搅拌罐连续培养高产核酸热带假丝酵母的核糖核酸的方法

摘要

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种搅拌罐连续培养高产核酸热带假丝酵母的核糖核酸的方法。其特征是：采用诱变得到的保藏号为：CGMCC No.3558的热带假丝酵母菌株在斜面培养基中以28～31℃的条件下进行活化、再将菌种接种到摇瓶培养基中进行摇瓶培养、将摇瓶所得菌种在搅拌发酵罐中先在间歇发酵培养基中进行间歇发酵，4～12h后在不断加入补料培养基的情况下进行连续发酵培养、提取分离核糖核酸，即得。采用本发明的发酵方法适合于工业化大生产，可以在20～3000L的发酵罐中生产，发酵液中干菌浓度可达20～23g/L，干菌种核糖核酸含量达12～14％。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种搅拌罐连续培养高产核酸热带假丝酵母(Candida tropicalis)的核糖核酸的生产方法。

背景技术

核酸的发现已有100多年的历史，但人们对它真正有所认识不过是近60年的事。远在1868年瑞士化学家米歇尔(Miesher，F.1844～1895)，首先从脓细胞分离出细胞核，用碱抽提再加入酸，得一种含氮和磷特别丰富的沉淀物质，当时曾称为核质。

核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。

自从有研究人员发现以核糖核酸为原料，用酶解法制造呈味性物质5’-核苷酸的方法以来，有力地促进了从微生物中提取核糖核酸新方法的研究。与动植物相比，微生物体内的蛋白质生物合成非常活跃，含有丰富的核糖核酸。酵母菌的核糖核酸是以核蛋白体核糖核酸(rRNA)，mRNA和tRNA的形式出现的。其中rRNA的含量占总量的85％以上。酵母细胞中核糖核酸含量丰富，为DNA的50～100倍，这随酵母种类、生长速率及培养基的组成等因素的不同而变化。已有报道指出，酵母细胞的核糖核酸含量为7～12％(以干物质计)。

山口等(山口和夫，三上忠义，茨大农学术报告，13，69，1965)用含有2％葡萄糖的合成培养基研究比较了数十种酵母属结果发现：菌体中核糖核酸含量，从生长的诱导期至对数生长期达最高含量。单位培养液中的核糖核酸积累能力，一般以假丝酵母属的酵母，特别是产阮假丝酵母和糙蹼假丝酵母(C.mycodema)为最佳，其核糖核酸的积累量在对数生长期末最高，而且因糖的种类不同所引起的差异较小；无机氮源以硫酸铵，有机氮源以蛋白胨、酵母浸出液为佳。

核糖核酸最大的应用是作为用分解法生产5’-核苷酸的工业原料。核酸在核酸酶的作用下，水解为寡核苷酸或单核苷酸，其中脱氧核糖核酸水解后产生dAMP、dGMP、dCMP和dTMP，核糖核酸水解后产生AMP、GMP、CMP和UMP。

核糖核酸及其酶分解产物腺苷酸、胞苷酸，鸟苷酸，尿苷酸等在医药、食品、化妆品以及农业等行业中具有重要的用途。近年来一些研究表明核糖核酸及其酶解物核苷酸具有维持机体免疫功能、抗氧化、提高机体蛋白质和铁的生物利用率、降低胆固醇和抗衰老等多种生理功能。因此，核糖核酸的开发研究越来越受到重视。

但是，以前产核糖核酸酵母的培养一般都采用传统的鼓泡式连续培养，如文献(王大琛1986年10月全国核酸技术学术会议)所述，采用该法发酵液中干菌浓度11-12g/L，最高13-14g/L干菌体中核糖核酸含量14-15％。该菌株保藏编号为K-79。

本发明的目的，就在于克服以上缺点和不足，提供一种菌体收率高，能耗低，适合于高效规模的工业化生产的搅拌连续发酵工艺。

发明内容

本发明的目的在于建立和改进高核酵母的核糖核酸生产工艺，使菌体浓度达20～23g/L和核糖核酸含量达12～14％，装料系数达到50-75％，同时通过连续发酵取消了间歇发酵过程中的消罐、空消、进料、实消的工艺，延长了实际生产时间，大幅度提高产量，降低生产过程能耗，减少了发酵废水的排放。该工艺劳动强度小，生产程序简单。

一、菌种性状和来源：

本发明通过将热带假丝酵母ATCC14246进行诱变筛选，得到一株高产核糖核酸的热带假丝酵母菌株，简称CPU-1，它不但核酸含量很高并且具有解脂假丝酵母可利用石蜡油为碳源的特征。

高产核糖核酸的热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株CPU-1，已于2009年12月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏号为：CGMCC No.3558。

本发明以实验室保藏的热带假丝酵母ATCC12468为原始菌株，先利用以石蜡油为碳源的发酵培养基培养出能够利用石蜡油的酵母菌，用稀释平板法纯化出单菌落作为诱变的出发菌株。根据一定范围内不同浓度和时间梯度的NTG致死率曲线，得到合适的诱变条件后，用一定浓度的NTG对出发菌株进行诱变。由于本菌株有对高浓度氯化钾敏感的特性，所以用影印平板法进行筛选出氯化钾敏感菌株，接着再将它们进行3次紫外诱变，最后得到一株核糖核酸含量达到12％的菌株CPU-1，较原始菌株热带假丝酵母ATCC14246的核糖核酸含量提高了3倍。

在此诱变筛选的过程中，所用的培养基为以下几种。氯化钾敏感性筛选培养基A：葡萄糖3％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.3％，尿素0.5％，FeSO₄·7H₂O 0.01％，琼脂2.5％；氯化钾敏感性筛选培养基B为：培养基A中加入1.5mol/L KCl；分离单菌落的平板培养基及斜面培养基C：葡萄糖3％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.3％，尿素0.5％，FeSO4·7H2O 0.01％，琼脂2.5％；利用石蜡油菌株的筛选培养基D：石蜡油1％，(NH4)2SO4 1.5％，KH2PO4 0.9％，K2HPO4 0.3％，MgSO4·7H₂O 0.3％，FeSO₄·7H₂O 0.003％，酵母膏0.3％，玉米浆0.3％；种子培养基S：葡萄糖4％，(NH₄)₂SO₄ 1.5％，KH₂PO₄ 0.9％，K₂HPO₄ 0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.3％，FeSO₄·7H₂O0.003％，酵母膏0.3％，玉米浆0.3％，CaCO₃0.5％；筛选发酵培养基M：石蜡油1％，尿素0.8％，80％磷酸0.3％，KCl 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.1％，FeSO₄·7H₂O 0.003％，CaCl₂·2H₂O 0.01％，NaCl 0.1％，酵母膏0.3％，玉米浆0.3％。

具体地，此诱变筛选的方法为：首先将热带假丝酵母ATCC14246于培养基D中28℃培养16～18h后挑取单菌落，该菌落即为可利用石蜡油的菌株，它作为诱变的出发菌株。接着，用0.5mg/ml亚硝基胍(NTG)在30℃诱变45min，也可以用1.5mg/ml或2.0mg/m NTG诱变30min，用影印平板法筛选出一株核酸含量达10％的氯化钾敏感菌株D12，此处的影印平板法为：在培养基A和B两块平皿的相同位置接种该菌，如果该菌株是对氯化钾的敏感菌株，则会只在A平板上生长，不在B平板上生长，如果该菌株对氯化钾不敏感，则会在A和B平板上都生长。然后，D12再通过三次紫外诱变，照射时间为60s，筛选出一株核酸含量高达12％的KCl敏感菌株菌株CPU-1，它同时还具有解脂假丝酵母的特征，可利用石蜡油为碳源，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.3558。

该菌株具有以下特征：

1.菌落形态特征：见附图1。如图1所示，在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD培养基)(酵母粉1％，葡萄糖2％，蛋白胨2％)琼脂培养基上菌落为白色到奶油色，无光泽或稍有光泽，黏湿，软而平滑或部分有皱纹，易被挑起。

2.菌体形态特征：在YPD液体培养基中培养，28℃，3天，细胞呈球形或卵球，大小为4～8×6～11μm。

3.菌株的生长及核酸含量曲线：见附图2。如图2所示，0～12h为菌生长的对数期，培养基中的葡萄糖含量急剧下降，菌浓也快速增长，pH下降，而核酸增长则较平稳；12h以后，菌进入稳定期，葡萄糖基本消耗完毕，菌体总量的增长幅度不再显著，核酸的含量与对数生长期相比有主见降低的趋势。这是因为在核糖核酸聚合酶的活性在酵母对数生长期较高，经过了对数生长期以后，随着时间的增加，核糖核酸聚合酶活性逐渐降低，所以菌体内核糖核酸的含量变少。而酵母菌在生长过程中代谢产生有机酸使培养液pH下降。因此在保持较高菌浓的前提下，确定种子培养和发酵培养的时间为10～12h。且在间歇发酵过程中，酵母菌的比生长速率μ最大可达到0.5h^～1。

二、具体发酵步骤如下：

a.将CPU-1菌种在斜面培养基中以28～31℃的条件下进行活化；

b.将a步骤活化的菌种接种到摇瓶培养基中进行摇瓶培养；

c.将摇瓶所得菌种在搅拌发酵罐中先在间歇发酵培养基中进行间歇发酵，4～12h后在不断加入补料培养基的情况下进行连续发酵培养。

d.提取分离核糖核酸.

其中在斜面培养基中以28～31℃培养的时间优选24～36h。

所述的斜面培养基优选由30g/L的葡萄糖、3g/L的牛肉膏、3g/L酵母膏、5g/L硫酸铵、0.1g/L无水硫酸亚铁、25g/L琼脂加入水中加热摇匀所制备。

摇瓶培养过程优选将斜面活化的CPU-1菌种接到装有摇瓶培养基的摇瓶中，置于摇床中以100～300r/min振荡，28～32℃发酵培养10～30h。更优选：摇床转速为200r/min，温度为30℃，培养时间是18～24h。

搅拌发酵罐中的间歇发酵的优选的方法是：在搅拌罐中投入50～75％搅拌罐体积的间歇发酵培养基，在115℃下，高压灭菌30min；在温度降到30℃以下时，将摇瓶所得的菌种以1～10％体积比的菌种量接种到发酵罐中，以温度30～34℃，pH 3.8～4.5，溶氧率10-500％，压力0.02～0.05Mpa，搅拌转速180～400r/min的发酵条件发酵4～12h，得到干菌浓为20～23g/L。所述溶氧率10-500％的条件是在发酵过程中根据发酵液中的溶氧率来调整所通入无菌空气的量。在发酵过程中根据pH下降的趋势不断加入氨水使pH保持3.8～4.5范围内。

间歇发酵4～12h后，pH下降趋势略成缓慢，干菌浓度达到20～23g/L时开始连续发酵，发酵稀释率从0.33逐渐提高到0.75、温度30～34℃、pH 3.9～4.5、溶氧率10-500％、压力0.02～0.05Mpa、搅拌转速180～400r/min。干菌浓度20～23g/L，核糖核酸含量约12～14％。所述溶氧率10-500％的条件是在发酵过程中根据发酵液中的溶氧率来调整所通入无菌空气的量。在发酵过程中根据pH下降的趋势不断加入氨水使pH保持3.9～4.5范围内。

本发明中摇瓶培养基优选含35～45g/L糖蜜、1.0～1.4g/L的硫酸镁、1.0～1.4g/L的尿素、0.1～0.5g/L的硫酸铵、0.05～0.3g/L的硫酸锌、0.05～0.3g/L的硫酸亚铁、0.05～0.2g/L的NaCl和1～3ml的磷酸。更优选的摇瓶培养基是由40g/L糖蜜、1.2g/L的硫酸镁、1.2g/L的尿素、0.3g/L的硫酸铵、0.15g/L的硫酸锌、0.15g/L的硫酸亚铁、0.1g/L的NaCl、1.8ml/L的磷酸加入水中摇匀所制备。培养基基质为水。

本发明中间歇发酵培养基优选含35～45g/L糖蜜、1.0～1.4g/L的硫酸镁、1.0～1.4g/L的尿素、0.1～0.5g/L的硫酸铵、0.05～0.3g/L的硫酸锌、0.05～0.3g/L的硫酸亚铁、0.05～0.2g/L的NaCl、1～3ml的磷酸。更优选的间歇发酵培养基由40g/L糖蜜、1.2g/L的硫酸镁、1.2g/L的尿素、0.3g/L的硫酸铵、0.15g/L的硫酸锌、0.15g/L的硫酸亚铁、0.1g/L的NaCl、2.0ml/L的磷酸加入水中摇匀所制备。

本发明中补料培养基优选含25～35g/L糖蜜、0.6～1.3g/L的硫酸镁、0.6～1.3g/L的尿素、0.1～0.4g/L的硫酸铵、0.05～0.3g/L的硫酸锌、0.05～0.3g/L的硫酸亚铁、0.03～0.1g/L的NaCl和1～3ml的磷酸。更优选的补料培养基由28g/L糖蜜、0.8g/L的硫酸镁、0.8g/L的尿素、0.2g/L的硫酸铵、0.1g/L的硫酸锌、0.1g/L的硫酸亚铁、0.06g/L的NaCl、1.5ml的磷酸加入水中摇匀所制备。

优选用碱式法提取分离核糖核酸，将以上发酵液通过离心分离收集酵母菌体。然后配置氢氧化钠溶液，该溶液的配置方法是将10％干酵母重量的氢氧化钠和一定量的水混合，配置成浓度为1％的氢氧化钠溶液。(该溶液中水分的量包括湿菌酵母中所含的水)。将菌体加入到以上所配置的氢氧化钠溶液中，在20℃搅拌30～40分钟。离心收集上清液，并用盐酸调PH至2.5，在2～10℃存放4～6h，再离心，将离心所得的沉淀干燥后即可获得核糖核酸产品，其提取收率约为80～90％。

核糖核酸含量的测定方法如下：取10ml发酵菌液进行离心8000rpm，10min，弃去上清，称菌体湿重。用10ml生理盐水悬浮细胞，离心8000rpm，10min，再用生理盐水悬浮后取2ml菌悬液于干净试管，再加入2ml高氯酸，70℃水浴20min，水浴过程中每5min震荡一次，水浴后取1ml加入EP管中混匀，用紫外分光光度计于260nm处测OD。核糖核酸含量测定的公式为：

其中，A为OD₂₆₀吸光值，32为文献单位光吸收值，W为菌体湿重g·L^-1，R为酵母菌的干湿重比。

采用本发明的发酵方法适合于工业化大生产，可以在20～3000L的发酵罐中生产，发酵液中干菌浓度可达20～23g/L，干菌种核糖核酸含量达12～14％。

附图说明

图1是CPU-1的菌落形态特征

图2是CPU-1的生长及核酸含量曲线

图3是20L发酵罐间歇发酵过程中CPU-1的生长代谢曲线

图4是20L发酵罐连续发酵过程中CPU-1的生长代谢曲线

图5是200L发酵罐间歇发酵过程中CPU-1的生长代谢曲线

图6是200L发酵罐连续发酵过程中CPU-1的生长代谢曲线

图7是3000L发酵罐间歇发酵过程中CPU-1的生长代谢曲线

图8是3000L发酵罐连续发酵过程中热CPU-1的生长代谢曲线

具体实施方式

                                实施例1

CPU-1在20L发酵罐的发酵培养

1、CPU-1的活化

将4℃保存的CPU-1菌种接种到斜面培养基上以30℃条件下培养32h。斜面培养基是由30g/L的葡萄糖、3g/L的牛肉膏、3g/L酵母膏、5g/L硫酸铵、0.1g/L无水硫酸亚铁、25g/L琼脂加入水中加热摇匀所制备。

2、CPU-1的摇瓶培养

装有100ml摇瓶培养基的500ml摇瓶，在115℃条件下高压灭菌20min。将斜面活化的CPU-1菌种接种到摇瓶中，置于摇床中以200r/min振荡，30℃发酵培养20h，干菌浓度为15g/L。

3、CPU-1在20L发酵罐发酵培养

将14升间歇发酵培养基装入20L发酵罐中，在115℃条件下高压灭菌30min。等温度降低到＜30℃时，将摇瓶培养所得的600ml CPU-1菌种接种到发酵罐中，以温度31～32℃，pH4.0～4.1，溶氧率30～40％，压力0.05Mpa，搅拌转速180～400r/min的发酵条件进行发酵，期间由于发酵会产生大量的有机酸，致使pH下降，因此要不断的在发酵液中加入氨水调整pH。间歇发酵过程菌的生长代谢曲线见图3。约7h后，干菌浓约20g/L，pH下降趋势略呈缓慢，开始连续发酵，稀释率从0.3逐渐提高到0.75，以温度31～32℃、pH 4.0～4.1、溶氧率30～50％、压力0.05Mpa、搅拌转速180～400r/min的条件进行发酵，在28h时稀释率为0.5h^-1，在28h时稀释率为0.6h^-1，干菌浓度达21g/L，核糖核酸含量约14％。连续发酵菌的生长代谢曲线见图4。

                                实施例2

CPU-1在200L发酵罐中发酵培养

将150L间歇发酵培养基装入200L发酵罐中，在115℃条件下高压灭菌30min。等温度降低到＜30℃时，将实施例1方法所得的7.5L CPU-1菌种接种到发酵罐中，以32～33℃，pH4.0～4.2，溶氧率30～80％，通气量为2～26M³/h，压力0.02～0.04Mpa，搅拌转速180～400r/min的条件进行间歇发酵，期间由于发酵会产生大量的有机酸，致使pH下降，因此要不断的在发酵液中加入氨水，共加入氨水835ml。间歇发酵培养过程中菌的生长代谢曲线及工艺参数见图5。间歇发酵约7h后pH下降趋势略成缓慢，测其残糖量为0.63％，干菌浓度达到22.2g/L开始连续发酵。发酵稀释率从0.33逐渐提高到0.75，以温度32～33℃，pH 4.0～4.2，溶氧率30～80％，压力0.02～0.04Mpa，搅拌转速180～400r/min的发酵条件进行发酵，至88h稀释率为0.5h^-1时，干菌浓度达22.4g/L，核糖核酸含量约14％。连续发酵过程中菌的生长代谢曲线及工艺参数见图6。

                                实施例3

CPU-1在3000L发酵罐发酵培养

将1800L间歇发酵培养基装入3000L发酵罐中，在115℃条件下高压灭菌30min。将将实施例1方法所得的75L CPU-1菌种接种到接种到发酵罐中，以温度32℃～33℃，pH4.0～4.1，溶氧率30～120％，压力0.2～0.4Mpa的条件进行间歇发酵，发酵5h后，测干菌浓度22.18g/L。其生长代谢曲线见图7。然后开始连续发酵，稀释率从0.33逐渐提高到0.75，以温度32～33℃，pH 4.0～4.1，溶氧率30～120％、压力0.02～0.04Mpa、搅拌转速180～400r/min的条件进行发酵。连续发酵88h稀释率为0.5h^-1时，干菌浓度23g/L，核糖核酸含量约13.5％。其生长代谢曲线及工艺参数见图8。

以上所用发酵培养基的组成见表1，培养基基质为水。

                表1培养基组成

  品名   摇瓶g/L   间歇g/L   连续补料g/L   总投糖   40   40   28   硫酸镁   1.2   1.2   0.8   尿素   1.2   1.2   0.8   硫酸铵   0.3   0.3   0.2   硫酸锌   0.15   0.15   0.1   硫酸亚铁   0.15   0.15   0.1   NaCl   0.1   0.1   0.06   磷酸   1.8ml   2.0ml   1.5ml