胎儿甲种球蛋白检测微粒、其制备及应用

摘要

本发明涉及胎儿甲种球蛋白的诊断试剂，公开了一种胎儿甲种球蛋白的检测微粒，为抗-AFP抗体包被的发光微粒。本发明还公开了上述胎儿甲种球蛋白的检测微粒的制备及应用。此外，本发明又进一步公开了一种测定样品中胎儿甲种球蛋白的体外检测试剂盒，同时公开了该试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒可定量测定人血清样品中胎儿甲种球蛋白，可以与其它血清和临床信息联合用于癌症的辅助诊断及癌症病人治疗效果的监测。

说明书

技术领域

本发明涉及癌症的诊断试剂，具体涉及基于光激化学发光原理的胎儿甲种球蛋白(AFP)检测颗粒、其制备及应用。

背景技术

免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质，激素等微量生物活性物质。

我国免疫学检测基本经历了放射免疫检测(兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院)；酶联免疫检测(兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用)；以化学发光为代表的生物学标记及免疫检测技术(20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期)三个阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性的需求的不断提高而决定的。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并籍助其发光强度直接测定免疫结合。由于其高灵敏度，检测范围宽等优点，已成为放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是免疫学检测重要的发展方向。

但目前国内自行研制的化学发光检测试剂，大多为非均相反应，采用化学底物直接标记，通过化学反应激发。其分析过程与传统酶标检测类似，需反复清洗与分离，检测耗时长，自动化程度不高。国外厂家检测试剂随发光基质与检测形式而各不相同。以Abbott，Bayer与Chiron等公司为代表的化学激发，即以化学发光底物直接标记抗原或抗体进行免疫测定。最常用的为吖啶酯，在碱性环境中可被过氧化氢氧化而发光。BD则以AKP，金钢脘为基质采用酶促化学发光。Roche为则采用电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)，发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。因反应过程中牵涉到分离清洗，自动化设计复杂，仪器相当昂贵。此外，发光基质的稳定性也是一大问题。

光激化学发光法通过引入激光技术与纳米微球技术，成功地解决了上述不足。因反应在均相中进行，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗步骤，能有效降低检测背景值，减少反应时间，并可实现自动化操作。目前，PE公司推出了针对生物研究用的光激化学发光试剂Alpha-Screen。但在临床检测领域，还没有面世的光激化学发光检测试剂，尤其是用于肿瘤标志物与肝炎检测项目。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于定量检测胎儿甲种球蛋白(AFP)的检测微粒，其制备、检测条件及应用。

本发明的技术原理：

本发明的胎儿甲种球蛋白(AFP)检测试剂及试剂盒与光激化学发光检测技术相关，光激化学发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测定的方法。该技术主要整合了高分子微粒技术，有机合成，蛋白质化学与临床检测相关领域的研究。

本发明之所以能检测胎儿甲种球蛋白(AFP)，是由于在均相条件下，将内部带有染料的感光微粒(纳米级)以及包被有抗-AFP抗体并且内部带有发光化合物的发光微粒(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微粒和包被有抗-AFP抗体的纳米发光微粒可迅速有效地捕捉AFP，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微粒中的染料被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微粒俘获，从而传递能量以激活所述发光微粒中的发光化合物。数微秒后，发光微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含AFP时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微粒表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无高能级红光产生。具体原理参见图1及图2。

基于上述原理，本发明第一方面提供了一种用于检测胎儿甲种球蛋白(AFP)的检测微粒，为抗-AFP抗体包被的发光微粒。

本发明第二方面提供了一种胎儿甲种球蛋白(AFP)的检测试剂盒，包括上述抗-AFP抗体包被的发光微粒，试剂盒中还可包括生物素标记的抗-AFP抗体和/或亲和素包被的感光微粒。

在试剂盒中，上述抗-AFP抗体包被的发光微粒、生物素标记的抗-AFP抗体和亲和素包被的感光微粒分别以溶液的形式置于各自独立的容器中。上述含有抗-AFP抗体包被的发光微粒、生物素标记的抗-AFP抗体或亲和素包被的感光微粒的溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体系、Tris缓冲体系。抗-AFP抗体包被的发光微粒的溶剂优选pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，生物素标记的抗-AFP抗体的溶剂优选pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的Tris缓冲液，亲和素包被的感光微粒的溶剂优选HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，上述各种溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂优选100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五的Proclin 300作为防腐剂。

试剂盒中还可包括阳性对照、阴性对照以及参考样品。参考样品为含有胎儿甲种球蛋白的溶液，其胎儿甲种球蛋白的浓度为乙型肝炎表面抗原临床cutoff点对应的浓度。

在用于定量检测胎儿甲种球蛋白(AFP)时，上述试剂盒中还可包括含有多种确定浓度胎儿甲种球蛋白(AFP)的溶液。上述不同胎儿甲种球蛋白(AFP)浓度的溶液分别独立包装。

上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phen等，该微粒可由市场上购得。

研究发现，由于最终的检测反应是均相反应，发光微粒的粒径(微粒的平均直径)太大(＞400nm)会自然沉降，影响检测效果，微粒的粒径太小(＜50nm)，会使制备过程中的清洗工作比较困难，对抗体连接工作不利，因此发光微粒的粒径范围应在50-400nm之间，较好为100-300nm之间，优选250nm。

发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，但最常用的主要有羧基和醛基表面官能团的微粒。使用不同的微粒表面官能团，连接抗体的反应方式和条件也不相同。

鉴于获得更好的抗-AFP抗体连接效率，试剂稳定性和连接重复性，在采用之后记载的改进方法作为抗体的连接方法时优选羧基表面官能团的微粒。

发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果。市场提供的发光微粒发光量一般会在50,000-10,000,000光子数/100ug发光微粒范围内，优选150,000-350,000光子数/100ug)发光微粒。

上述生物素标记的抗-AFP抗体中，生物素与抗体的分子比例较佳为(10-20)∶1，优选15∶1。

上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激发下，可以产生单线态氧离子，当其与发光微粒距离足够近的情况下，单线氧离子传递到发光微粒，与发光微粒中的发光化合物反应，产生紫外光，紫外光再进一步激发镧系元素化合物，产生520-620nm波长光子。感光化合物可以是酞菁染料等，该微粒也可由市场上购得。

上述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例无特殊限制，较佳为1∶(3-10)，优选1∶5。

市售感光微粒均适用于本发明，微粒粒径较佳为180-260nm，优选220nm。

抗-AFP抗体包被的发光微粒可采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制得，NaBH₃CN的还原胺化反应步骤如下：

1)混合：将发光微粒与抗-AFP抗体按质量比例为10∶(1-3)混合于缓冲液中；

2)反应：加入缓冲液配制的NaBH₃CN溶液混合并反应；

3)封闭：加入缓冲液配制的Gly及NaBH₃CN溶液，混匀反应后，再加入BSA溶液封闭；

4)清洗产物，获得抗-AFP抗体包被的发光微粒。

其中，混合步骤中，发光微粒与抗-AFP抗体的质量比例为10∶(1-3)，优选10∶2反应缓冲液可为MES缓冲液、磷酸缓冲液，优选磷酸缓冲液，浓度优选0.02M，反应步骤中，反应溶液中发光微粒的浓度可为10-40mg/ml，优选20mg/ml。

改进的，抗-AFP抗体包被的发光微粒可采用下述方法制得：

1)混合：将发光微粒与抗-AFP抗体混合于缓冲液中。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，发光微粒与抗-AFP抗体的质量比例为(8-15)∶1，优选12.5∶1。

2)反应：加入缓冲液配制的EDAC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶液混合并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，混合溶液中，发光微粒与EDAC的质量比为(15-40)∶1混合，优选质量比为25∶1。反应条件为37℃旋转反应。一般约48小时反应充分。

3)往步骤2获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA(bovine serum albumin)溶液混匀并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液。BSA溶液与步骤2获得的反应液体积比较佳为1∶1-1∶2。反应条件为37℃旋转反应。一般约16小时反应充分。

4)清洗产物，获得抗-AFP抗体包被的发光微粒。

清洗的方式可以为离心法清洗或透析法清洗。

透析法清洗步骤：采用反应缓冲液透析，每次4-5小时，更换缓冲液4次。透析清洗操作时间较长，且微粒损失较多，造成收率降低。

离心法清洗步骤包括离心去上清，加入反应缓冲液洗涤，超声处理打开沉淀，如此反复3-5次。离心法清洗时离心力会使发光微粒暂时聚集在一起，但经过超声处理可以很容易再次分散打开，此法操作时间短，且收率较高。因此优选采用此种清洗方式。

上述改进的制备方法与NaBH₃CN的还原胺化反应法的主要差别在于主要反应试剂NaBH₃CN替换成了EDAC，该试剂的替换，不仅使得反应时间与NaBH₃CN的还原胺化反应法相比缩短了4个多小时，而且发光微粒与抗-AFP抗体的交联效率获得了提高，节省了抗体用量，此外，试验表明，该方法制得的检测微粒与NaBH₃CN的还原胺化反应法制得的检测微粒相比，在相同条件下反应信号更强，灵敏度更高，检测范围也更广。

亲和素包被的感光微粒可采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制备。

本发明第三方面，公开上述试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

将待测样品与试剂盒中用于检测胎儿甲种球蛋白(AFP)的检测微粒、生物素标记的抗-AFP抗体和亲和素包被的感光微粒混合反应，而后用激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。

上述激发光光源波长范围为600-700nm，优选640-680nm；反应孔发光的发射光光源波长范围为600-680nm，优选610-620nm；发射光延迟时间范围为100ms-1000ms；激发光光源的功率范围为5-100mw，优选40-60w。

较佳的，上述试剂盒的使用方法具体为：

1)在反应孔中加入样品、试剂盒中用于检测胎儿甲种球蛋白(AFP)的检测微粒和生物素标记的抗-AFP抗体，获得初始反应溶液，混合反应；

2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应；

3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。

上述步骤1)的反应条件为37℃温育10-30分钟，优选20分钟，步骤2的反应条件也为37℃温育10-30分钟，优选15分钟。

步骤1中，抗-AFP抗体包被的发光微粒为混悬液，抗-AFP抗体包被的发光微粒在混悬液中的浓度无特殊限制，200-400ug/ml，优选300ug/ml。

步骤1中，生物素标记的抗-AFP抗体也为混悬液，生物素标记的抗-AFP抗体在混悬液中的浓度无特殊限制，可以为30-40ug/ml，优选30ug/ml。

步骤2中，亲和素包被的感光微粒为混悬液，亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度一般控制在30-100ug/ml，可以为30-50ug/ml，优选40ug/ml。

上述方法中，初始反应溶液的体积无特殊限制，可以为45-75ul，优选75ul；最终反应溶液的体积也无特殊限制，可以为150-250ul，优选250ul。

上述样品包括血清、血浆和全血。

当本发明的检测微粒及检测试剂盒用于定量检测胎儿甲种球蛋白(AFP)时，还包括根据标准曲线计算待测样品AFP含量。

本发明是采用光激化学发光检测技术，定量测定人血清样品中胎儿甲种球蛋白(AFP)的体外诊断试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合用于癌症的辅助诊断及癌症病人治疗效果的监测。

本发明与检测对象相近的胎儿甲种球蛋白(AFP)酶免法试剂盒在方法学上比较，酶免法以OD值体现样本检测值，OD值可检测范围窄，仅可做定性检测，且灵敏度低。本发明的试剂盒采用光激化学发光法测定标本中的AFP，具有灵敏度高、检测范围宽等特点，在方法学上较酶免法能达到更高的灵敏度和更优的检测范围。

附图说明

图1：光激化学发光免疫技术原理图：微粒结合形成二聚体，产生光子信号

图2：光激化学发光免疫技术原理图：未结合微粒，无光子信号产生

图3：单线态氧随微粒间距离衰减，在大概600nm的距离，基本没有单线氧的存在，因此也不发光

FG BEAD：发光微粒，内含发光分子；

GG BEAD：感光微粒，内含感光分子；

Singlet Oxygen：单线态氧，活性氧离子；

A/B：两者可直接或间接特异结合的活性分子。如在双抗夹心检测中，A，B为针对靶分子C不同的表位的单克隆抗体

图4：本发明的试剂盒与进口试剂盒检测比较试验结果

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实验中仪器原料来源及试剂配方：

原料及试剂         厂家

Biotin-X-X-NHS     Sigma TLC≥95％

BSA                Equitech/protease free

Gly                Sigma≥95％

HEPES              华美

Tris               Sigma

NaBH₃CN            Acros

Avidin             Pierce

EDAC               Sigma

EDAC               Sigma

抗-AFP抗体         biospacific

感光微粒           美国PentaTek公司

发光微粒           美国PentaTek公司

仪器                  型号              厂家

粒径仪                Model 370         Nicomp

酶标仪                MultiSKAN MK3     labsystem

紫外可见分光光度计    752P              上海光谱有限公司

荧光分光光度计        F95               上海棱光技术有限公司

光激化学发光分析系统                    博阳生物/上海北滨光子

实施例1抗-AFP抗体包被的发光微粒的制备

抗-AFP抗体包被的发光微粒改进的制备方法如下：

1)发光微粒混悬液处理：吸取一定量的羧基发光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。

2)抗体处理：AFP抗体于0.05M pH6.0的MES缓冲液(以下简称MES缓冲液)透析，透析完成后测定浓度，并调节浓度至8mg/ml。

3)MES缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(MES缓冲液)和8mg/ml的抗-AFP抗体溶液(MES缓冲液)以1∶1∶1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

4)用MES缓冲液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照与发光微粒100mg/100uLEDAC的比加入，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。

5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

6)用MES缓冲液离心清洗四次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固含量，调节浓度至10mg/ml。

将上述方法与采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制得的检测微粒进行比较。

NaBH₃CN还原胺化反应法的制备方法：

1)发光微粒混悬液处理：吸取一定量的发光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量Mes缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入磷酸缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。

2)抗体处理：抗-AFP抗体于0.02M pH7.0的Mes缓冲液透析，透析完成后测定浓度，并调节浓度至8mg/ml。

3)Mes缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(Mes缓冲液)和8mg/ml的抗-AFP抗体溶液(Mes缓冲液)以1∶2∶5的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

4)用Mes缓冲液配制25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液1∶25的体积比加入，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。

5)Mes缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液2∶1∶10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(Mes缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

6)用Mes缓冲液离心清洗四次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固含量，调节浓度至10mg/ml。

两者制备结果的比较：

1.节省了制备时间

 NaBH₃CN还原胺 化反应法  改进的制备  工艺 制备100mg交联抗体的发光微粒 72h  68h

2.提高了抗体交联效率，节省了抗体用量

 NaBH₃CN还原胺化反应 法  改进的制备工艺 1mg抗体交联微 粒 5mg  12.5mg

3.增强了反应信号

 NaBH₃CN还原胺化反应 法定标品6信号值 改进的制备工艺定标品6 信号值  300ug/mlAFP抗体的发光微粒、  30ug/ml的生物素化AFP抗体  与40ug/ml亲和素包被的感光  微粒反应 258950 345672

4.提高了灵敏度

 NaBH₃CN还原胺化反应法 定标品2信号值/定标品 1信号值 改进的制备工艺定标品2信 号值/定标品1信号值  300ug/ml AFP抗体的发光微  粒、30ug/ml的生物素化AFP  抗体与40ug/ml亲和素包被  的感光微粒反应 2024/1000＝2.024 2543/1000＝2.543

5.扩大了检测范围

 NaBH₃CN还原胺化反应 法的检测范围  改进的制备工艺检测范围  300ug/mlAFP抗体的发光微  粒、30ug/ml的生物素化AFP  抗体与40ug/ml亲和素包被的  感光微粒反应 0-750ng/ml  0-1000ng/ml

参照前述改进的制备方法制备抗-AFP抗体包被的发光微粒，并通过各项性能测试比较从以下几方面进行了具体工艺条件的选择研究：

研究中涉及的各个参数的检测方法如下：

1.光信号检测方法：

在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂和25μl生物素化抗体试剂。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育20分钟，再自动加入175μl亲和素包被的感光微粒试剂后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

2.分析灵敏度检测方法：

检测10孔定标品1(0ng/ml)，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以AVE±2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度。

3.Hook检测方法：

检测AFP浓度分别为50ug/ml、80ug/ml、100ug/ml、125ug/ml的样本光信号，结果应大于定标品6(1000ng/ml)。

4.精密性检测方法：

检测AFP浓度分别为10ng/ml和200ng/ml的质控品光信号，每个浓度做10孔重复测定，代入公式，计算CV值。低浓度的精密性测定表示为QC L，高浓度的精密性测定表示为QC H。

5.线性检测方法：

对除0值外其他5点定标品(实施例6制备)做线性分析，计算线性相关系数r(r应大于0.99)

工艺条件选择：

a.缓冲液及反应pH值选择

其它反应条件：20mg/ml的发光微粒反应浓度，12.5∶1的发光微粒与抗-AFP抗体质量比，离心法清洗

根据以上实验结果可知，0.05M MES pH 6.0缓冲液灵敏度、CV好于0.02M PB pH7.0缓冲液。故选择0.05M MES pH 6.0缓冲液作为抗AFP包被发光微粒的反应缓冲液。

b.发光微粒与抗体的反应比例

其它反应条件：0.05M MES pH 6.0缓冲液作为反应缓冲液，离心法清洗。

抗体加入量与发光微粒上包被的抗体量基本呈正比关系，但抗体继续增加时包被上的抗体达到饱和。综合考虑QC结果及成本问题，选择12.5mg发光微粒与1mg抗-AFP抗体反应条件。

c.清洗方式：

其它反应条件：0.05M MES pH 6.0缓冲液作为反应缓冲液，12.5∶1的发光微粒与抗-AFP抗体比例。

离心法清洗步骤：12000rpm离心30分钟，清洗3-5次。离心法清洗的离心力会使发光微粒暂时聚集，但经过超声处理很容易可再次分散打开。且操作时间短，收率较高。考虑到生产周期以及生产成本，决定采用此种清洗方式。

透析法清洗步骤：100倍体积透析，每次4-5小时，更换缓冲液2次。透析清洗操作时间较长，透析过程中微粒损失较多。

最终选择250nm的粒径，发光量为≥250,000光子数/100ug的发光微粒，0.05M MES pH6.0缓冲液作为反应缓冲液，12.5∶1的发光微粒与抗-AFP抗体比例，离心法清洗作为最优制备条件。

实施例2生物素标记抗体的制备

制备方法：

1)抗体处理：将抗-AFP抗体透析于0.1M NaHCO₃溶液，测定抗体浓度并调节至1mg/ml。

2)用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。

3)标记：取处理好的1mg/ml抗-AFP抗体标记抗体与配制好的Biotin溶液，二者按比例进行混合，迅速混匀。4℃静置反应12～16小时。

4)透析：将反应好的生物素标记抗体透析于生物素标记透析缓冲液(pH8.0)。

5)将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中，取样测定抗体浓度。将质检合格的生物素标记抗体浓度调节至0.5mg/ml。

将抗体与Biotin按照不同比例进行反应并进行检测：

标记比例越高，与实际测定比例之间的偏差越大。从分析灵敏度及Hook效应等方面进行考虑，最终选择15∶1的比例。

实施例3亲和素包被的感光微粒的制备

感光微粒：采用粒径为220±40nm的感光微粒(美国PentaTek公司)

制备方法：

a、感光微粒混悬液处理：吸取一定量的感光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节感光微粒浓度至100mg/ml。

b、亲和素溶液配制：称量一定量Avidin，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。

c、混合：将处理好的感光微粒混悬液、8mg/ml的Avidin以及MES缓冲液，以2∶5∶1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

d、反应：MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液1∶25的体积比加入，迅速混匀。37℃旋转反应48小时。

e、封闭：MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液2∶1∶10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

f、清洗：向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的感光试剂缓冲液进行悬浮，测定固含量，用感光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。

实施例4正常参考值的制定

根据对438个正常非肝癌患者的血样进行检测的结果，95％的样品胎儿甲种球蛋白(AFP)水平小于7.0ng/ml，所以我们可以认为0-7.0ng/ml是本试剂的临床正常参考范围。

实施例5定标品的制备

定标品：使用卫生部临检中心出品的胎儿甲种球蛋白(AFP)定量参考品，以新生牛血清为稀释液，按照浓度0ng/ml，5ng/ml，21ng/ml，97ng/ml，383ng/ml，1000ng/ml配制6个定标品

实施例6胎儿甲种球蛋白(AFP)定量检测

首先向反应孔中分别加入样品，再依次加入发光试剂(抗体包被的发光微粒)和生物素标记抗体。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育。再自动加入亲和素包被的感光微粒后37℃再次温育。温育结束后仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

按上述方法检测各个定标品的发光光子量，将测得的光信号值与相应的定标品浓度采用cubic spline拟和作图即得，标准曲线呈线性。

在定量测定中，根据标准曲线，按样本实测光信号值计算每一个样本的AFP含量，单位是ng/ml。

检测条件的优化试验：

1.1温育时间的确定：

试验材料：采用抗体包被的300ug/ml的发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)和30ug/ml的生物素标记抗体试剂，及40ug/ml的亲和素包被的感光微粒试剂

检验样本：质控品QcL，QcH。

初始反应条件：加样量为样品25ul，发光微粒试剂25ul，生物素标记抗体试剂25ul，亲和素包被的感光微粒试剂为175ul，两步温浴。

1.1.1第一步温育时间的确定

第一步温育时间分别为10min、15min、20min、30min，第二步温育时间为20min对检验样本进行检测，分别考察分析灵敏度、HOOK效应、精密度、线性等指标。结果见下表：

根据以上实验结果可知，在其余条件相同的情况下，第一步温育时间为20min结果已经趋于稳定，延长第一步温育时间已经没有实际意义，故将第一步温育时间确定为20min。

1.1.2第二步温育时间的确定

第一步温育时间为15min，第二步温育时间分别为10min、15min、20min、30min对检验样本进行检测，分别考察分析灵敏度、HOOK效应、精密度、线性等指标。结果见下表：

对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，第二步温育时间为15min结果已经趋于稳定，延长第二步温育时间已经没有实际意义，所以我们将第二步温育时间确定为为15min。

1.2加样模式的考察

试验材料：采用抗体包被的300ug/ml的发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)和30ug/ml的生物素标记抗体试剂，及40ug/ml的亲和素包被的感光微粒试剂

检验样本：质控品QcL，QcH。

初始反应条件：依次添加样品、发光微粒试剂、生物素标记抗体试剂、亲和素包被的感光微粒，两步温浴，其中第一温浴时间为20min，第二温浴时间为15min。

设计了2种加样模式进行考察。

模式1：25ul样品+25ul发光抗体试剂+25ul生物素化抗体试剂+175ul亲和素包被的感光微粒试剂；

模式2：15ul样品+15ul发光抗体试剂+15ul生物素化抗体试剂+105ul亲和素包被的感光微粒试剂；

在初始条件下相同的情况下，按照以上两种加样模式对企业内控品进行检测，分别考察分析灵敏度、HOOK效应、精密度、线性等指标。结果见下表：

根据以上实验结果可知，模式1灵敏度、精密性及HOOK效应皆好于模式2，故选择模式1。

1.3发光抗体、生物素化抗体、亲和素包被的感光微粒浓度的筛选

试验材料：采用抗体包被的发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)和生物素标记抗体试剂，及亲和素包被的感光微粒试剂

检验样本：灵敏度参考品和质控品QcL，QcH。

初始反应条件：依次添加25ul样品、25ul发光微粒试剂、25ul生物素标记抗体试剂、175ul亲和素包被的感光微粒，两步温浴，其中第一温浴时间为20min，第二温浴时间为15min。

1.3.1发光抗体和生物素化抗体浓度的筛选

亲和素包被的感光微粒采用40ug/ml的浓度，分别配制浓度为200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml的发光抗体以及浓度为20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml的生物素化抗体交叉配对进行检测，在初始条件下结果分别如下：

200ug/ml发光抗体

300ug/ml发光抗体

400ug/ml发光抗体

对上述结果进行分析比较，发光试剂的浓度在300μg/ml，生物素化抗体的浓度在30μg/ml时结果最为理想，故选择以上浓度为工作浓度。

1.3.2亲和素包被的感光微粒浓度筛选

发光抗体浓度选用300ug/ml，生物素化抗体的浓度选用30ug/ml，亲和素包被的感光微粒浓度分别配制为30ug/ml，40ug/ml，50ug/ml，在初始反应条件下，结果如下：

根据信噪比、Hook效应比较及Qc L和Qc H的测定浓度，亲和素包被的感光微粒浓度在40ug/ml时结果最为理想。

实施例7评价试验

试剂：采用发光抗体试剂(浓度300ug/ml)、生物素标记抗体试剂(浓度为30ug/ml)及亲和素包被的感光微粒试剂(浓度为40ug/ml)。

检测方法：在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂和25μl生物素化抗体试剂。然后放入仪器，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育20分钟，再自动加入亲和素包被的感光微粒试剂175μl后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量，根据标准曲线可以推算样品AFP浓度，单位是ng/ml，最后打印试验报告。

1.定量模式性能评价

1.1分析灵敏度的检测

检测10孔定标品1(0ng/ml)，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以AVE±2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度

  分析灵敏度(ng/ml)  0.395

经检测，分析灵敏度分别为0.395ng/ml，不高于0.5ng/ml。

1.2检测范围

在3个临床试验点对1042个正常非癌症患者的血样进行检测，99％的样品AFP水平小于7.0ng/ml。而高浓度AFP水平的病人样品可导致RLU(相对光子单位)的反常性下降(即高滴度的钩带效应)。在本测定方法中，AFP水平高达100ug/ml的病人样品的检测结果将大于1000ng/ml。

因此确定检测范围为0.5-1000ng/ml。

1.3线性的检测

对除0值外其他5点定标品(实施例5制备)做线性分析，计算线性相关系数r(r应大于0.99)，r＝0.999

1.4精密性的检测

分别采用2个批号的试剂对高、低2个水平的胎儿甲种球蛋白(AFP)质控品进行检测，重复10次，将结果数值代入公式，计算CV值

1.5Hook试验

  检测浓度  1000ng/ml  50ug/ml  80ug/ml  100ug/ml  125ug/ml  测定光信号值  325689  521356  423596  403421  345891

由上述结果确定：虽然本产品在AFP浓度125ug/ml时测定结果依然大于1000ng/ml，但结果已经与1000ng/ml很接近，在AFP浓度100ug/ml时检测结果将大于1000ng/ml。

1.6干扰性试验

在一份已知浓度的临床标本中添加血红蛋白、甘油三酯及胆红素制成250mg/dL血红蛋白的溶血标本、500mg/dL甘油三酯的脂血标本及10mg/dL胆红素的黄疸标本进行检测，测定值与原浓度的偏差不得超过10％。

  测定值  理论值  偏差率(％)  溶血标本  572.48  625.53  -8.5  脂血标本  638.11  625.53  2.0  黄疸标本  698.24  625.53  8.3

由上述结果可知，500mg/dL甘油三酯、250mg/dL血红蛋白和10mg/dL胆红素对本产品无明显干扰

实施例8比较试验

试剂：采用发光抗体试剂(300ug/ml)、生物素标记抗体试剂(30ug/ml)及亲和素包被的感光微粒试剂(40ug/ml)。

以罗氏公司AFP试剂盒(电化学发光系统)为参照进行了质量水平比较，结果如下：

  样品  本发明的试剂盒(对应博阳)  罗氏公司  分析灵敏度(ng/ml)  0.395  0.605  抗Hook能力  100ug/ml  1210ug/ml

收集经ROCHE公司AFP试剂盒检测过的临床标本332份，再以本发明的AFP光激化学发光检测试剂盒测定每份标本，作平行比较，结果如图4。

结果表明两种方法间的相关性：y＝0.8313x+0.8264，r＝0.991。说明本发明的胎儿甲种球蛋白检测试剂盒(光激化学发光法)跟国外知名厂家生产的类似产品相比，整个产品的技术指标大致相当。且该试剂盒成本底、灵敏度高、精密性好、检测范围宽、操作简便、省时，适合于向临床推广。

实施例9试剂盒的组配

将实施例1-3中按照各种方法制备的的三种试剂分别独立包装，组配后获得基本试剂盒。可用于检测待测样本的光激化学反应光信号。

在上述试剂盒中加入独立包装的实施例5配制的定标品后获得定量检测试剂盒。可用于定量检测胎儿甲种球蛋白(AFP)。