一种改进的促进小鼠克隆胚胎发育的培养方法

摘要

本发明涉及一种提高小鼠克隆胚胎发育率的方法，该方法为一种连续培养方法-D培养法，本发明还涉及两种提高小鼠克隆胚胎发育率的培养体系，本发明还涉及使用所述培养体系获得克隆动物的方法，以及使用所述培养体系获得胚胎干细胞的方法。本发明提高了小鼠克隆胚胎的发育率和核移植胚胎干细胞的建系效率，为克隆技术在生产上的应用研究开辟了新的思路，并且有助于动物克隆的进一步发展。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高小鼠克隆胚胎发育率的方法，该方法为一种连续培养方法-D培养法，本发明还涉及两种提高小鼠克隆胚胎发育率的培养体系，使用所述培养体系获得体细胞克隆动物的方法，以及使用所述培养体系获得胚胎干细胞的方法。

背景技术

近年来，体细胞核移植(SCNT)技术在很多物种中取得了成功，但是SCNT的效率仍然比较低。研究认为，体细胞核移植技术(SCNT)的低效性在很大程度上是由供体核重编程不完全造成的(Jouneau et al.，2003；Latham 2004)。为了提高重编程效率，人们研究尝试了很多的方法，包括重构胚的激活时机和DMSO的影响(Wakayama et al.，2001)，胞质分裂抑制剂的影响，去核和注核时机的影响(Wakayama et al.，2003)，电融合法(Ogura et al.，2000)以及显微操作技术方面包括压电陶瓷辅助(PEM)的两步法(Wakayama et al.，1998)和一步法(OSM)(Zhou Q et al.，2003)，但都没有取得显著的效果。考虑到DNA甲基化和组蛋白乙酰化都是影响体细胞重编程和克隆胚胎发育的重要表观遗传标记。人们研究了用病理学药剂改变供体细胞和胚胎的表观遗传修饰来提高体细胞被卵胞质重编程的能力。其中在SAH(S-腺苷同型半胱氨酸，S-adenosyl-homocysteine)和TSA(组蛋白去乙酰化酶抑制剂，trichostatin A)上的试验表明，SAH处理供体细胞后能够显著提高克隆胚胎的体外发育率，而TSA处理供体细胞或者重构胚均能够显著提高克隆效率和重编程效率(Rybouchkin et al.，2006；Byeong-Gyun Jeon et al.，2008；Kishigami et al.，2006)。但是这些药物对克隆胚胎长期影响尤其是在治疗性克隆中能否安全应用还有待研究。

研究发现，体外培养环境对胚胎发育有重要的影响。那么，改变体外培养条件或者优化体外培养液是否可以提高克隆胚胎体外发育能力呢？Chatot CL等通过对小鼠2细胞胚胎阻滞的研究发现，培养液中的葡萄糖在胚胎发育早期可能抑制一些关键的代谢过程，而谷氨酰胺是胚胎早期发育过程中首选的能量来源(Chatot CL et al.，1989)。传统上认定的那些在体外发育时2细胞发生阻滞或者不阻滞的小鼠品系的胚胎差异也可能与培养环境的渗透压有关(Hadi etal.，2005)。Kamjoo M等比较了小鼠品系和培养液对正常受精囊胚凋亡的影响，结果发现，遗传来源和培养液中的化学物质对凋亡的发生是同等重要的(Kamjoo et al.，2002)。体细胞胞质中的各个独立区域和分子团是依培养环境中成分的变化而重新定位的(Gajewskiet al.，2003)，表观遗传状态会受到培养环境的影响，例如培养液中的血清能改变与基因组印迹相关的表观遗传信息(Khosla et al.，2001)。小鼠合子中H19基因的表达可被体外培养环境所改变(Doherty et al.，2000)。Michele等研究发现，与那些正常受精合子不同，克隆胚胎的囊胚率和多能性标记Oct4mRNA在囊胚中的区域性分布高度依赖于核移植后的培养环境。第一个细胞周期以后，体细胞核的表观遗传修饰仍在继续；重构胚中核重塑的改变是有利于还是不利于建立合子基因程序要依赖于培养液中的特异的物质(Michele Boiani et al.，2005)。Heindryckx等用CZB、G1/G2和KSOM/G2培养克隆和孤雌胚胎的研究发现，克隆胚胎和孤雌胚胎对体外培养环境非常敏感，选择的培养液是否合适将显著影响胚胎的体外发育(Heindryckx et al.，2001)。由此可见，体外培养环境对小鼠各种来源的胚胎的发育是非常关键的，这也提示我们除了以上报道的提高克隆效率的方法外，研究和选择更好的胚胎体外培养体系将是影响小鼠胚胎尤其是克隆胚胎体外发育的重要因素。

因此，需要研究和筛选更好的胚胎体外培养方法和培养基来提高克隆胚胎的发育率，利用新的培养方法可为克隆动物的生产、以及克隆胚胎干细胞的获得带来新的发展契机。

发明内容

为了解决以上问题，我们将不同的培养液组合使用，各取优点，寻找更能促进小鼠克隆胚胎体外发育的培养液，我们首次发现一种连续培养方法-D培养法，能够显著地提高小鼠克隆胚胎的发育率。

本发明提供了一种提高小鼠克隆胚胎发育率的方法，其特征在于，所述方法为一种小鼠克隆胚胎的体外连续培养方法-D培养法，所述方法包括以下步骤：重构胚胎经激活后，于不含EDTA和谷氨酰胺的培养基中培养至克隆胚胎发育到二细胞期，然后换成KSOM培养基进行培养，培养至克隆胚胎发育到囊胚。该不含EDTA和谷氨酰胺的培养基是M16培养基或CZB-EG(不含EDTA和谷氨酰胺的CZB)培养基。重构胚胎通过去除核移植受体的染色体，进行核移植操作而获得。重构胚胎激活后即可称为克隆胚胎。

本发明涉及一种用于提高小鼠克隆胚胎发育率的培养体系，其特征在于，所述培养体系由用于在重构胚胎激活后将克隆胚胎培养发育到二细胞期的M16培养基以及用于将所述二细胞期的克隆胚胎培养发育到囊胚的KSOM培养基构成。

本发明还涉及另一种用于提高小鼠克隆胚胎发育率的培养体系，其特征在于，所述培养体系由用于在重构胚胎激活后将克隆胚胎培养发育到二细胞期的不合EDTA和谷氨酰胺的CZB，称为CZB-EG，以及用于将所述二细胞期的克隆胚胎培养发育到囊胚的KSOM培养基构成。

本发明涉及一种用于提高NT-ESC(核移植胚胎干细胞)建系效率的方法，其特征在于，重构胚胎经激活后，在M16或不含EDTA和谷氨酰胺的CZB培养基中培养至克隆胚胎发育到二细胞期，然后换成KSOM培养基进行培养，培养至克隆胚胎发育到囊胚，建立核移植胚胎干细胞系。

利用本发明的培养体系获得克隆动物的方法包括：在重构胚胎在激活液中激活后，用所述培养体系进行体外培养，即在M16培养基或者不合EDTA和谷氨酰胺的CZB培养基中培养至克隆胚胎发育到二细胞期，然后换成KSOM培养基进行培养，发育到囊胚阶段时，将其移植到代孕动物的子宫中，获得所述克隆动物。

利用本发明的培养体系获得核移植胚胎干细胞的方法包括：在重构胚胎在激活液中激活后，用所述培养体系进行体外培养，即在M16培养基或者不含EDTA和谷氨酰胺的CZB培养基中培养至克隆胚胎发育到二细胞期，然后换成KSOM培养基进行培养，发育到囊胚阶段时，分离核移植胚胎干细胞。

由上所述，本发明提高了小鼠克隆胚胎的发育率和核移植胚胎干细胞的建系效率，为克隆技术在生产上的应用研究开辟了新的思路，有助于动物克隆的研究；并且有助于动物克隆的进一步发展。

具体实施方式

材料与方法

1试剂

除非特别说明，本研究所用试剂均为Sigma(St.Louis，MO)公司产品。

2试验动物

B6D2F1小鼠(C57BL/6×DBA/2，8～12周)用来提供卵母细胞和颗粒细胞，C57BL/6(7～8周)和ICR雌鼠(8～12周)提供受精卵。8～12周ICR雌鼠还作为假孕受体。8～12周的ICR雄鼠一是用来做正常配种公鼠，二是结扎用作配假孕雄鼠。DBA雄鼠、C57BL/6和ICR雌鼠和ICR雄鼠购自北京维通利华有限公司。B6D2F1小鼠在本实验室繁殖获得，所有小鼠饲养于清洁级环境。

3培养液

表1  各培养液组成成分

试验所用的培养液主要有：CZB，M16，αMEM，KSOM。收集的卵母细胞暂时培养在CZB中，核移植胚胎分别培养在CZB，M16，αMEM，KSOM，M16+KSOM(D1)，αMEM+KSOM。重构胚胎激活液为无钙离子的CZB+10mM SrCl₂+5μg/ml CB(细胞松弛素B)。卵母细胞收集用HEPES-CZB溶液，核移植操作在HEPES-CZB-CB溶液中进行。

4卵母细胞、颗粒细胞收集

8～12周龄的B6D2F1雌鼠和ICR雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素10单位(PMSG，宁波)，48小时后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素10单位(hCG，宁波)，注射后15小时断颈处死小鼠，取下输卵管，镜下剥离膨大部，得到卵丘卵母细胞复合体(COC)。用透明质酸酶(300U/ml，ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，CA)消化COC，使颗粒细胞和卵母细胞分离，用HEPES-CZB清洗二次，卵母细胞移入CZB培养液中，放置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养。颗粒细胞放于核移植操作液中，取卵母细胞后20～30min进行核移植操作。

5正常受精卵和体细胞核移植(SCNT)克隆胚胎的制备

C57BL/6(7～8周)和ICR雌鼠(8～12周)用上面的程序超排后分别与DBA/2、ICR雄鼠合笼，第二天早上检栓，注射hCG后18～19小时用上面描述取卵母细胞的方法取受精卵，分别培养在不同的培养液中观察发育率。

体细胞核移植操作均采用一步法(OSM)，具体操作步骤参照我们以前的报道(Zhou et al.，2001；Zhou et al.，2003)。重构胚在CZB中孵育30min～60min后进行激活，SCNT重构胚放到含5μg/ml CB的无钙离子CZB中处理5～6小时，激活后的克隆胚胎培养于不同的培养液中观察并记录发育情况。

6受精胚胎和克隆胚胎试验程序

表2  受精胚胎试验程序

表3  克隆胚胎试验程序

受精胚胎试验程序如表2所示。举例而言，对于D1试验组，首先将受精胚胎在M16培养基中培养，直至受精胚胎发育到2细胞期，然后在KSOM培养基中培养，直至受精胚胎发育到囊胚。

克隆胚胎试验程序如表3所示。举例而言，对于D1试验组，首先将克隆胚胎在激活液中激活0h-5h后在M16培养基中培养，直至克隆胚胎发育到2细胞期，然后在KSOM培养基中培养，直至克隆胚胎发育到囊胚。

7NT-ES细胞系的建立和干细胞培养

NT-ES细胞系(核移植胚胎干细胞系)的建立和培养参照以前的报道(Zhao et al.，2007)。NT-ES细胞系建系所用的白血病抑制剂因子(LIF，leukaemia inhibitory factor)浓度是2000U(Chemicon，MA)，而胚胎干细胞培养所用的浓度是1000U。

8胚胎移植

SCNT囊胚移植到2.5天的ICR母鼠子宫中，妊娠母鼠在胚胎移植后19.5天剖腹产，出生后代经ICR母鼠代孕。

9数据统计分析

试验数据采用SPSS 13.0软件中的One-way ANOVA以及Fisher′s Exact Test进行数据统计分析，所有分析结果中P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

结果

D培养法可显著提高小鼠体细胞克隆胚胎的体外发育率

为了研究培养方法对小鼠胚胎体外发育的影响，我们比较了B6D2F1小鼠SCNT胚胎在不同的培养方法中的体外发育情况。

结果显示，不同培养液对克隆胚胎的体外发育影响很大。在4细胞期就已经出现了明显的差异，其中，D1、αMEM、αMEM/KSOM中培养的胚胎4细胞率之间没有显著差异，而显著高于CZB组(66.3％，P＜0.05)，但与M16和KSOM组差异不显著。同时，M16和KSOM组与CZB组也没有显著差异。但是到了桑葚胚，情况发生了变化，D1组的桑葚胚率极显著高于其它各组(P＜0.01)，而αMEM/KSOM组只与M16组差异显著，其余各组间没有显著差异。在囊胚期，D1组的囊胚率(62.3±7.2％)极显著高于其它各组(P＜0.01)。结果表明，D培养法可显著提高小鼠体细胞克隆胚胎的体外发育率。

表4克隆胚胎和受精胚胎在不同培养方法中的体外发育率

同列中肩注不同字母表示差异显著(P＜0.05)

D-法对SCNT(B6D2F1)胚胎到期发育的影响

为测定D1法培养的克隆囊胚的后期发育情况，我们将D1法培养的克隆囊胚进行了移植，移植后19.5天解剖到3只克隆小鼠，体重分别为2.10g，1.32g，1.54g，而胎盘分别是0.27g，0.20g，0.11g，与KOSM培养的克隆囊胚移植后获得的克隆小鼠的体重和胎盘重量类似。D1组的胎儿出生率几乎是KOSM的2倍(1.5％vs.0.857％)。结果表明，D1培养法可显著提高小鼠体细胞克隆胚胎的到期发育率。

不同培养方法对NT-ESCs建系效率的影响

为进一步检测D1培养法对体细胞重编程的影响，我们比较了不同培养方法获得的克隆囊胚的核移植胚胎干细胞系的建系效率。结果显示，D1组的退化囊胚比率比αMEM和KSOM组低，建系效率是αMEM组的两倍还多，也比KSOM组高。而且，D1培养法获得的克隆囊胚的比率显著高于其他培养法，因此从重构胚开始计算，D1培养法可以显著提高NT-ESCs的建系效率。

表5：不同培养方法的NT-ESCs建系效率

同列中肩注不同字母表示差异显著(P＜0.05)

培养液中EDTA和Glutamine对克隆胚胎发育的影响

为了弄清楚为何M16和KSOM组合可以提高克隆胚胎的体外发育而其他培养也例如αMEM/CZB+KSOM却不能提高SCNT胚胎的体外发育率，我们对CZB和M16的组成成分进行了比较，结果发现M16中没有EDTA和Glutamine，是否正是由于缺乏这两个成分才使M16+KSOM促进了SCNT胚胎的体外发育呢？因此我们在CZB中去除了EDTA或/和Glutamine，对SCNT胚胎进行培养，结果显示，培养在D1培养体系和CZB-Gln-EDTA(即去除了EDTA和Glutamine成分的CZB培养基)+KSOM培养体系中的体细胞核移植的桑葚胚和囊胚率都显著高于其它各组，培养在CZB-Gln-EDTA(即去除了EDTA和Glutamine成分的CZB培养基)+KSOM培养体系中的体细胞核移植的桑葚胚和囊胚率分别是61.2％和52.5％。CZB+KSOM组中的囊胚率最低(15.9％)，与CZB-Gln(即去除了Glutamine成分的CZB培养基)+KSOM组差异不显著，但显著低于CZB-EDTA(即去除了EDTA成分的CZB培养基)+KSOM组，由此可见，去除了EDTA后的CZB与KSOM联合应用也能在一定程度上提高克隆胚胎的发育，但是仍达不到D1组的效果，只有去除EDTA和Glutamine后的培养效果才与D1组相同。

为了进一步证明M16+KSOM促进SCNT体外发育是因为M16中不含有EDTA和Glutamine，我们在M16中添加了0.11mM的EDTA(Sigma)和1.0mM的Glutamine(Sigma)后再联合KSOM对SCNT胚胎进行体外培养，结果发现，添加了EDTA和Glutamine的M16+KSOM丧失了促进SCNT胚胎体外发育的能力(18.6％(添加)vs.62.3％(未添加))。

研究表明，证明培养液中添加EDTA和Glutamine不利于克隆胚胎的早期(晚期2细胞之前)发育。M16+KSOM组合培养液正是因为M16不含有EDTA和Glutamine才具备了提高SCNT胚胎体外发育的能力。

因此，本发明的D培养法，包括D1培养法以及D2培养法，D1培养法即，在重构胚胎经激活后，在M16培养基中培养至克隆胚胎发育到二细胞期，然后换成KSOM培养基进行培养，培养至克隆胚胎发育到囊胚；D2培养法即，重构胚胎经激活后，在不含乙二胺四乙酸和谷氨酰胺的CZB培养基中培养至克隆胚胎发育到二细胞期，然后换成KSOM培养基进行培养，培养至克隆胚胎发育到囊胚。

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