法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-07-04
授权
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2010-10-06
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K48/00 申请日:20100331
实质审查的生效
2010-08-18
公开
公开
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及PEDF基因PLGA纳米复合物及其制备方法和用途。
背景技术
色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是目前已知最强的抗血管生成抑制剂,抑制血管生成的效果是血管他丁(angiostatin)的2倍,是内皮他丁(endostatin)的7倍多;而且对生理性血管生成及增殖没有明显抑制作用,安全性较好。PEDF是一种在全身广泛表达的分子量为50KD(千道尔顿)的分泌型糖蛋白,对肺癌、肝癌、黑色素瘤、骨肉瘤等多种肿瘤都有较好的治疗作用。PEDF主要通过抑制肿瘤血管生成发挥其抗癌活性,此外还可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化成熟、抑制肿瘤细胞侵袭与转移等多种机制发挥抗肿瘤作用。然而,PEDF用于肿瘤治疗的临床应用还面临许多困难,因为它主要从哺乳动物细胞如HEK 293细胞中获得,价格昂贵,且体内用量高达毫克级,临床上难以大规模应用。直接用PEDF基因进行治疗,具有用药剂量小的优点,是目前PEDF用于肿瘤临床治疗极具前景的给药模式。
目前,用于传递PEDF基因的载体报道的有逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、质粒、阳离子脂质体、壳聚糖微球6种。逆转录病毒、腺病毒和慢病毒这几种病毒载体存在免疫原性、潜在的感染性及靶向性差等技术缺陷。质粒具有简便、安全、价廉的特点,而且可以携带较大剂量的DNA,但由于体内核酸酶等对裸DNA的降解作用,基因表达的时间很短,无法临床应用;阳离子脂质体是目前应用较为广泛的基因转染载体,具有基因导入效率高的优点;壳聚糖也是一种具有潜在应用价值的基因转染载体,但是目前报道的载PEDF基因的载体是壳聚糖微球,存在粒径较大,存在细胞摄取效率低的技术缺陷。
乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D,L-lactide-co-glycolide),PLGA)是一种具有优良的生物相容性和可生物降解的聚合物,经FDA批准可用作医学手术缝合线和注射用微胶囊,微球及埋植剂等制剂的材料;在体内代谢最终产物是CO2和H2O,中间产物乳酸也是体内正常糖代谢产物,因此不会在体内形成聚积或产生毒性。PLGA纳米复合物表面通常呈电中性或负电性,可以减少其在血液循环中与血浆蛋白、调理素等的结合,增加到达病变部位的机会,提高治疗效果。PLGA纳米复合物具有快速的内吞体-溶酶体逃逸性能,能保护基因不被溶酶体降解,从而增加基因的转染效率。此外,PLGA纳米复合物还具有缓释长效的特点,作为基因载体,可以减少给药剂量,降低治疗费用;也可减少给药次数,增加病人的顺应性。
迄今为止未见以PLGA纳米复合物作为PEDF基因载体的报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种抗癌治疗效果好、毒副作用小的PEDF基因PLGA纳米复合物。由于体内核酸酶等对裸DNA的降解作用,基因表达的时间很短,鉴于质粒具有简便、安全、价廉的特点,而且可以携带较大剂量的DNA,故本发明纳米复合物采用质粒作为PEDF基因的载体。
该纳米复合物是以载有PEDF基因的重组质粒为原料,与PLGA形成的纳米复合物;载有PEDF基因的重组质粒与PLGA的质量比为0.5~10∶100。
进一步地,根据包封率优选:载有PEDF基因的重组质粒与PLGA的质量比为0.5~6∶100。
为了降低免疫原性并携带较大剂量的PEDF基因,使其持续稳定表达,选择pAAV2、pGenesil2.1、pGenesil2.4三种质粒作为PEDF基因的载体,即载有PEDF基因的重组质粒为pAAV2-PEDF重组质粒、pGenesil2.1-PEDF重组质粒或pGenesil2.4-PEDF重组质粒中的一种。
本发明还提供了该纳米复合物的制备方法,具体地,它是由如下方法制备:
A、取PEDF基因,以pAAV2为载体制成pAAV2-PEDF重组质粒,或以pGenesil2.1为载体制成pGenesil2.1-PEDF重组质粒,或以pGenesil2.4为载体制成pGenesil2.4-PEDF重组质粒;
B、将步骤A所述的任意一种载有PEDF基因的重组质粒与缩合物混合,得质粒复合物;
C、取PLGA,用氯仿-丙酮溶液溶解,得PLGA氯仿-丙酮溶液;
D、混合PLGA氯仿-丙酮溶液和质粒复合物,以单乳法或复乳法制成纳米复合物;
其中,具体使用的缩合物为PLL、鱼精蛋白、精氨酸、PEG、Ca2+中的任意一种或几种。
在制备缩合物时,载有PEDF基因的重组质粒投料的初始浓度为:0.5~5mg/ml;载有PEDF基因的重组质粒与缩合物的重量配比为1∶0.5~20。
步骤C所述PLGA分子量为10~100kD(千道尔顿),通过筛选,选取氯仿-丙酮溶液作为PLGA的溶剂,氯仿-丙酮溶液中丙酮与氯仿体积比为0.1~2∶1;所得PLGA氯仿-丙酮溶液中PLGA浓度为5~200mg/ml。
步骤D中所述单乳法是由如下步骤完成:
a、在PLGA氯仿-丙酮溶液中加入质粒复合物;
b、加入表面活性剂溶液,超声;
c、除尽有机溶剂,即得纳米复合物。
步骤D中所述复乳法是由如下步骤完成:
a、在PLGA氯仿-丙酮溶液中加入质粒复合物;
b、超声,形成初乳,再加入表面活性剂溶液中,超声;
c、除尽有机溶剂,即得纳米复合物。
为除去有机溶剂,可采用水浴减压旋蒸的方式,水浴温度范围可控制在25~50℃。
单乳法和复乳法中采用的表面活性剂为F68、PVA、TPGS中的任意一种;其中,PVA分子量为20,000~70,000道尔顿,PVA使用时配制成浓度为0.5%~6%的溶液(即100ml溶液中含有0.5~6g的PVA);F68使用时配制成浓度为0.1%~3%的溶液(即100ml溶液中含有0.1~3g的F68);TPGS使用时配制成浓度为0.5%~5%的溶液(即100ml溶液中含有0.5~5g的TPGS)。或表面活性剂为F68、PVA、TPGS中至少两种的混合物,PVA分子量为20000~70000道尔顿、PVA使用时配制成浓度为0%~6%的溶液,F68使用时配制成浓度为0%~3%的溶液,TPGS使用时配制成浓度为0%~5%的溶液;两两混合时,第三种为0%;三者混合时,三者均不取0%。
单乳法中水相与油相体积比为1~10∶1;复乳法中初乳油相与水相体积比1~20∶1,复乳水相与油相水相体积比1~20∶1。超声条件为:超声时间为10s~5min,超声功率为10W~200W。采用上述方法制备而得的纳米复合物粒径较小,粒径分布均匀。
本发明还提供了PEDF基因PLGA纳米复合物的新用途,即其在制备治疗抗肿瘤的药物中的用途。
综上,本发明提供的纳米复合物制备方法制得的PEDF基因PLGA纳米复合物,包封率高达60%,制得的纳米复合物粒径较小,粒径分布均匀,工艺重现性好。应用本发明纳米复合物还可以克服了现有病毒类载体、脂质体和壳聚糖载体的毒副作用;且抑制癌细胞增长效果明显,为临床治疗癌症,有效应用PEDF基因提供了一种新的选择。
附图说明
图1为重组质粒与PLGA质量筛选图。
图2为pAAV2-PEDF重组质粒结构图。
图3为pGenesil2.1-PEDF重组质粒结构图。
图4为pGenesil2.4-PEDF重组质粒。
图5为PLGA分子量筛选图。
图6为丙酮-氯仿比例筛选图。
图7为PLGA浓度筛选图。
图8为水浴温度筛选图。
图9为PEDF基因PLGA纳米复合物的粒径分布图,size=185。
图10为PEDF基因PLGA纳米复合物的zeta电位分布图zeta potential=-6.32mV。
图11为PEDF基因PLGA纳米复合物的透射电镜照片图。
图12为PEDF基因PLGA纳米复合物诱导小鼠结肠癌细胞CT26凋亡率对比图。
图13为PEDF基因PLGA纳米复合物体外抑制HUVEC增殖活性对比图。
图14为CT26肿瘤体积生长曲线。
图15为Lewis肺癌体积生长曲线。
图16为PEDF基因PLGA纳米复合物的体外基因释放特性。
具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。
本发明提供的技术方案为:以以载有PEDF基因的重组质粒为原料,与PLGA形成的纳米复合物,该纳米复合物毒副作用小。单因素实验表明载有PEDF基因的重组质粒与PLGA的比例会影响包封率,质量比为0.5~10∶100时包封率较高,优选质量比为0.5~6∶100,筛选依据见图1:当质量比为0.5~10∶100时,包封率至少大于60%,一般都高于85%;而当质量比为0.5~6∶100时,包封率至少大于85%,甚至高达99%。
为了降低免疫原性并携带较大剂量的PEDF基因,使其持续稳定表达,选择pAAV2、pGenesil2.1、pGenesil2.4三种质粒作为载体,即载有PEDF基因的重组质粒为pAAV2-PEDF重组质粒(结构见图2)、pGenesil2.1-PEDF重组质粒(结构见图3)或pGenesil2.4-PEDF重组质粒(结构见图4)。
本发明纳米复合物是由如下方法制备:
A、取PEDF基因,制成载有PEDF基因的重组质粒;
B、将步骤A所述的载有PEDF基因的重组质粒与缩合物混合,得质粒复合物;
C、取PLGA,用氯仿-丙酮溶液溶解,得PLGA氯仿-丙酮溶液;
D、混合PLGA氯仿-丙酮溶液和质粒复合物,以单乳法或复乳法制成纳米复合物;
其中,步骤A中所述取PEDF基因,制成载有PEDF基因的重组质粒的方法为:
a、选用pAAV2、pGenesil或pGenesil2.4作为载体,根据PEDF基因序列设计引物,选用适宜的酶酶切表达载体pAAV2、pGenesil或pGenesil2.4,将扩增后经适宜的酶酶切纯化后的PEDF基因cDNA片段与线性化的pAAV2、pGenesil或pGenesil2.4用DNA连接酶连接,即得pAAV2-PEDF重组质粒、pGenesil2.1-PEDF重组质粒或pGenesil2.4-PEDF重组质粒;
b、再将上述重组质粒转入大肠杆菌,扩增培养后,用高纯度大量质粒抽提试剂盒提取纯化pAAV2-PEDF重组质粒、pGenesil2.1-PEDF重组质粒或pGenesil2.4-PEDF重组质粒。步骤B中,将载有PEDF基因的重组质粒与缩合物混合的目的是浓缩基因,使基因伸展的双链变成紧缩状,从而粒径变小才能被PLGA纳米复合物高效的包裹。若不浓缩,则包封率很低,影响临床使用。选择PLL、鱼精蛋白、精氨酸、PEG、Ca2+等缩合物是因其能以最小的用量浓缩基因,并且浓缩后得到的产物粒径较小,易被PLGA纳米复合物包裹。此外,采用上述缩合物,最后得到的PEDF基因PLGA纳米复合物基因转染效率较高。
本发明采用的缩合物中PLL的分子量为10000~80000道尔顿,使用时配制成浓度为0.5~5mg/ml的溶液;所述的鱼精蛋白使用时配制成浓度为0.5~10mg/ml的溶液;所述的精氨酸使用时配制成浓度为0.5~50mg/ml的溶液;所述的PEG使用时配制成浓度为0.5~20mg/ml的溶液;所述的Ca2+使用时配制成浓度为1~20mM的溶液。
在制备缩合物时,载有PEDF基因的重组质粒投料的初始浓度为:0.5~5mg/ml。载有PEDF基因的重组质粒与缩合物的重量配比为1∶0.5~20。
步骤C所述PLGA分子量为10~100kD,筛选依据见图5;氯仿-丙酮溶液中丙酮与氯仿体积比为0.1~2∶1,筛选依据见图6;所得PLGA氯仿-丙酮溶液中PLGA浓度为5~200mg/ml,筛选依据见图7。
PLGA可以溶于乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-丙酮溶液和氯仿中,单因素实验比较了乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-丙酮溶液、氯仿、氯仿-丙酮溶液这5种溶剂,最后发现以乙酸乙酯作为溶剂,不能制得纳米复合物,二氯甲烷、二氯甲烷-丙酮溶液和氯仿三种溶剂制得的纳米复合物粒径高达500nm左右,通过优化其他工艺参数亦不能减小粒径,因此,最后选择氯仿-丙酮溶液作为PLGA的溶剂,并进一步确定丙酮-氯仿最佳体积比0.1~0.5∶1。
单乳法中水相与油相体积比为1~10∶1;所述的复乳法中初乳油相与水相体积比1~20∶1,复乳水相与油相水相体积比1~20∶1。采用的表面活性剂为F68、PVA、TPGS中的至少一种。单乳法和复乳法中以水浴减压旋蒸的方式除去有机溶剂时,水浴温度范围可控制在25~50℃,选择依据见图8。
通过上述方法制得的PEDF基因PLGA纳米复合物的平均粒径为208nm±52nm,粒径较小,且从标准偏差52nm,由此可以看出纳米复合物的制备工艺稳定,重现性好;多分散系数(polydispersity index,PDI)为0.12±0.05,说明所制得的纳米复合物粒径分布均匀;zeta电位为-8.12±2.38,呈弱负电性,不会非选择性地与正常细胞吸附;透射电镜照片显示纳米复合物表面圆整、光滑,粒度均匀。
以下通过实施例及实验例说明本发明的有益效果。
实施例1载有PEDF基因的重组质粒的构建、扩增和提取纯化
(1)pAAV2-PEDF重组质粒的构建工序如下:通过PCR技术从质粒pBLAST49-hPEDF上克隆人的全长PEDF基因cDNA片段,根据PEDF基因序列设计引物,上游:5′GGA ATT CATGCA GGC CCT GGT GCT ACT C 3′;下游:5′ACG CGT CGA CTT AGG GGC CCC TGG GGTCCA G 3′,此引物设计有EcoR I和Sal I两个酶切位点,分别在5′端和3′端。用EcoR I和Sal I酶切表达载体pAAV2,将扩增后经EcoR I和Sal I酶切纯化后的PEDF基因cDNA片段与线性化的pAAV2用T4DNA连接酶连接,即得pAAV2-PEDF重组质粒。再将重组质粒转入大肠杆菌,扩增培养后,用高纯度质粒大量提取试剂盒提取纯化pAAV2-PEDF重组质粒。用紫外分光光度计测定其浓度,通过A260/A280的测定和琼脂糖凝胶电泳分析pAAV2-PEDF的纯度,制备的pAAV2-PEDF 260/A280=1.8~2.0;同时经琼脂糖凝胶电泳检测,无染色体DNA、蛋白质及RNA污染,条带整齐清晰。
(2)参照上述方法,选用pGenesil或pGenesil2.4作为载体,根据PEDF基因序列设计引物,选用适宜的酶酶切表达载体pGenesil或pGenesil2.4,将扩增后经适宜的酶酶切纯化后的PEDF基因cDNA片段与线性化的pGenesil或pGenesil2.4用DNA连接酶连接,即得pGenesil2.1-PEDF重组质粒或pGenesil2.4-PEDF重组质粒。
对比pAAV2-PEDF重组质粒、pGenesil2.1-PEDF重组质粒和pGenesil2.4-PEDF重组质粒三种不同重组质粒制备的纳米复合物在粒径、zeta电位、包封率及体外释药特性方面皆没有显著性差异。同时发明人用pAAV2-PEDF、pGenesil2.1-PEDF和pGenesil2.4-PEDF 3种重组质粒分别制备了PLGA纳米复合物,预试验研究显示,3种纳米复合物在体外转染效率及体内抑瘤效果方面均没有显著性差异,故选择了其中一种重组质粒即pAAV2-PEDF进行了体外转染效率、体内抑瘤效果方面等研究。以下均是以pAAV2-PEDF重组质粒制备的纳米复合物进行制剂学研究。
实施例2PEDF基因PLGA纳米复合物的制备
将pAAV2-PEDF重组质粒与PLL(分子量为25kd)按1∶5(质量比)比例混合,形成缩合物后,再与40mg/ml的PLGA氯仿-丙酮溶液(1∶0.1,v/v)按10∶1(体积比)比例混合,80W超声30s,制得初乳;将初乳与3%PVA(分子量为50kd)溶液按20∶1(体积比)比例混合,300W超声2min,制得复乳;室温条件下磁力搅拌除尽有机溶剂,即得PEDF基因PLGA纳米复合物胶体溶液(PEDF-PLGANP),该溶液带有淡蓝色乳光、呈半透明。平行制备三批样品,测定得到PEDF基因PLGA纳米复合物的平均粒径为:208nm±52nm,多分散系数(polydispersity index,PDI)为:0.12±0.05,粒径分布图见图9;zeta电位为:-8.12±2.38,分布图见图10,透射电镜照片图见图11,包封率为98.25%±1.08%。
以实施例2制备的纳米复合物用于以下制剂学性质研究。
试验例1PEDF基因PLGA纳米复合物体外诱导小鼠结肠癌细胞CT26凋亡的作用
取对数期生长的CT26细胞,胰酶消化后制成浓度为2×105/ml的细胞悬液,接种于六孔板,每孔加入2ml,使其均匀分布在孔内,于37℃、5%CO2孵箱中继续孵育24h。待细胞长到约40-50%单层时,吸弃原培养液,每孔加入1ml含有PEDF-PLGANP的双无的1640培养基,pAAV2-PLGANP和NS作为对照,继续培养48h后将上清液吸至流式管,6孔板中的细胞用胰酶消化后将其吸入流式管,离心,PBS洗细胞,弃上清后沉淀用于进行流式分析,结果见图12。结果表明PEDF基因PLGA纳米复合物诱导的CT26细胞的凋亡率(c:61.9%)明显大于空载PLGA纳米复合物组(b:15.2%)和生理盐水组(a:13.2%)。
试验例2PEDF基因PLGA纳米复合物体外抑制脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖作用
为了验证PEDF基因PLGA纳米复合物对血管生成的影响,选用HUVEC为模型细胞株,进行增殖抑制实验研究。实验设计三组:
NS组:生理盐水组;
PEDF-pAAV2-PLGANP组:PEDF基因PLGA纳米复合物组;
pAAV2-PLGANP组:载空质粒的PLGA纳米复合物组。
并将纳米复合物稀释成1∶2至1∶64共6个浓度梯度,结果见图13,可见PEDF基因PLGA纳米复合物能显著抑制HUVEC的增殖,且具有明显浓度依赖性。
试验例3PEDF基因PLGA纳米复合物抑制小鼠结肠癌
取对数生长期的CT26细胞,按1×106/100μl的浓度皮下接种BABL/C小鼠肋背部,待肿瘤长至约3-5mm大小时,将小鼠随机分为3组:
NS组:生理盐水组;
PEDF-pAAV2-PLGANP组:PEDF基因PLGA纳米复合物组;
pAAV2-PLGANP组:载空质粒的PLGA纳米复合物组。
瘤内注射,每周两次,连续给药8次,每三天测定肿瘤体积,考察肿瘤生长曲线。结果见图14。
试验例4PEDF基因PLGA纳米复合物抑制小鼠Lewis肺癌
取对数生长期的Lewis肺癌细胞,按1×106/100μl的浓度皮下接种C57小鼠肋背部,待肿瘤长至约3-5mm大小时,将小鼠随机分为3组:
NS组:生理盐水组;
PEDF-pAAV2-PLGANP组:PEDF基因PLGA纳米复合物组;
pAAV2-PLGANP组:载空质粒的PLGA纳米复合物组。
瘤内注射,每周两次,连续给药8次,每三天测定肿瘤体积,考察肿瘤生长曲线。结果见图15。
试验例5PEDF基因PLGA纳米复合物的体外基因释放特性
从图16可见,PEDF基因PLGA纳米复合物的体外基因释放呈现显著的缓释特性,可使基因呈现较长时间的稳定表达,较少给药次数,延长给药间隔,明显增加患者用药的顺应性,较目前已有的阳离子脂质体、壳聚糖纳米复合物、PEI纳米复合物等阳离子载体等在缓释方面具有明显的优越性。
试验例6PEDF基因PLGA纳米复合物的毒性观察
选用健康昆明种小鼠作为试验动物,尾静脉注射相同剂量的PEDF基因PLGA纳米复合物、载PEDF基因的阳离子脂质体和壳聚糖纳米复合物,每天给药一次,连续给药7天,观察毒性反应,结果见表1。
其中,PEDF基因PLGA纳米复合物由实施例2制备,阳离子脂质体和壳聚糖纳米复合物均是由pAAV2-PEDF重组质粒制备。载PEDF基因的阳离子脂质体的具体制备方法为:购买商品化的阳离子脂质体Lipofectin(Invitrogen公司,英国),以脂质体与pAAV2-PEDF重组质粒质量比5∶1混合,即得。载PEDF基因的壳聚糖纳米复合物制备采用文献报道的经典方法,具体制备工艺为:先将壳聚糖溶于稀醋酸溶液中,搅拌条件下滴加多聚磷酸钠水溶液至壳聚糖醋酸溶液中,当出现乳光时,即制得壳聚糖的空白纳米粒;然后将壳聚糖空白纳米粒与pAAV2-PEDF重组质粒质量比5∶1混合,即得。
表1
发明人将pAAV2-PEDF重组质粒分别用阳离子脂质体、壳聚糖纳米复合物、PLGA纳米复合物分别包载,①体外细胞实验比较研究发现,载PEDF基因的阳离子脂质体和壳聚糖纳米复合物的转染效率较PLGA纳米复合物略高,但空白阳离子脂质体和壳聚糖纳米复合物载体对正常细胞的毒性较大,而空白PLGA纳米复合物没有任何毒性;②体内荷瘤动物实验结果显示,PEDF基因PLGA纳米复合物的抑瘤效果明显好于阳离子脂质体和壳聚糖纳米复合物,且具有明显的缓释长效特点,可以减少给药剂量,降低治疗费用,也可减少给药次数,增加病人的顺应性;③健康昆明种小鼠的毒性研究结果显示,载PEDF基因的阳离子脂质体和壳聚糖纳米复合物在注射时具有明显的刺激性,小鼠挣扎明显,且注射部位及可见血管皆呈现紫色斑块,主要是这两种载体本身表面荷正电,会在血管壁吸附所致,而PLGA纳米复合物没有任何刺激性;3次给药后,载PEDF基因的阳离子脂质体和壳聚糖纳米复合物组的小鼠精神状态显著下降,而PLGA纳米复合物没有任何改变,连续给药2个月也未观察到任何不良反应。
综上,本发明PEDF基因PLGA纳米复合物就刺激性、细胞毒性、用药剂量、释放周期等方面均优于阳离子脂质体和壳聚糖纳米复合物,为临床安全、有效应用PEDF基因提供了一种新的手段。
机译: 包含近红外染料的白蛋白颗粒和基因传递载体的纳米复合物的制备方法及使用该复合物调节细胞内基因表达的方法
机译: 包含近红外染料的白蛋白颗粒和基因传递载体的纳米复合物的制备方法及使用该复合物调节细胞内基因表达的方法
机译: 用于非病毒基因组编辑的CRISPR纳米复合物及其制备方法