一种基于磁纳米颗粒的多功能EPR生物探针及其应用

摘要

本发明涉及一种基于磁纳米颗粒的多功能EPR生物探针及其应用，所述探针具有式(1)所示结构，其由R的二元或多元有机酸修饰共沉淀法得到的四氧化三铁或三氧化二铁纳米颗粒，该磁纳米颗粒表面富含羧基或羟基，与带有羟基或氨基的哌啶氮氧自由基化合物(其结构式如式(2)或式(3)所示)在1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二酰亚胺和N-羟基丁二酰亚胺作用下，于水相中进行反应后获得。本发明所制备得到的磁纳米颗粒很容易在水中分散，并把小分子氮氧自由基化合物作为官能团引入磁纳米颗粒，得到极易在水中分散且具有优良性能的EPR生物探针材料，其在动物体内有良好的生物相容性、能迅速扩散到动物组织中，并可通过EPR检测其有选择的分布于小鼠的心、肝、肺等器官。

说明书

【技术领域】

本发明涉及多功能EPR生物探针技术领域，具体地说，是一种基于磁纳米颗粒的多功能EPR生物探针及其应用。

【背景技术】

纳米技术与生物分子、药物的紧密结合已经产生了一个新的领域--纳米生物技术。纳米尺度的磁性材料由于其独具的特性，一直成为研究的热点。因为铁氧磁性微粒良好的生物相容性，在外加磁场作用下可定向移动，表面所带活性基团可被修饰，因而广泛用于细胞分选、酶固定、药物载体、肿瘤的靶向治疗、核磁共振成像增强剂等生物和医学领域。

近年来，电子顺磁共振(Electron Paramagnetic Resonance，EPR)波谱在生物医学领域的应用日渐广泛。EPR分析技术能够直接或间接的给出生物体内的诸多信息，可以用来研究生物体内自由基的变化、细胞、蛋白质以及生物体的新陈代谢等情况。随着EPR检测技术的发展，检测信息的准确性以及检测灵敏度都有很大的提高。但由于可用于生物体的顺磁材料仍然有限，限制了EPR生物传感器的发展，研究开发新型EPR探针及材料是EPR检测技术得以广泛应用的关键。

氮氧自由基是一种具有很高的EPR波谱灵敏度和特殊结构稳定性的自由基，被广泛应用于生物医学和药理学等领域的研究中。低分子量的氮氧自由基化合物是一类相对稳定的自由基，它们低毒、无致癌及致突变作用，因而被广泛用于自旋标记、核磁共振成像、抗癌、抗氧化、电子顺磁共振生物医学传感器等生物医学研究中。特别是哌啶类氮氧自由基及其衍生物是近年来研究的热点，如作为自旋标记物研究生物大分子的生理变化，标记药物分子研究药物的代谢过程以及用作抗氧化试剂等等。

尽管氮氧自由基以及其衍生物被广泛应用于生物医学领域的研究中，但是单纯的氮氧自由基及其衍生物作为自旋标记物在生物体内很难将其定域于所需的位置，限制了其在生物体内的应用。因此，将磁性微粒与氮氧自由基结合，发挥两者的优势，制备得到用于在线EPR生物检测的生物探针。对于探索生物体的某些病理过程、生物过程具有极大意义。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于磁纳米颗粒的多功能EPR生物探针及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于磁纳米颗粒的多功能EPR生物探针，其具有式(1)所示结构

结构式1

式中：R为C₂～C₄烷基，X为O或NH；

一种基于磁纳米颗粒的多功能EPR生物探针的制备方法，具体步骤如下：

(1)向试剂瓶中依次加入Fe³⁺，Fe²⁺的水溶液；

(2)向步骤(1)的体系中于N₂保护，40～90℃下逐滴滴加适量氨水，剧烈机械搅拌，得到黑色四氧化三铁磁纳米或三氧化二铁颗粒；

(3)向步骤(2)的体系中加入二元或多元脂肪水溶液，继续搅拌即可得到表面羧基化的磁纳米颗粒；该磁纳米颗粒易在水中分散，分散后的水溶液呈黄褐色；

(4)步骤(3)得到的功能化磁纳米颗粒纯化后，于水中分散，再与带有羟基或氨基的哌啶氮氧自由基化合物，其结构式如式(2)和式(3)所示，在1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NAS)作用下反应得到目标产物；所得产物很易在水中分散；

结构式2             结构式3

在本发明中，所涉及的原料及试剂均为市售品。

本发明所述的新型EPR生物探针通过傅立叶变换-红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)、透射电子显微镜(TEM)、电子顺磁共振(EPR)等对其结构与性能进行了表征。FT-IR(图2)测试结果表明成功制备得到了有氮氧自由基自旋标记的磁纳米颗粒。XRD(图3)分析结果，与氧化铁标准品对照，证明为氧化铁颗粒，并且从图谱中估算氧化铁晶体的粒径约为8.0～17.0nm；该磁纳米颗粒易在水中分散，透射电子显微镜(图4)观察，磁纳米颗粒分布均匀，分散性好。通过EPR(图5)测试，可以观察到明显的哌啶氮氧自由基三重峰精细结构。

经过初步的小鼠体内实验探索得知(图6)，基于新型磁纳米颗粒的多功能EPR生物探针在动物体内有良好的生物相容性、能迅速扩散到动物组织中，并能有选择的分布于小鼠的心、肝、肺等器官。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

本发明制备的磁纳米颗粒很容易在水中分散，并把小分子氮氧自由基化合物作为官能团引入磁纳米颗粒，得到极易在水中分散且具有优良性能的EPR生物探针材料。

本发明的R为C₂～C₄烷基，其中，低于或者高于C₂～C₄烷基所制备的产物在水中不易分散，通过对比例的数据可以证明。

【附图说明】

图1FcNT、FmNT、FeNT、FaNT、FsNT水中分散照片；A，FeNT；B，FmOT；C，FcNT；D，FaNT；E，FmNT

图2Fe₃O₄、Fc、FcNT的FT-IR谱图对比；A：Fe₃O₄；B：Fc；C：FcNT

图3FcNT的XRD谱图；

图4FcNT的TEM图；

图5生物探针在体外测试的EPR谱图；S，固态颗粒；L，分散于溶液中；P，精细结构片段扫描

图6生物探针在小鼠各个器官中分布的EPR谱图；

图7对比例中所得生物探针在体外测试的EPR谱图；S，固态颗粒；L，分散于溶液中；P，精细结构片段扫描。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种基于磁纳米颗粒的多功能EPR生物探针及其应用的具体实施方式。

实施例1

称取2.16g FeCl₃·6H₂O于50ml圆底烧瓶中，加20ml双蒸水使其溶解，超声后待用。另取一50ml圆底烧瓶，称取4.20g柠檬酸并加10ml双蒸水，磁力搅拌30min后待用。在250ml的四口烧瓶中加入1.12g FeSO₄·7H₂O，并加入20ml双蒸水使其溶解，机械搅拌下加热至50℃，通氮气除氧30min。随后加入待用的FeCl₃溶液，并加热至70℃，达到反应条件后，缓慢逐滴加入5～15ml氨水，滴加结束后老化30min。随后增大搅拌强度，一次性加入待用的柠檬酸(CA)溶液，反应1.5h后，自然冷却并用磁铁分离出颗粒。称取10mg上述颗粒于50ml圆底烧瓶中，加入10ml双蒸水，冰水浴下磁力搅拌至完全分散。然后在0℃下依次加入31.8mg(0.15mmol)EDC·HCl、19.2mg(0.15mmol)NHS。混合物冰水浴下反应30min后，加入50mg 4-NH₂-TEMPO。随后自然升温到室温，磁力搅拌24h。反应结束后分别用无水乙醚、二氯甲烷各萃取两次(每次约50ml)，除去未反应的4-NH₂-TEMPO。用磁铁分离，得到有磁性的物质，40℃真空干燥得到黑色固体，即为目标产物，FcNT。

实施例2

称取1.08g FeCl₃·6H₂O于50ml圆底烧瓶中，加20ml双蒸水使其溶解，超声后待用。另取一50ml圆底烧瓶，称取2.08g丙二酸并加10ml双蒸水，磁力搅拌30min后待用。在250ml的四口烧瓶中加入0.56g FeSO₄·7H₂O，并加入20ml双蒸水使其溶解，机械搅拌下加热至40℃，通氮气除氧30min。随后加入待用的FeCl₃溶液，并加热至80℃，达到反应条件后，缓慢逐滴加入5～15ml氨水，滴加结束后老化30min。随后增大搅拌强度，一次性加入待用的丙二酸(MA)溶液，反应1.5h后，自然冷却并用磁铁分离出颗粒。称取10mg上述颗粒于50ml圆底烧瓶中，加入10ml双蒸水，冰水浴下磁力搅拌至完全分散。然后在0℃下依次加入31.8mg(0.15mmol)EDC·HCl、19.2mg(0.15mmol)NHS。混合物冰水浴下反应30min后，加入50mg 4-OH-TEMPO。随后自然升温到室温，磁力搅拌24h。反应结束后分别用无水乙醚、二氯甲烷各萃取两次(每次约50ml)，除去未反应的4-OH-TEMPO。用磁铁分离，得到有磁性的物质，40℃真空干燥得到黑色固体，即为目标产物，FmNT。

实施例3

将昆明种小白鼠(三周左右，测试时小鼠平均体重10g)随机分成5组(N＝3)，每组分别注射一定剂量的改性磁纳米颗粒(Fe₃O₄-CA-4-NH₂-TEMPO)悬浮液，间隔时间为0.5小时、1小时、2小时、3小时处死小白鼠，分别取血、心、肝、脾、肺、肾样品。在血样中加入抗凝剂，离心取血清；其余各脏器分别制成50％的组织匀浆。取样之后组织匀浆以冰块保存，待EPR测试；留取一组长时间观察。

通过观察得知：一周、二周、三周后小鼠无异常反应。初步试验表明材料毒性较小，样品经皮下注射，小鼠在一个月内无异常表现；体内分布实验表明，新型EPR生物探针可以通过血液循环迅速到达动物组织中，并且有选择的分布于小鼠的心、肝、肺等器官。

对比例4

称取1.08g FeCl₃·6H₂O于50ml圆底烧瓶中，加20ml双蒸水使其溶解，超声后待用。另取一50ml圆底烧瓶，称取1.26g草酸并加10ml双蒸水，磁力搅拌30min后待用。在250ml的四口烧瓶中加入0.56g FeSO₄·7H₂O，并加入20ml双蒸水使其溶解，机械搅拌下加热至40℃，通氮气除氧30min。随后加入待用的FeCl₃溶液，并加热至80℃，达到反应条件后，缓慢逐滴加入5～15ml氨水，滴加结束后老化30min。随后增大搅拌强度，一次性加入待用的草酸(EA)溶液，反应1.5h后，自然冷却并用磁铁分离出颗粒。称取10mg上述颗粒于50ml圆底烧瓶中，加入10ml双蒸水，冰水浴下磁力搅拌至完全分散。然后在0℃下依次加入31.8mg(0.15mmol)EDC·HCl、19.2mg(0.15mmol)NHS。混合物冰水浴下反应30min后，加入50mg 4-NH₂-TEMPO。随后自然升温到室温，磁力搅拌24h。反应结束后分别用无水乙醚、二氯甲烷各萃取两次(每次约50ml)，除去未反应的4-NH₂-TEMPO。用磁铁分离，得到有磁性的物质，40℃真空干燥得到黑色固体，即为目标产物，FeNT。所得最终产物经EPR测试，由测试结果(见图7)可以看出，由于其接枝链较短，自旋标记后氮氧自由基的EPR很弱，不适合进一步用于体内测试。

对比例5

称取2.16g FeCl₃·6H₂O于50ml圆底烧瓶中，加20ml双蒸水使其溶解，超声后待用。另取一50ml圆底烧瓶，依次称量加入4.20g己二酸(AA)、1.6gNaOH、10ml双蒸水，磁力搅拌至完全溶解后待用。在250ml的四口烧瓶中加入1.12g FeSO₄·7H₂O，并加入20ml双蒸水使其溶解，机械搅拌下加热至50℃，通氮气除氧30min。随后加入待用的FeCl₃溶液，并加热至70℃，达到反应条件后，缓慢逐滴加入10ml氨水，滴加结束后老化30min。随后增大搅拌强度，一次性加入10ml待用的己二酸盐溶液，继续反应1.5h，自然冷却后用磁铁分离出颗粒。称取10mg上述颗粒于50ml圆底烧瓶中，加入10ml双蒸水，冰水浴下磁力搅拌至完全分散。然后在0℃下依次加入31.8mg(0.15mmol)EDC·HCl、19.2mg(0.15mmol)NHS。混合物冰水浴下反应30min后，加入50mg 4-NH₂-TEMPO。随后自然升温到室温，磁力搅拌24h。反应结束后分别用无水乙醚、二氯甲烷各萃取两次(每次约50ml)，除去未反应的4-NH₂-TEMPO。用磁铁分离，得到有磁性的物质，40℃真空干燥得到黑色固体，即为目标产物，FaNT。

对比例6

称取2.16g FeCl₃·6H₂O于50ml圆底烧瓶中，加20ml双蒸水使其溶解，超声后待用。另取一50ml圆底烧瓶，依次称量加入2.02g癸二酸(SA)、1.6g NaOH、10ml双蒸水，磁力搅拌至完全溶解后待用。在250ml的四口烧瓶中加入1.12gFeSO₄·7H₂O，并加入20ml双蒸水使其溶解，机械搅拌下加热至50℃，通氮气除氧30min。随后加入待用的FeCl₃溶液，并加热至70℃，达到反应条件后，缓慢逐滴加入10ml氨水，滴加结束后老化30min。随后增大搅拌强度，一次性加入10ml待用的癸二酸盐溶液，继续反应1.5h，自然冷却后用磁铁分离出颗粒。称取15mg上述颗粒于50ml圆底烧瓶中，加入10ml双蒸水，冰水浴下磁力搅拌至完全分散。然后在0℃下依次加入31.8mg(0.15mmol)EDC·HCl、19.2mg(0.15mmol)NHS。混合物冰水浴下反应30min后，加入50mg4-NH₂-TEMPO。随后自然升温到室温，磁力搅拌24h。反应结束后分别用无水乙醚、二氯甲烷各萃取两次(每次约50ml)，除去未反应的4-NH₂-TEMPO。用磁铁分离，得到有磁性的物质，40℃真空干燥得到黑色固体，即为目标产物，FsNT。

对所得到的五种不同的最终产物各取5mg，并加入10ml去离子水，超声分散30分钟后观察，结果见表1、图1。

表1.五种不同产物在水中分散对比说明

  化合物   FeNT   FmNT   FcNT   FaNT   FsNT   超声后0min   澄清   澄清   澄清   浑浊   不能分散   放置后1h   澄清   澄清   澄清   有沉降   不能分散

[0049]本发明所制备得到的磁纳米颗粒很容易在水中分散，并把小分子氮氧自由基化合物作为官能团引入磁纳米颗粒，得到极易在水中分散且具有优良性能的EPR生物探针材料，其在动物体内有良好的生物相容性、能迅速扩散到动物组织中，并可通过EPR检测其有选择的分布于小鼠的心、肝、肺等器官。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。