棘孢木霉及在合成(R)-3,5-双(三氟甲基)苯基乙醇中的应用

摘要

本发明提供了一株新的菌种——棘孢木霉ZJPH0810，及其在微生物催化不对称合成(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJPH0810，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2009年12月16日，保藏编号：CCTCC No：M209307。本发明菌株用于生物不对称还原1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮制备(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇，具有立体选择性好，光学纯度高等优点。当底物浓度为80mmol/L时，产率最高可达53.4％。本发明筛选获得了与以往同类研究报道不同的微生物新菌种，并且可在相同的底物浓度下获得高于文献报道的(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物的产率，从而在研究微生物法制备阿瑞吡坦药物关键手性中间体方面提供了有益的参考。

说明书

(一)技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一株新的菌种——棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJPH0810，及其在微生物催化不对称合成(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。

(二)背景技术

含芳香基的手性醇是多种手性药物合成的关键手性中间体。阿瑞吡坦(Aprepitant)，商品名：Emend，化学名称：5-[[(2R，3S)-2-[(1R)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基-]甲基]-1，2-二氢-3H-1，2，4-三氮唑-3-酮基。2003年美国食品和药物管理局(FDA)批准阿瑞吡坦用于高度致吐化疗方案所致恶心、呕吐的药物，它是一个全新机制的镇吐药物-NK-1受体拮抗剂。NK-1受体拮抗剂对各种致吐刺激具有广泛的镇吐作用，且在迟发性呕吐中作用突出。阿瑞吡坦是目前唯一应用于临床的NK-1受体拮抗剂。此外，阿瑞吡坦还具有治疗抑郁及其他精神疾病的作用。阿瑞吡坦与5-HT₃受体拮抗剂、地塞米松合用被列为高致吐化疗和延迟性呕吐的标准药物治疗方案。目前，阿瑞吡坦被认为是效果最好的化疗后止吐药之一。(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇是阿瑞吡坦合成的关键手性中间体，获得对映体纯的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇是合成阿瑞吡坦的关键步骤之一。

采用传统的化学法制备(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇，需要使用价格昂贵的金属催化剂，如铑、钌等，而且会对环境造成污染。利用生物法制备(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点。

目前，文献报道的生物法催化合成(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇主要有以下几种：

法国罗地亚有限公司的Gelo-Puji等(Microbial and homogenousasymmetric catalysis in the reduction of 1-[3，5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanone[J].Tetrahedron：Asymmetry，2006，17：2000-2005)报道了采用开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)和黑曲霉(Aspergillusniger)可还原[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮得到(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇，其中以开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)转化[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮时，底物初始浓度为5mmol/L，反应16小时的产率为100％，ee值大于99％；当底物浓度提高到50mmol/L，反应16小时后产率仅为13％；底物浓度增至200mmol/L时，反应16小时的产率为2％，延长反应时间到96小时后，产率为31％。因该菌种只在底物浓度偏低时才能获得较高的产率，不适合工业化应用。

印度Vankawala 等(Efficient Synthesis of(1R)-[3，5-Bis(trifluoromethyl)phenyl]Ethanol，a Key Intermediate forAprepitant，an NK-1 Receptor Antagonist[J].Synthetic Communications，2007，37：3439-3446)报道了以外消旋的[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇为底物，乙烯醋酸酯作为酰基受体，通过南极假丝酵母脂肪酶(Candidaantarctica lipase-B，CAL-B)催化(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇生成(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酸乙酯，而外消旋体中的S-型醇不发生反应，继而再用盐酸水解(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酸乙酯可得到(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇，产率为84％，ee值大于99％，反应式如下：

(三)发明内容

本发明目的是提供一株新的菌种——棘孢木霉(Trichodermaasperellum)ZJPH0810，及其在微生物催化不对称合成(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。

本发明采用的技术方案是：

棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJPH0810，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期：2009年12月16日，保藏编号：CCTCC NO：M 209307。

菌种来源：棘孢木霉ZJPH0810是从采自杭州浙江工业大学校园(朝晖校区)的土样中分离筛选获得。经过如下流程的筛选获得目的菌株。

土样采集→平板培养→菌种分离→斜面培养→种子培养→发酵培养→生物转化反应→气相色谱检测产物→获得目的菌株

该新菌株的特征如下：

菌落形态：在PDA平板上菌落初呈白色绒状，致密，圆形，向四周扩展，后期出现轮状的菌丝密实产孢区，颜色为绿色至深绿色，菌落周围有白色菌丝的生长带，最后整个菌落全部变成绿色。

细胞形态：分生孢子梗有隔膜，垂直对生分枝，顶枝尖端细削，微弯，尖端生分生孢子团，含孢子4～12个；分生孢子无色，球形至卵形，2.5～4.5×2～4μm。

生理生化特征见表1所示：

表1：棘孢木霉ZJPH0810生理生化特征(表中：-表示阴性；+表示阳性)

  生化名称  英文  鉴定  结果  生化名称  英文  鉴定  结果  α-环式糊精  α-Cyclodextrin  +  糊精  Dextrin  +  甘露聚糖  Mannosan  +  吐温40  Tween40  -  吐温80  Tween 80  +  N-乙酰-β-D-甘露糖  胺  N-Acetyl-β-D-  Mannosamine  +  苦杏仁苷  Amygdalin  +  D-阿糖醇  D-Arabitol  -  熊果苷  Arbutin  +  D-纤维二糖  D-Cellobiose  +  L-海藻糖  L-Fucose  -  龙胆二糖  Gentiobiose  +  葡萄糖酸  Gluconic Acid  -  α-D-葡萄糖  α-D-Glucose  -  α-D-乳糖  α-D-Lactose  +  麦芽糖  Maltose  -  麦芽三糖  Maltotriose  +  D-甘露醇  D-Mannitol  +  α-甲基-D-半乳糖苷  α-Methyl-D-  Galactoside  -  D-阿洛酮糖  D-Psicose  -

  生化名称  英文  鉴定  结果  生化名称  英文  鉴定  结果  α-甲基-D-葡萄糖苷  α-Methyl-D-  Glucoside  +  β-甲基-D-葡萄糖苷  β-Methyl-D-  Glucoside  +  水杨苷  Salicin  +  D-塔格糖  D-Tagatose  +  D-海藻糖  D-Fucose  +  α-羟丁酸  α-Hydroxybut  yricAcid  +  γ-羟丁酸  γ-Hydroxybutyri  cAcid  +  α-戊酮酸  α-Oxopentanoi  cAcid  +  N-乙酰-L-谷氨酸  N-Acetyl-L-  Glutamic Acid  +  乳酸单乙醇酰胺  Lactic    Acid  Monoethanola  mide  +  腐胺  Putrescine  +  L-焦谷氨酸  L-Pyroglutami  cAcid  +  2，3-丁二醇  2，3-Butanediol  +  甘油  Glycerin  +  肌苷  Carnine  +  D-山梨醇  D-Sorbitol  -

  生化名称  英文  鉴定  结果  生化名称  英文  鉴定  结果  水苏(四)糖  Stachyose  -  α-酮戊二酸  αKetoglutaric  Acid  -  D-乳酸甲酯  D-Lactic Acid  Methyl Ester  -  L-乳酸  L-Lactic Acid  -  D-苹果酸  D-Malic Acid  -  L-苹果酸  L-Malic Acid  -  丙酮酸甲酯  Methyl Pyruvate  -  琥珀酸单甲基酯  Mono-Methyl  Succinate  -  L-丙胺酰胺  L-Alaninamide  -  D-丙氨酸  D-Lactamine  -  L-丙氨酰-甘氨酸  L-Alanyl-  Glycine-  L-丝氨酸  L-Serine-  胸苷  Adenosine-  5’-磷酸尿苷  5’-Uridine  Monophosphat  e-  1-磷酸-α-D-葡萄糖  1-Phosphate  -α-D-Glucose-  D-L-α-磷酸甘油  D-L-α-Glycero  l Phosphate-

菌种的ITS序列特性：利用PCR扩增真菌核糖体ITS(InternalTranscribedSpacer)基因区段可快速、准确、简便的鉴定真菌。采用通用引物ITS1和ITS4，对ZJPH0810菌株rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小为602bp的DNA片段，对上述PCR扩增产物进行了序列测定。经测定，所述棘孢木霉ZJPH0810菌株的真菌核糖体ITS(InternalTranscribed Spacer)基因序列如下：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。

该序列已提交GenBank(GenBank登录号为No.GU318216)。

将ZJPH0810菌株的ITS序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行同源性比对(BLAST)，发现ZJPH0810菌株与木霉菌属(Tsukamurella)的部分菌株序列同源性较高。菌株ZJPH0810与Trichoderma asperellum  CPK2722(GenBank登录号：NO.FJ412053，序列同源性100％/596bp，基于ITS序列)、Trichodermaasperellum CPK2724(GenBank登录号：NO.FJ412054，序列同源性100％/591bp，基于ITS序列)、Trichoderma asperellum GJS 99-6(GenBank登录号：NO.DQ109538，序列同源性100％/576bp，基于ITS序列)的系统发育关系最近。

根据生理生化特征并结合分子生物学鉴定，该菌种被鉴定为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。

通过响应面实验设计，得到该菌株较佳的培养基组成为：葡萄糖20.0～25.0g/L，蛋白胨20.0～27.5g/L，(NH₄)₂SO₄3.0～4.0g/L，KH₂PO₄1.0～2.0g/L，MgSO₄0.5～1.25g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.008～0.02g/L。

摇瓶培养条件为：初始pH4.0～7.5，摇瓶装液量20％～40％，培养温度30℃、摇床转速180～240r/min，接种量1％～13％，培养时间17～24小时。

本发明所涉及的ZJPH0810菌株通过以下的程序筛选得到：

1)平板培养：取1g土样分别稀释至10^-3和10^-4，取1μL接种以底物1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮为唯一碳源的平板培养基，30℃培养7d，之后挑取单菌落转接斜面培养基。平板培养基配方如下：1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮60mmol/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，KH₂PO₄2g/L，NaCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，琼脂20g/L，以蒸馏水配制，pH 6.0。

2)斜面培养(PDA培养基)：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。30℃培养2～3d，4℃冰箱保存。

3)种子培养：将培养成熟的斜面菌种接入装有75mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r/min培养16～24小时。种子培养基配方如下：葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄1.25g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.008g/L，蒸馏水配制，pH 6.0。

4)发酵培养：以5％～10％的接种量将种子液接种到装有70mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r/min培养18～48小时。发酵培养基配方如下：葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄1.25g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.008g/L，自来水配制，pH 6.0。

5)生物转化反应：将离心得到的湿菌丝体悬浮于磷酸盐缓冲液中，加入一定量的[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮底物和葡萄糖，置于摇床中30℃反应一定时间。反应结束后，反应液用乙酸乙酯萃取，离心得到的上清液采用气相色谱分析。

6)分析检测：

反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物是十二烷。取1mL萃取液加入2μL十二烷进行分析。气相色谱条件：采用日本岛津GC-2014气相色谱仪，手性色谱柱CP-Chirasil-Dex CB(25m×0.25mm×0.25μm)，检测器为FID，进样器温度250℃，检测器温度250℃，柱温80℃保留2min，以4～8℃/min升温至180℃维持10min，载气为氮气，流量为1.5～2.0mL/min，分流比1∶15～1∶20，进样量为1μL，标准品气相色谱图见图1，棘孢木霉ZJPH0810菌株生物还原反应萃取液气相色谱图见图2。

用相对校正因子分别计算出反应液中的底物和产物的浓度。进而求出反应的产率(Yield)。计算式为：

产率＝C_i/C₀×100％

式中C₀、C_i分别为反应起始底物的摩尔浓度和反应结束时产物的摩尔浓度。

产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess，ee)来表示。

定义式为：

$\mathrm{ee}=\frac{C_R-C_S}{C_R+C_S}\times 100\%$

式中C_R和C_S分别为R型和S型3，5-双三氟甲基苯乙醇的摩尔浓度。

本发明还涉及所述的棘孢木霉ZJPH0810在微生物催化不对称合成(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。

具体的，所述应用为：以棘孢木霉ZJPH0810培养获得的湿菌丝体为酶源，以1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮为底物，30℃，于pH 4.0～8.0的转化体系中进行转化反应10～45小时，反应液经分离纯化得到所述(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇。所述分离纯化可按常规方法进行。

所述转化体系中，底物[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮的初始浓度为10～150mmol/L缓冲液，棘孢木霉ZJPH0810的湿菌丝体投入量以菌丝体干重计为35～70g/L缓冲液。

为提高反应效率，所述转化体系中还可添加辅助底物，所述辅助底物为下列之一：①葡萄糖、②蔗糖、③麦芽糖、④甘油、⑤甲醇、⑥乙醇、⑦正丁醇。辅助底物为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖时，加入量为10～100g/L缓冲液，辅助底物为甲醇、乙醇或正丁醇时，加入体积为缓冲液体积的2～10％。优选的，所述反应在以乙醇为辅助底物时，所得产物的光学纯度和产率最高。

优选的，所述转化反应在pH 5.7～8.0的磷酸盐缓冲液中进行。或者，所述转化反应在pH4.0～6.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液中进行。

所述湿菌丝体由如下方法制备得到：将棘孢木霉ZJPH0810接种至发酵培养基，30～35℃、180～240r/min振荡培养17～24小时，发酵液离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌丝体；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖20.0～25.0g/L，蛋白胨20.0～27.5g/L，(NH₄)₂SO₄3.0～4.0g/L，KH₂PO₄1.0～2.0g/L，MgSO₄0.5～1.25g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.008～0.02g/L，pH 4.0～7.5。

具体的，所述方法如下：

(1)将棘孢木霉ZJPH0810接种至发酵培养基，30℃、180～240r/min振荡培养21小时，发酵液离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌丝体；

所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄1.25g/L，ZnSO₄·7H₂O0.008g/L，pH 4.0～7.5；

(2)取20mM pH5.7的磷酸缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌丝体，湿菌丝体以干重浓度为50g/L，加入底物1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮至底物浓度为50mmol/L，并加入体积为缓冲液体积6.5％的乙醇作为辅助底物，30℃摇床振荡反应30小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，得到(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一株可用于生物不对称还原1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮制备(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的微生物新菌种，具有立体选择性好，产物光学纯度高等优点。当底物浓度为80mmol/L时，产率最高可达53.4％。本发明从土样中筛选获得了与以往同类研究报道不同的微生物新菌种，并且可在相同的底物浓度下获得高于文献报道的(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物的产率，从而在研究微生物法制备阿瑞吡坦药物关键手性中间体方面提供了有益的参考。

(四)附图说明

图1为标准品气相色谱图；

图2为棘孢木霉ZJPH0810菌株生物还原反应萃取液气相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：湿菌丝体的获得

种子培养基配方如下：葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄1.25g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.008g/L，蒸馏水配制，pH 6.0。

发酵培养基配方同种子培养基，采用自来水配制；

将培养成熟的斜面菌种接入装有70mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r/min培养19小时，再以体积比5％的接种量将种子液转接到装有70mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r/min培养21小时。培养结束后发酵液离心，并用磷酸缓冲液洗涤，收集湿菌丝体，备用。

实施例2：产物浓度的检测方法

生物转化反应结束后，反应液用等体积的乙酸乙酯(10mL)萃取，萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物是十二烷。取1mL萃取液加入2μL十二烷进行分析。气相色谱具体操作条件为：进样器温度250℃，检测器温度250℃，柱温80℃保留2min，以4℃/min升温至180℃维持10min，载气为氮气，流量为1.5mL/min，分流比1∶20，进样量为1μL。根据气相色谱得到的谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓度，进而计算出产率(Yield)和产物的ee值。

实施例3：

将实施例1所得的湿菌丝体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为35g/L；加入10mmol/L的[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入50g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应10h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为4.2mmol/L，光学纯度ee值94.7％，产率42.2％(棘孢木霉ZJPH0810菌株生物还原反应萃取液气相色谱图见图2)。

实施例4：

将实施例1所得的湿菌丝体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入50g/L的麦芽糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应31h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为26.2mmol/L，光学纯度ee值96.1％，产率524％。

实施例5：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入80mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入50g/L的蔗糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应45h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为42.7mmol/L，光学纯度ee值96.6％，产率53.4％。

实施例6：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入50g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应36h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为21.0mmol/L，光学纯度ee值96.2％，产率42.0％。

实施例7：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入50g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应32h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为29.1mmol/L，光学纯度ee值96.2％，产率58.2％。

实施例8：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入50g/L的蔗糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应32h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为25.0mmol/L，光学纯度ee值96.4％，产率50.0％。

实施例9：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的甲醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应32h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为23.2mmol/L，光学纯度ee值97.5％，产率46.4％。

实施例10：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应34h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为28.7mmol/L，光学纯度ee值92％，产率57.4％。

实施例11：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入100mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应30h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为42.9mmol/L，光学纯度ee值96.2％，产率42.9％。

实施例12：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入150mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应35h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为45.9mmol/L，光学纯度ee值97.4％，产率30.6％。

实施例13：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入80mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应34h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为34.3mmol/L，光学纯度ee值95.2％，产率42.9％。

实施例14：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为19.1mmol/L，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的光学纯度ee值95.1％，产率38.2％。

实施例15：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应30h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为20.1mmol/L，光学纯度ee值95.1％，产率40.2％。

实施例16：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应45h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为15.9mmol/L，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的光学纯度ee值96.2％，产率31.8％。

实施例17：

将实施例1所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH5.7)中，湿菌丝体以干重计浓度为50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应30h。采用实施例2的检测方法，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为29.7mmol/L，产物(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的光学纯度ee值96.5％，产率59.4％。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

<120>棘孢木霉及在合成(R)-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>602

<2l2>DNA

<213>Trichoderma asperellum

<400>1

tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ccgagtttac aactcccaaa cccaatgtga      60

acgttaccaa actgttgcct cggcggggtc acgccccggg tgcgtcgcag ccccggaacc     120

aggcgcccgc cggaggaacc aaccaaactc tttctgtagt cccctcgcgg acgtatttct     180

tacagctctg agcaaaaatt caaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggttc     240

tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga     300

atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca tgcctgtccg     360

agcgtcattt caaccctcga acccctccgg gggatcggcg ttggggatcg ggacccctca     420

cacgggtgcc ggccccgaaa tacagtggcg gtctcgccgc agcctctcct gcgcagtagt     480

ttgcacaact cgcaccggga gcgcggcgcg tccacgtccg taaaacaccc aactttctga     540

aatgttgacc tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag     600

ga                                                                    602