细胞凋亡。中剂量中药组大鼠血清BUN、Cr明显低于低剂量中药组和高剂量中药组，证实了在一定范围内剂量与药效呈平行关系这一药效学的基本规律。提示适当剂量的本发明的药物组合物才能更有效地减轻DDP所致大鼠肾毒性。中剂量中药组大鼠MDA含量明显低于DDP组(P＜0.05)，SOD活性明显高于DDP组(P＜0.05)，肾皮质细胞凋亡率明显低于DDP组，电镜、光镜观察也显示中剂量中药组大鼠肾皮质细胞凋亡特征明显减少，肾损伤明显减轻，表明本发明的药物组合物可通过升高肾组织SOD活性，降低氧自由基含量，肾细胞凋亡来减轻DDP的肾毒性。

综合实验结果，说明本发明的药物组合物不是调节机体的某一项指标，而是多靶点集合相关效应，适当剂量(中剂量)的本发明的药物组合物是减轻DDP的肾毒性和血液毒性的有效药物，并且可增强顺铂的抗瘤活性，可配合顺铂在多种恶性肿瘤治疗中使用。