葡萄籽提取物的双频超声辅助提取方法及作为脂肪酶抑制剂的应用

摘要

本发明公开了葡萄籽提取物的双频超声辅助提取方法，属于天然产物提取及用途领域。(1)取葡萄籽，经40～60℃烘干，机械粉碎至20-40目，按照液料比3∶1～13∶1加入60-70％的乙醇；(2)开启双频脉冲超声设备，超声辅助萃取条件如下：超声功率400-800w/1800ml，循环转速10-20r/s，工作/间歇比1、2、3s/s，超声提取时间30-50min，得到的浸提液过滤，浓缩得到浸膏；(3)用乙酸乙酯萃取上述浸膏至有机层无色，冷冻干燥得乙酸乙酯提取物。所得到葡萄籽提取物可以作为脂肪酶抑制剂的应用。与现有的溶剂浸提法相比，超声辅助提取后葡萄籽提取物的提取率升高，提取时间由3h缩短到30min。

说明书

技术领域

本发明属于天然产物提取及用途领域，特别涉及双频超声辅助提取葡萄籽提取物的方法，以及其做为脂肪酶抑制剂的应用。

背景技术

葡萄为葡萄科(Jitaceae)葡萄属(Jitas)的植物，是一种经济价值很高的水果。目前对于葡萄的消费主要集中在鲜食、榨汁、酿酒等。鲜食葡萄的消费人群虽然较多，但食用后遗弃的葡萄皮、籽比较分散，不易集中收集。葡萄经榨汁后剩下许多废渣，以2001年为例，我国每年用于生产加工的葡萄高达200多万吨，可利用的葡萄废弃物约有40多万吨，如何充分利用这些葡萄废弃物，减少污染和降低处理费用，变废为宝，成为关注的热点。

葡萄籽是榨汁、酿酒业的下脚料，资源非常丰富，葡萄籽中主要含多酚类物质，学术界一般认为主要成分是儿茶素类、原花青素类(即缩合鞣质类)，大体上单聚体占11％、寡聚体34％、多聚体55％，低聚体中以儿茶素、表儿茶素和原花青素二聚体B₁、B₂含量最高。大量的研究表明葡萄籽提取物具有多种药理活性，例如抗氧化、清除氧自由基、降低低密度脂蛋白、抗致癌、抗致突变作用、以及保护心血管等作用。目前，对于葡萄籽中活性成分的提取方法主要是传统的有机溶剂浸提法和水提法，这两种方法操作简单，成本小。但耗时长，得率较低，对活性成分有破坏作用。对于葡萄籽提取物活性方面的研究，主要集中于降低心血管疾病发病率、抗肿瘤、抗氧化等方面，关于其作为作为脂肪酶抑制剂的应用以及减肥效果的研究在国内外比较少。

因此需要开发一种葡萄籽提取物的操作简单、提取效率高的方法，探讨其作为脂肪酶抑制剂的应用，研究其作为减肥药品、保健食品的应用。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，提供了一种葡萄籽提取物的脉冲超声辅助提取方法，以及该提取物作为脂肪酶抑制剂的应用。

本发明的技术方案葡萄籽提取物的双频脉冲超声辅助提取方法，按照下述步骤进行：

(1)取葡萄籽，经40～60℃烘干，机械粉碎至20-40目，按照液料比3∶1～13∶1加入60-70％的乙醇；

(2)开启双频超声设备，进行超声辅助萃取，超声条件如下：超声功率400-800W/1800ml，循环转速10-20r/s，双频超声频率为24kHz、35kHz、68kHz三个频率中的任意两两组合；工作/间歇比1、2、3s/s，超声提取时间30-50min，得到的浸提液过滤，浓缩得到浸膏；优选的参数为：超声功率600W/1800ml，循环转速15r/s，工作/间歇比为2s/s，提取30min；，

(3)将上述所得浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色，浓缩萃取液，冷冻干燥得乙酸乙酯提取物。

本发明脉冲超声辅助提取所得到葡萄籽提取物作为脂肪酶抑制剂的应用：葡萄籽提取物对脂肪酶具有较好的抑制活性，具有减轻体重和改善脂质代谢的作用，能显著降低甘油三酯水平。可以用于制成减肥药品、保健食品。

本发明的葡萄籽提取物可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、粘合剂等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的口服剂型，如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、口服液等，可以用于制成减肥药品、保健食品。

本发明的葡萄籽提取物的脉冲超声辅助提取方法，与现有的溶剂浸提法相比，工艺简单、超声辅助提取后葡萄籽提取物的提取率升高，提取时间由3h缩短到30min；葡萄籽提取物对脂肪酶具有较好的抑制活性，具有减轻体重和改善脂质代谢的作用，可以用于制成减肥药品、保健食品。

具体实施方式

下面是本发明的实施例。其中用于评价葡萄籽提取物得率和抑制脂肪酶活性(即抑制率)的测定方法如下：

(1)葡萄籽提取物得率的计算方法：

称量冷冻干燥后得到的乙酸乙酯提取物，计算提取物的得率，得率计算公式如下：

$Y=\frac{m^{\prime }}{m}\times 100\%$

其中：Y-提取物得率，％；m′-提取物重量，g；m-葡萄籽重量，g。

(2)葡萄籽提取物抑制脂肪酶活性(抑制率)的测定：

脂肪酶的酶活力测定采用改进的方法：

(1)猪胰脂肪酶液的制备：精确称取一定量的酶粉，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)配制成浓度为5mg/mL的酶液储于4℃以下的冰箱中备用。

(2)显色剂制备：配制5％醋酸铜溶液，用吡啶调节至pH 6.1，既得脂肪酸显色剂。

(3)显色法测量油酸的浓度和吸光度的关系：配置一系列不同浓度的油酸/苯溶液，分别取4mL于锥形瓶中，加1mL显色剂，磁力搅拌3分钟，油酸分子与Cu²⁺生成绿色的络合物，离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用未加油酸的空白溶液作为参比。以吸光度对油酸浓度作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线。

(4)脂肪酶活性测定：调节恒温摇床至37℃，取3mL 50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，1mL 8％胆盐和1mL三油酸甘油酯于50mL锥形瓶中置摇床内预热10分钟。然后注入0.1mL酶溶液，摇床10分钟，立即加5mL苯，继续搅拌2分钟，终止反应，同时萃取生成的脂肪酸。将溶液转移至离心试管中，在4000r/min下离心10分钟，有机相和水相分层澄清。取上层有机相4mL于10mL离心管中，加1mL显色剂涡旋震荡3分钟，产生的脂肪酸与Cu²⁺生成绿色络合物，4000r/min下离心10分钟。取上层含有脂肪酸铜的苯溶液，用分光光度计在710nm波长下测其吸光度。以同法制备但不含脂肪酶的空白溶液为参比，对照脂肪酸吸光度工作曲线，既可求得脂肪酸的浓度。

(5)脂肪酶酶活力单位定义：在一定条件下，每分钟释放1μmol脂肪酸消耗的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。

按下式计算酶活：

$X=\frac{\mathrm{cv}}{\mathrm{mt}}---(2-1)$

式中：X为脂肪酶活力，U/mg；c为脂肪酸浓度，μmol/mL；v为脂肪酸溶液的体积，mL；m为酶液的用量，mg；t为作用时间，min。

加入脂肪酶抑制剂前后脂肪酶活力的差值与原酶活之比值定义为抑酶活性：

I＝[(X_b-X_a)/X_b]×100％

式中：I-抑制率，％；X_b-抑制前脂肪酶活，U/mg；X_a-抑制后脂肪酶活，U/mg。

按上述脂肪酶的酶活测定方法，在预热前加入定量葡萄籽提取物，测定其剩余酶活即可计算出提取物的抑酶活性。

对比例

不加超声，有机溶剂浸提葡萄籽提取物：通过正交试验并结合单因素试验优选了有机溶剂浸提葡萄籽提取物的最佳工艺参数为：取葡萄籽200g，经50℃烘干，机械粉碎至40目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)、35℃下提取3h，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，将所得浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色，浓缩萃取液，冷冻干燥得到葡萄籽提取物1.44g，其得率为0.72％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为73.65％。

实施例1

取200g葡萄籽，经50℃烘干，机械粉碎至40目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)，提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率400W，循环转速10r/s，工作/间歇比1s/s，双频超声频率为24kHz与35kHz正交组合；超声提取时间30min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.338g，其得率为0.669％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为66.79％。

实施例2

取200g葡萄籽，经50℃烘干，机械粉碎至40目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)，提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率400W，循环转速15r/s，工作/间歇比2s/s，双频超声频率为24kHz与68kHz正交组合；超声提取时间40min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.39g，其得率为0.695％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为68.47％。

实施例3

取200g葡萄籽，经50℃烘干，机械粉碎至40目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)，提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率400W，循环转速20r/s，工作/间歇比3s/s，双频超声频率为24kHz与35kHz正交组合；超声提取时间50min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.456g，其得率为0.728％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为64.39％。

实施例4

取200g葡萄籽，经50℃烘干，机械粉碎至40目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)、提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率600W，循环转速10r/s，工作/间歇比2s/s，双频超声频率为35kHz与68kHz正交组合；超声提取时间50min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.562g，其得率为0.781％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为74.91％。

实施例5

取200g葡萄籽，经50℃烘干，机械粉碎至40目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)、提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率600W，循环转速15r/s，工作/间歇比3s/s，双频超声频率为24kHz与68kHz正交组合；超声提取时间30min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.466g，其得率为0.733％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为76.34％。

实施例6

取200g葡萄籽，经30℃烘干，机械粉碎至30目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)、提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率600W，循环转速20r/s，工作/间歇比1s/s，双频超声频率为24kHz与35kHz正交组合；超声提取时间40min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.512g，其得率为0.756％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为72.85％。

实施例7

取200g葡萄籽，经40℃烘干，机械粉碎至40目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)、提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率800W，循环转速10r/s，工作/间歇比3s/s，双频超声频率为24kHz与68kHz正交组合；超声提取时间40min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.638g，其得率为0.819％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为58.29％。

实施例8

取200g葡萄籽，经50℃烘干，机械粉碎至20目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)、提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率800W，循环转速15r/s，工作/间歇比1s/s，双频超声频率为24kHz与35kHz正交组合；超声提取时间50min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.662g，其得率为0.831％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为60.54％。

实施例9

取200g葡萄籽，经50℃烘干，机械粉碎至40目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)、提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率800W，循环转速20r/s，工作/间歇比2s/s，双频超声频率为24kHz与68kHz正交组合；超声提取时间30min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.574g，其得率为0.787％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为63.67％。

实施例10

取200g葡萄籽，经50℃烘干，机械粉碎至40目，加入70％乙醇1800ml(液料比为9∶1)、提取的同时，施加脉冲超声处理，超声处理条件如下：即超声功率600W，循环转速15r/s，工作/间歇比2s/s，双频超声频率为35kHz与68kHz正交组合；超声提取时间30min，得到的浸提液过滤，浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯萃取至有机层无色。浓缩萃取液，冷冻干燥得葡萄籽提取物1.58g，其得率为0.79％，葡萄籽提取物对脂肪酶活性的抑制率为78.82％。

通过上述实施例可以看出，与对比例的溶剂浸提法相比，施加脉冲超声辅助提取后，葡萄籽提取物的抑制率由73.65％提高到了78.82％；得率由0.72％提高到了0.79％，提取时间由3h缩短到30min。

试验例：本发明葡萄籽提取物对营养型大鼠减肥效果的治疗

试验材料：

SD大鼠，雄性，体重50-70g，清洁级，由江苏大学医学院实验动物中心提供。

基础饲料配方：玉米26％、面粉34％、豆粕24.7％、鱼粉5％、植物油2.3％、首蓓草粉3％、预混料5％，饲料含能量为3398.5kcal/kg。

肥胖造模高脂饲料配方：基础饲料60％、猪油12％、奶粉10％、蛋黄粉5％、蔗糖5％、食盐2％、新鲜黄豆芽125g(5-6％)，饲料含能量4502.6Kcal/Kg，是基础饲料的1.325倍。动物饲料由南京皇佳实验动物饲料有限公司提供。

葡萄籽提取物(GSE)，自制；甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)试剂盒购于上海申能-德赛诊断技术有限公司。奥利司他购于罗氏制药公司。羧甲基纤维素钠等试剂购于国药集团，均为分析纯。

试验方法：

(1)大鼠的饲养与肥胖模型的建立

饲养期间大鼠自由摄食和饮水，饲养环境清洁，明暗周期为12小时，室温22-25℃，相对湿度40-60％，通风良好。取60只雄性SD大鼠，按体重随机分为普食组(10只)和造模组(50只)。普食组投喂基础饲料，造模组投喂高脂饲料。每周称一次体重，造模前基础饲料组大鼠与肥胖饲料组大鼠体重无差异，饲喂7周后，肥胖料组大鼠中有40只大鼠体重超过基础饲料组大鼠平均体重加1.4倍标准差，成模率80％，随机取35只用于减肥实验，随机分为5组，分别为葡萄籽提取物高、中、低剂量组和模型组。基础饲料组中随机取7只为正常对照组。

(2)分组与给药

实验设空白组，模型组，GSE低、中、高剂量组及阳性对照组。GSE悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)中，低、中高剂量组分别灌胃给予GSE10，30，90mg/kg/d，阳性对照组灌胃给予奥利斯他10mg/kg/d，模型组灌胃给予等容积0.5％CMC，空白组不做任何处理，连续4周。

(3)检测指标及试验结果

1)一般形态观察

用药前，3个剂量组、阳性对照组及模型对照组和正常对照组的大鼠毛质白，有光泽。动物行为未见异常，平日饮水、饮食正常，未见稀便、溏便现象，也无死亡现象。

用药后，正常对照组和模型对照组大鼠形态一切正常。GSE三个剂量组和阳性对照组的大鼠毛有轻微结绺，光泽度略有下降，有稀便现象。根据粪便检测结果，推测可能是由于是粪便中脂肪含量高所致。

2)GSE对肥胖大鼠体重的影响

试验方法：每周记录大鼠体重(g)。

试验结果见表1，由表1可以看出各给药组均有有显著的减重作用。用药第一周后，GSE高剂量组与模型对照组相比即有显著差异(p＜0.05)，其他用药组无显著性差异。用药第三周后各用药组都有明显的减肥效果，具有显著性差异(p＜0.05)。用药第四周后，各用药组的体重与模型组相比差异都非常显著(p＜0.01)，而且GSE高剂量组与奥利司他组的体重已低于正常对照组的体重，GSE中剂量组与GSE低剂量组与正常对照组相比也有降低的趋势。提示GSE对营养性肥胖大鼠有明显的减肥效果。

表1GSE治疗后雄性大鼠的体重增长

^△p＜0.05，^△△p＜0.01VS control；^#p＜0.05，^##p＜0.01 VS model；(x±SD，n＝7)

3)GSE对肥胖大鼠体长及肥胖指数(Lee′s)的影响

试验方法：用3％戊巴比妥钠轻度麻醉后测其体长(从鼻尖到肛门的长度)，计算Lee′s指数和体重增长值：Lee′s指数＝体重(g)^1/3×10³/体长(cm)

体重增长值(g)＝给药后每周体重(g)-药前体重(g)

试验结果见表2。肥胖大鼠体长、尾长变化不显著，而Lee′s指数明显增加，表明在单纯肥胖大鼠中体长、尾长并不是衡量肥胖的满意指标，Lee′s指数则能较敏感地反映肥胖的变化。

表2GSE对肥胖大鼠体长、Lee′s的影响

^△p＜0.05，^△△p＜0.01VS control；^#p＜0.05，^##p＜0.01VS model；

奥利司他组和GSE中剂量组Lee′s指数都都显著地低于模型对照组(P＜0.05)，GSE高剂量组大鼠Lee′s极其显著地低于模型对照组(P＜0.01)，而低剂量组与模型组相比没有显著性差异。提示GSE肥胖指数的降低主要是体重的降低，而不是体长的变化。

4)用药第四周肥胖大鼠粪便中的脂肪含量

试验方法：给药最后一周，每天采集各组大鼠粪便，索氏抽提法测粪便中的脂肪含量(g)。

试验结果见表3，其中模型对照组大鼠脂肪摄入量显著高于正常对照组，脂肪排出量也显著高于正常对照组(p＜0.01)；阳性对照组和GSE各给药组大鼠脂肪摄入量与模型组大鼠无差异，但是阳性对照组、GSE高剂量组和GSE中剂量组的脂肪排出量极其高于模型对照组(p＜0.01)，GSE低剂量组脂肪排出量较之模型对照组也明显增高(p＜0.05)，研究结果表明，模型对照组大鼠的脂肪吸收量比各给药组大鼠高，这可能是造成模型对照组体重居高不下的原因之一。各给药组大鼠脂肪排出量高于模型对照组提示GSE具有阻止大鼠吸收脂肪的作用，脂肪在满足大鼠生理需要后，剩余脂肪并不会在体内贮存而是随排泄物排出体外，从而体重趋于减轻。

表3用药第四周肥胖大鼠粪便中的脂肪含量

p＜0.05，^△△p＜0.01VS control；^#p＜0.05，^##p＜0.01VS model；

5)GSE对肥胖大鼠体脂的影响

试验方法：放血后取肾周及附睾周围白色脂肪组织称湿重；计算脂肪系数：

脂肪系数＝肾睾脂肪湿重(g)×100％/体重(g)

试验结果见表4，其中GSE能降低肥胖大鼠体脂含量。GSE给药后，高、中、低剂量组与模型组相比睾脂与脂肪系数皆显著降低。模型对照组的体内脂肪重量及脂肪系数均明显大于正常对照组，其中脂肪重量差异有极显著性(P＜0.01)，脂肪系数具有显著性差异(p＜0.05)，表明肥胖模型成立。各试验组大鼠的体内脂肪重量均明显小于模型对照组，其中GSE给药组与模型对照组的差异均有极其显著性(P＜0.01)。阳性对照组的体内脂肪重量大于模型对照组，差异有极显著性(P＜0.01)；而脂肪系数与模型对照组相比无统计学意义。结果表明受试物具有减轻肥胖模型大鼠体内脂肪堆积的作用。

表4各给药组对肥胖大鼠体脂含量的影响

^△p＜0.05，^△△p＜0.01VS control；^#p＜0.05，^##p＜0.01VS model；

6)GSE对肥胖大鼠血脂水平的影响

试验方法：用药四周后禁食16-20小时，乙醚麻醉，断头取血，3000rpm离心10分钟，分离血清，-80℃存放，待检。全自动生化分析仪测定TG、TC、HDL-C、LDL-C。

试验结果见表5其中，正常对照组与模型对照组的TG差异极其显著(P＜0.01)，TC、HDL-C、LDL-C差异不显著。与模型组相比，GSE低剂量能有明显地降低TG(P＜0.01)，其他用药组无显著性差异；各用药组的TC和HDL-C与模型组无显著性差异；与模型对照组相比，阳性对照组的LDL-C有显著性差异(P＜0.05)，其他用药组无显著性差异。

表5GSE对肥胖大鼠血脂水平的影响

^△p＜0.05，^△△p＜0.01VS control；^#p＜0.05，^##p＜0.01VS model；^*p＜0.05；

以上数据处理采用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，选择p＜0.05为有统计学意义；实验数据以平均值±标准误差表示；空白组和模型组采用t检验，模型组和各给药组采用方差分析和p检验分析组间差异。

综合上述试验结果可以看出，(1)GSE提取物不抑制大鼠食欲。但用药四周后各用药组均显著降低了肥胖大鼠的体重，而且高剂量组和阳性对照组的体重已经低于正常对照组的体重，表明从葡萄籽中提取的脂肪酶抑制剂能有效抑制肥胖大鼠体重增长。测量体长和Lee′s指数后结果显示，肥胖大鼠体长、尾长变化不显著，而Lee′s指数明显增加，表示GSE对于肥胖指数的降低主要是体重的降低，而不是体长的变化。

(2)观察用药后的各组大鼠，无行为异常现象，只是毛色光泽度略有下降。测量大鼠粪便后发现，用药组大鼠中的脂肪含量明显增多，提示葡萄籽中的有效成分能抑制脂肪在体内的吸收。GSE能降低肥胖大鼠体脂含量。GSE给药后，高、中、低剂量组与模型组相比，睾脂与脂肪系数皆显著降低(p＜0.01)，阳性对照组也能显著降低(p＜0.05)，说明表明GSE具有减轻肥胖模型大鼠体内脂肪堆积的作用。

(3)实验结束时测定大鼠血脂，模型组的TG水平显著高于正常对照组(p＜0.01)，而GSE低剂量组能显著降低肥胖大鼠的TG水平(p＜0.01)。其它各组无显著影响，但有降低趋势，提示GSE有降血脂作用。