豆酱中生物胺的分离和液相色谱柱柱前衍生化方法

摘要

本发明公开了一种豆酱中生物胺的分离和液相色谱柱柱前衍生化方法，包括以下步骤：(1)向豆酱中加入三氯乙酸溶液，均质，离心，收集上清液；(2)向上清液中加入正己烷，振荡，静止分层后取出下层三氯乙酸相，备用；(3)向三氯乙酸相中加入NaOH溶液，再加入NaHCO3溶液缓冲，混合丹磺酰氯丙酮溶液进行衍生；(4)氨水去除丹磺酰氯终止反应，得到衍生液，过滤。本发明分离方法处理过程简单，消耗试剂少，避免了转移时所造成的分析物损失。经本发明分离净化后可达到检测要求，谱图杂峰干扰少且待测物损失小，生物胺的回收率可达到80％以上。本发明方法确定了衍生生物胺的最佳条件，丹磺酰氯衍生产物稳定，检测灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物胺的分离和衍生化方法，尤其涉及从豆酱中分离生物胺以及将生物胺液相色谱柱柱前衍生化的方法，属于生物胺的分离和检测领域。

背景技术

豆酱中的生物胺主要是通过其中存在的微生物所产生的氨基酸脱羧酶的脱羧作用而生成的。生物胺的产生需要3方面的条件：存在生成生物胺的前体物质-游离氨基酸；具有可使氨基酸发生脱羧反应的条件；适宜微生物生长的环境。

豆酱发酵过程中由于微生物作用生成的生物胺有组胺、腐胺、尸胺、色胺、酪胺、β-苯乙胺、精胺和亚精胺等。生物胺中如N-亚硝胺被认为是致癌物质，目前已有关于高生物胺含量的豆类产品的报道。韩国豆酱含盐量很高(大约12％或者更高)，很可能会导致高血压和肾脏疾病，因此需采用低盐发酵技术，但低盐条件比高盐条件更适合于微生物的生长，在低盐发酵过程中很可能会产生更多的生物胺。在豆酱发酵过程中采用照射技术可以阻止微生物的生长，从而有效抑制生物胺的形成。

豆酱自然发酵过程中，涉及微生物的种类很多，豆酱中生物胺的形成与微生物有密切关系，但并非所有种类的微生物都会产生氨基酸脱羧酶，生成生物胺。豆酱发酵过程主要包括细菌、酵母菌、霉菌，这些微生物都有可能与生物胺的形成有关。不同微生物分解蛋白的能力不同，一般真菌比细菌易分解蛋白质。细菌中能分解蛋白质的有变形杆菌、梭菌、芽孢菌、假单胞菌和小球菌等，它们只有在大量繁殖时才可以形成蛋白酶。微生物产生蛋白酶，分解蛋白质形成各种短肽，然后在肽酶作用下生成氨基酸，游离氨基酸是影响生物胺形成的重要因素之一，它对豆酱中生物胺的形成具有重要作用。大豆的蛋白质含量较高，在豆酱发酵过程中，随发酵时间的增加，越来越多的蛋白质被降解，游离氨基酸、肽分子的含量随之增加，这些物质均可作为微生物所产生的脱羧酶的催化反应底物，从而生成各种生物胺。

由于多数微生物的生长受温度影响很大，在适于微生物生长的温度时，会产生大量生物胺。低温下产胺菌生长缓慢，导致食品中生物胺含量较低。贮存温度越高，生物胺含量增加速度越快。由于生物胺具有潜在的毒性，因此豆酱中生物胺的生成必须引起高度重视。

分析检测样品中的生物胺时，首先是要把生物胺从基质中提取出来。生物胺的提取一般选用酸性介质或有机相介质。酸性介质一般有盐酸、高氯酸和三氯乙酸；有机相介质如甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷等，还有用乙腈-高氯酸、二氯甲烷-高氯酸等混合液作为生物胺的提取介质。肉类、水产品及植物性食品中生物胺的提取，一般采用浓度为0.1～0.5mol/L的盐酸、0.4～0.6mol/L的高氯酸或5～6％的三氯乙酸等酸性介质提取，由于在这些样品中5％的三氯乙酸对蛋白质的沉淀效果好于盐酸，因此提取蛋白含量较高样品中的生物胺时，三氯乙酸的使用较多。但对于奶酪中生物胺的提取一般采用0.1mol/L盐酸效果较好。

食品基质成分比较复杂，常含有蛋白质、游离氨基酸、脂肪、糖类、多酚类化合物和一些其他成分等。这些成分的存在会影响生物胺的有效分离和准确定性定量，同时也会降低检测设备的灵敏度，具有堵塞色谱柱的危险。因此应用高效液相色谱法检测生物胺时，在衍生化前还需对基质复杂的食物样品中生物胺的提取液进行净化处理。生物胺的净化方法目前主要有两种：一种是采用固相萃取(SPE)法；另一种是采用有机溶剂的液-液萃取法。

目前净化生物胺的固相萃取方法主要采用SPE C₁₈柱和强阴离子交换(SAX)柱。SPE C₁₈柱属于非极性柱，能够除去非极性物质。含生物胺的液体无需处理就可直接过C₁₈柱，多酚和非极性物质被保留在柱上，达到净化生物胺的目的。SAX柱是强阴离子交换柱，阴离子物质可被除去，同时还可起到浓缩和脱色的作用。SAX柱的净化效果比SPE C₁₈柱好。过SAX柱时样品提取液的pH是影响净化效果的关键因素，将液体食品或提取液的pH调到8(使多酚和氨基酸呈阴离子态)，样品经过柱后，阳离子状态的生物胺保留在柱上。

液-液萃取是采用一种有机溶剂或几种混合有机溶剂萃取出样品中的生物胺，从而达到净化的目的。这一方法虽然操作步骤较繁琐，但可以得到较高的灵敏度。液-液萃取的基本步骤是：样品提取液先用盐进行饱和处理，然后调pH至碱性，最后用有机溶剂(正丁醇，正丁醇-氯仿)萃取。其中饱和所用盐的种类、溶液的pH和有机溶剂的选择是影响液-液萃取效果的重要因素。盐可以促使生物胺进入有机相，但Na₂CO₃会改变溶液的pH，所以一般选用NaCl作为饱和用盐。pH影响部分生物胺的萃取效率，研究认为pH11.5时生物胺回收率最高。液-液萃取中，利用三氯乙酸提取比利用HCl提取生物胺时对pH的要求更严格。正丁醇萃取时，组胺、酪胺的回收效果较好，但腐胺、尸胺、精胺和亚精胺的回收率较低。正丁醇-氯仿(1∶1，v/v)比正丁醇容易蒸干，但在处理奶类制品时会产生难于分离的胶体。所以，处理乳制品时一般采用正丁醇为萃取溶剂，其他种类食品则采用正丁醇-氯仿(1∶1，v/v)为萃取溶剂。由于净化方法繁琐，也有研究者对液体样品(如葡萄酒)或食品生物胺提取液仅用滤膜(0.22～0.45μm)处理，然后衍生化或直接进样(自动衍生)。

常用的柱前衍生剂有丹磺酰氯、邻苯二甲醛、二硝基苯甲酰氯和荧光胺等，也有研究用9-芴基甲基-氯甲酸酯和苯基异硫氰酸盐作为生物胺的衍生剂。选择衍生剂时，要以衍生产物稳定性好、杂质少、衍生过程简单为原则，但所有衍生试剂都有一定的局限性。二硝基苯甲酰氯衍生物和苯基异硫氰酸盐衍生物不具备荧光特性，不能用荧光检测器检测，只能紫外检测器进行检测，其方法灵敏度低于其他衍生试剂。9-芴基甲基-氯甲酸酯衍生物具有荧光特性，灵敏度、稳定性都很好，但它产生从单胺到多胺的多重产物，在检测基质复杂的样品和多种混合标准物时干扰严重；邻苯二甲醛的优点是能与初级胺在几分钟内反应生成较强的荧光物质，因衍生所需时间短，容易实现自动化，一般的柱前、柱后衍生均采用邻苯二甲醛试剂；但邻苯二甲醛衍生物不稳定，衍生后不允许净化，并且对衍生条件有严格的要求，为避免干扰，增加灵敏度，以邻苯二甲醛为衍生剂时，需加入2-巯基乙醇。丹磺酰氯衍生反应时间较长，但产物稳定，于暗处4℃保存一个月损失不超过10％。检测灵敏度也较高，柱前、柱后衍生均可使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是对现有的从豆酱中分离生物胺的方法以及生物胺的液相色谱柱柱前衍生化方法的各种工艺或条件进行优化和筛选，得到一套完整的从豆酱中分离生物胺的方法以及生物胺的液相色谱柱柱前衍生化方法，该方法具有分离效率高、衍生化效果高等优点。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

豆酱中生物胺的分离和液相色谱柱柱前衍生化方法，包括以下步骤：(1)向豆酱中加入三氯乙酸溶液，均质，离心，收集上清液；(2)向上清液中加入正己烷，振荡，静止分层后取出下层三氯乙酸相，备用；(3)向三氯乙酸相中加入NaOH溶液，再加入NaHCO₃溶液缓冲，混合丹磺酰氯丙酮溶液进行衍生化反应；(4)氨水去除丹磺酰氯终止反应，得到衍生液；衍生液过滤，即得。

优选的，步骤(1)中向豆酱中加入1.5倍豆酱质量的5％三氯乙酸溶液；所述的均质优选为在10000r/min转速下均质3min；所述的离心优选为在3500r/min转速下离心5min；

优选的，步骤(2)中向上清液中加入等体积的正己烷；

步骤(3)中向三氯乙酸相中加入2mol/L NaOH溶液，其中三氯乙酸相与2mol/L NaOH溶液的体积比为5∶1；再接着加入饱和NaHCO₃溶液进行缓冲，其中，饱和NaHCO₃溶液与三氯乙酸相的体积比为3∶10；

步骤(3)中所述的衍生条件优选为：衍生剂丹磺酰氯丙酮溶液用量为三氯乙酸相体积的1.5倍、衍生时间为40min，衍生温度为40℃。

步骤(4)中加入0.5倍初始体积的氨水去除丹磺酰氯终止反应，最后用乙腈定容至25倍初始体积；衍生处理后用0.22μm的微孔滤膜过滤，用于液相色谱分析检测。

本发明分离方法处理过程简单，采用微量的三氯乙酸-正己烷的液-液萃取净化法消耗试剂少，并且避免了转移时所造成的分析物损失。经本发明分离净化后可达到检测要求，谱图杂峰干扰少且待测物损失小，生物胺的回收率均可达到80％以上。本发明采用丹磺酰氯做为衍生剂，确定了衍生生物胺的最佳条件，丹磺酰氯衍生产物稳定，检测灵敏度高。

附图说明

图1空白豆酱样品(a)和加标豆酱样品(b)的HPLC-DAD色谱图。

图2空白豆酱样品(a)和加标豆酱样品(b)的HPLC-FLD色谱图。

图3丹磺酰氯用量对生物胺衍生效果的影响。

图4时间对生物胺衍生效果的影响。

图5温度对生物胺衍生效果的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

称取东北地区自然发酵黄豆酱4g于离心管中，加6mL的5％三氯乙酸溶液，10000r/min，均质3min。均质后3500r/min离心5min。收集上清液，残渣用6mL 5％的三氯乙酸重复提取1次，合并提取液，再加入6mL正己烷除去脂类杂质，剧烈振荡后静止分层，弃去正己烷层，再加入6mL正己烷重复操作1次，分层后取出下层三氯乙酸相。将10mg的丹磺酰氯溶于1mL的丙酮中，新鲜制备并避光保存。将200μL、2mol/L的NaOH溶液加入至1mL样品溶液中，然后加300μL的饱和NaHCO₃溶液缓冲。加入1.5mL的丹磺酰氯溶液，将混合后的溶液放入40℃恒温箱保温处理40min之后，加入100μL的氨水去除丹磺酰氯终止反应，最后用乙腈定容至5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤用于分析检测生物胺(检测方法及检测结果见试验例1)。

实施例2

称取研磨细碎后东北地区产豆瓣酱6g于离心管中，加12mL的5％三氯乙酸溶液，10000r/min，均质3min。均质后3500r/min离心5min。收集上清液，残渣用12mL 5％的三氯乙酸重复提取1次，合并提取液，再加入12mL正己烷除去脂类杂质，剧烈振荡后静止分层，弃去正己烷层，再加入12mL正己烷重复操作1次，分层后取出下层三氯乙酸相。将10mg的丹磺酰氯溶于1mL的丙酮中，新鲜制备并避光保存。将400μL、2mol/L的NaOH溶液加入至2mL样品溶液中，然后加600μL的饱和NaHCO₃溶液缓冲。加入3mL的丹磺酰氯溶液，将混合后的溶液放入40℃恒温箱保温处理40min之后，加入200μL的氨水去除丹磺酰氯终止反应，最后用乙腈定容至10mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤用于分析检测生物胺(检测方法及检测结果见试验例1)。

实施例3

称取工业化生产的调味黄豆酱10g于离心管中，加15mL的5％三氯乙酸溶液，10000r/min，均质3min。均质后3500r/min离心5min。收集上清液，残渣用15mL 5％的三氯乙酸重复提取1次，合并提取液，再加入15mL正己烷除去脂类杂质，剧烈振荡后静止分层，弃去正己烷层，再加入15mL正己烷重复操作1次，分层后取出下层三氯乙酸相。将10mg的丹磺酰氯溶于1mL的丙酮中，新鲜制备并避光保存。将200μL、2mol/L的NaOH溶液加入至1mL样品溶液中，然后加300μL的饱和NaHCO₃溶液缓冲。加入1.5mL的丹磺酰氯溶液，将混合后的溶液放入40℃恒温箱保温处理40min之后，加入100μL的氨水去除丹磺酰氯终止反应，最后用乙腈定容至5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤用于分析检测生物胺(检测方法及检测结果见试验例1)。

试验例1HPLC-DAD和HPLC-FLD方法检测生物胺的回收率、精密度和检测限

1、柱前衍生

(1)丹磺酰氯溶液配制：将10mg的丹磺酰氯溶于1mL的丙酮中，新鲜制备并避光保存。

(2)衍生步骤：将200μL、2mol/L的NaOH溶液加入至1mL标准溶液及样品溶液中，然后加300μL的饱和NaHCO₃溶液缓冲。加入1.5mL的丹磺酰氯溶液，将混合后的溶液放入40℃恒温箱保温处理40min之后，加入100μL的氨水去除丹磺酰氯终止反应，最后用乙腈定容至5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤，用于分析检测。

2、高效液相色谱(HPLC)法检测生物胺

Agilent ZORBAX XDB-C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相用0.01mol/L的KH₂PO₄(pH 3.5)和甲醇进行梯度洗脱，流速1.0mL/min，梯度洗脱程序见表1；分别采用二级管阵列检测器(DAD)和荧光检测器(FLD)进行测定：紫外检测波长为254nm、荧光检测激发波长(Ex)330nm、发射波长(Em)465nm；进样量20μL；柱温30℃。

表1梯度洗脱程序

HPLC-DAD方法检测生物胺的方法学验证

方法的线性范围

在0.5～50mg/kg浓度范围内分别添加7种生物胺的混合标准溶液，配制浓度为0.5、1、5、25、50mg/kg的系列标准溶液，按照上述进行衍生和检测。根据7种生物胺的平均峰面积(y，n＝5)与相应生物胺的标准浓度(x，mg/kg)进行线性回归，绘制标准校正曲线，经Agilent工作站软件分析处理后，7种生物胺的线性回归方程见表2。

表27种生物胺的线性回归方程及相关系数(R2)

y：the mean peak area of 7 BAs(n＝5)；

x：mass concentrations of 7 BAs(mg/kg).

方法的回收率、精密度和检出限

选用不含7种待测组分的空白豆酱样品，分别添加1、10和50mg/kg三个浓度水平的7种生物胺的混合标准溶液，按建立的方法处理样品，分析检测并计算回收率和精密度，测得平均回收率(n＝5)范围在76.3～110.2％之间，相对标准偏差为3.3～9.1％。空白豆酱样品和加标豆酱样品如图1。

本试验在标准添加回收率试验的最低质量浓度点0.5mg/kg，各种生物胺的信噪比(S/N)均大于10，并且具有较好的回收率，故确定各生物胺的定量限为0.5mg/kg；以3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限，7种生物胺的回收率、精密度及检出限见表3。

表37种生物胺的添加回收率、精密度和检出限(n＝5)

^a检出限：信噪比为3

HPLC-FLD方法检测生物胺的方法学验证

方法的线性范围

在0.1～50mg/kg浓度范围内分别添加7种生物胺的混合标准溶液，配制浓度为0.1、0.5、5、25、50mg/kg的系列标准溶液，按照建立的方法进行衍生和检测。根据7种生物胺的平均峰面积(y，n＝5)与相应生物胺的标准浓度(x，mg/kg)进行线性回归，绘制标准校正曲线，经Agilent工作站软件分析处理后，7种生物胺的线性回归方程见表4。

表47种生物胺的线性回归方程及相关系数(R2)

y：the mean peak area of 7 BAs(n＝5)；

x：mass concentrations of 7 BAs(mg/kg).

方法的回收率、精密度和检出限

选用不含7种待测组分的空白豆酱样品，分别添加0.5、5和50mg/kg三个浓度水平的7种生物胺的混合标准溶液，按建立的方法处理样品，分析检测并计算回收率和精密度，测得7种生物胺平均回收率(n＝5)范围在74.7～105.1％之间，相对标准偏差为2.1～9.7％。加标豆酱样品如图2。

本试验在标准添加回收率试验的最低质量浓度点0.1mg/kg，各种生物胺的信噪比(S/N)均大于10，并且具有较好的回收率，故确定各生物胺的定量限为0.1mg/kg；以3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限，7种生物胺的回收率、精密度及检出限见表5。

表57种生物胺的添加回收率、精密度和检出限(n＝5)

^a检出限：信噪比为3

试验例2生物胺衍生条件的优化试验

在生物胺的衍生过程中，衍生剂的用量、衍生温度、衍生时间等因素都会影响衍生反应的进行及衍生产物的稳定性，从而影响检测灵敏度。本试验采用丹磺酰氯做为衍生剂，对衍生条件进行优化，确定Dns-C1衍生生物胺的最佳条件。

1衍生剂用量的选择

衍生剂与生物胺标准溶液的体积比(v/v，丹磺酰氯浓度10mg/mL)分别选择：0.5、1、1.5、2，其他条件不变，按上述方法进行衍生和检测。生物胺混标浓度：50mg/L。每组做3次平行试验，取3次测定生物胺标准品峰面积平均值表示生物胺的衍生效率，结果如图3。

图3显示，衍生剂用量超过样液1.5倍以上后，生物胺的衍生效率不再提高，说明此时衍生剂已经饱和，没有必要再增加衍生剂用量。因此，本试验确定利用Dns-C1衍生时，衍生剂用量与样品体积比为1.5时，可以达到理想的生物胺衍生效果。

2、衍生时间的选择

生物胺衍生时间分别设定为：20min、30min、40min、50min、60min，其他条件保持不变，按上述方法进行衍生和检测。生物胺混标浓度为：50mg/L。每组做3次平行试验，计算3次平行试验的平均值。结果如图4。

图4显示，生物胺衍生40min时，衍生效率达到最高值，继续延长衍生时间对衍生效率影响不大。因此本试验选择40min作为最佳衍生时间。

3、衍生温度的选择

生物胺衍生温度分别为：室温、30℃、40℃、50℃、60℃，其他条件保持不变，按上述方法进行衍生和测定。生物胺混标浓度：50mg/L。每组做3次平行试验，计算3次平行试验的平均值。结果如图5。

图5显示，在本衍生方法中，酪胺、苯乙胺、组胺和腐胺从室温到40℃衍生效率变化较大，40℃后继续升温对衍生效率影响不大；尸胺、精胺和亚精胺从室温到60℃范围内，衍生效率变化不大。室温和30℃衍生时，衍生液常有深浅不均的黄色，40℃时黄色基本消失。因此，本试验选择40℃为生物胺丹磺酰氯衍生的最佳温度。