寡-古洛糖醛酸盐和半乳糖醛酸盐组合物

摘要

本发明提供包含大分子药物和寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的药物组合物，例如该寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的数均聚合度范围为5至18，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(FG)至少为0.80，甘露糖醛酸盐分数(FM)不大于0.20，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于20。该组合物可用于治疗方法，该方法包括向人或非人脊椎动物对象的粘膜表面给药该组合物。

说明书

本发明涉及寡-古洛糖醛酸盐和半乳糖醛酸盐组合物，且涉及使用寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐治疗人或非人动物，尤其是哺乳动物的方法，例如对抗升高的粘膜粘度，例如增加粘液清除，尤其是从呼吸道，特别是从窦和肺清除，特别是治疗囊性纤维化(CF)和鼻窦炎。

囊性纤维化在欧洲人群中是最常见的致死基因疾病。该疾病是由编码囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)(存在于体内的分泌细胞和其它细胞中的氯离子通路)的基因突变引起的。该疾病的特征为体内存在浓稠的、难控制的粘液分泌，这可导致肺疾病、消化问题和不孕。肺中正常形式的粘液纤毛清除不能清除该过分粘稠的粘液，该粘液变为微生物的寄居区，这又增加粘液粘度并可导致慢性肺炎和阻塞。因此，肺疾病对大多数CF患者是最大的健康问题且为主要的死亡原因。

粘液是整个呼吸道，包括肺的正常分泌物。其主要功能是作为粘液纤毛清除系统(mucociliary clearance system)的一部分，其保持肺清洁并防止感染。该粘液纤毛清除系统具有三个主要组分：粘液；纤毛；和气道表面液体。因此该上皮表面包括分泌粘液的杯状细胞和纤毛上皮细胞，其具有气道表面液体的覆盖层，且在该覆盖层上有一层粘液，纤毛的尖端伸入该粘液。该粘液为粘性凝胶物质，其主要由水(约95％wt.)和粘蛋白、负责粘液的物理特性的凝胶形成分子组成。该纤毛为上皮细胞的表面的小毛发状凸起，其有节奏的拍打水样的、非粘稠的气道表面液体，且其尖端浸没在粘液层中。该粘液层在肺表面形成粘性表层，其俘获细菌、病毒、吸入的颗粒、环境污染物和细胞碎片。纤毛的拍打用来将该粘液表层和其中俘获的任何物质推进到口并排出肺。在正常条件下，该粘液纤毛清除系统有效运转且肺保持清洁并不受感染。如果该系统被破坏，存在第二道防线-咳嗽。因此当由于刺激或发炎分泌出增加量的粘液时，例如由于吸入的颗粒或感染，该粘液通过咳嗽反射从肺排出。

在CF患者中，肺中的粘液比正常粘液更稠且更粘，且纤毛运输该稠的粘液并不容易。因此该粘液纤毛清除系统受损，且肺更易感染。此外，CF患者的肺呈现高炎性状态，且具有连续低水平的炎症并对通常引起发炎的因子具有升高的响应。这是有问题的，因为对发炎的部分响应增加了粘液的产生。如果该粘液太稠不能被粘液纤毛清除系统或咳嗽清除，则增加的粘液累积起来，肺容量减少且氧穿过粘膜的交换作用被降低。这为细菌移殖提供了理想的环境，这对CF患者是严重的问题，因为其也引起发炎并激活免疫反应。这不仅导致增加的粘液分泌，而且也导致免疫反应细胞和因子如巨噬细胞和溶菌酶的存在量增加。随着细菌和巨噬细胞死亡，它们的细胞内含物释放进入粘液，且这些包括粘性分子如DNA。而且，一些细菌，例如伯克霍尔德氏菌(Burkholdia sp.)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，还分泌高粘性多糖，在后一情况下为海藻酸盐。这些分子进一步增加粘液的粘度，在海藻酸盐的情况下似乎通过与粘液的粘蛋白基质的相互作用，但在DNA的情况下似乎通过增加粘蛋白基质内溶胶相的粘度。

因此保持粘液为能够被纤毛转运的形式为治疗CF的关键目标。简单破坏其凝胶状结构的药物将导致与CF患者的高粘性粘液一样不能转运的流体。因此重要的是任何治疗剂都不应破坏由糖蛋白粘蛋白形成的凝胶基质。

我们发现这可使用数均聚合度(DP_n)范围为5至30，优选5至18的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐(优选寡古洛糖醛酸盐)而实现。

体内的其他地方，例如耳、宫颈且尤其是呼吸道，特别是在窦中，尤其是鼻旁窦，过粘的粘液会存在问题。该寡古洛糖醛酸盐和寡半乳糖醛酸盐也可用于解决这些问题。

由子宫颈的腺体产生的宫颈粘液，是在整个月经周期内含不同比例的不同类型分泌物的非均质实体。该分泌物的本质是在除了排卵发生和可能受孕的″受孕窗(fertile window)″期间外的所有时间，为精子移动通过子宫颈提供屏障。这用来防止子宫、输卵管和卵巢不必要的暴露于病原体。

为在受孕窗期间支持精子移动，该宫颈粘液必须具有合适的生物化学和生物物理特征。生物化学特性，如pH和重量克分子渗透压浓度对精子存活提供合适的条件是重要的(参见Marriott等人，″Mucus physiology andpathology″，Bioadhesive Drug Delivery Systems，CRC Press，1990)，而生物物理特性，如流变学和大分子网形态学，影响精子在粘液中的活动力(参见Rutllant等人，Reprod.Dom.Anim.40：79-86(2005))。

临床上，该受孕窗可通过检测排卵前促黄体激素(lutenising hormone)的波动和排卵后基础体温的上升，以及通过检测宫颈粘液的生物物理特性，尤其是其粘液成丝现象(拉丝性)而识别，其实质上为测量粘液伸长性的手段，且因此与粘液的流变学相关。宫颈粘液羊齿状结晶形成，即排卵期的粘液风干后形成的结晶图案，也已显示与粘液中大分子网的形态学相关(参见Menarguez等人，Human Reproduction 18：1782-1789(2003))。

已显示粘液的羊齿状图案(即大分子网形态学)为使用人工受精获得怀孕的机会中的重要因素，且对于一些女性，″问题粘液″似乎是获得怀孕的主要屏障(参见Boyers等人，Human Reproduction 6：1108-1114(1991))。

因此需要调节宫颈粘液的生物物理特性的方法以达到最佳精子活动力，不仅用于具有″问题粘液″的女性，而且用于希望获得怀孕几率最大化的任何女性，且也用于希望将他们的动物怀孕几率最大化的动物饲养员。

我们已发现这可通过使用数均聚合度(DP_n)范围为5至30，优选5至18的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐(优选寡古洛糖醛酸盐)而实现。

这些寡古洛糖醛酸盐和寡半乳糖醛酸盐的用途描述于例如WO2007/039754和WO2007/039760，其内容在此引入作为参考。

该寡古洛糖醛酸盐(oligoguluronates)和寡半乳糖醛酸盐(oligogalacturonates)(下文称″G-嵌段(G-block)″)可按下述从天然多糖制备且包含不同聚合度(DP)的化合物的混合物。目前我们发现通过去除G-嵌段混合物的高分子量″尾″，根据其改变粘液结构的能力得到具有改善的特征的材料。

因此所附权利要求列出数均聚合度(DP_n)、古洛糖醛酸盐/半乳糖醛酸盐分数(fraction)(F_G)、甘露糖醛酸盐分数(F_M)和分子量分布的特别优选的值。

我们也已出人意料地发现，当它们共同给药时，G-嵌段(尤其是寡古洛糖醛酸盐)可有利地用于促进大分子药物从粘膜表面的吸收，所述大分子药物即分子量高于2000Da(优选高于4000Da，例如5-2000kDa)的药物。该作用已清楚地使用Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞模型而证实。

因此一方面本发明提供包含寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐和大分子药物的药物组合物。

根据另一方面本发明提供治疗人或非人脊椎动物(例如哺乳动物、鸟类或爬行动物，尤其是哺乳动物)对象的方法，其包括向所述对象给药包含有效量的大分子药物的药物组合物，该改进之处包括向所述对象的粘膜表面共同给药(coadminister)所述药物和有效量的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐。

根据另一方面本发明提供寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐在制备用于在治疗方法中使用的进一步包含大分子药物的药物中的用途，该治疗方法包括向人或非人脊椎动物对象的粘膜表面给药所述药物。

所谓粘膜表面是指例如鼻、阴道、肺的内部，口腔内部(lining of the mouth)(例如舌下)或肛门内部。给药于口腔通常通过吸入喷雾或舌下放置或保持在口中。经口给药进入胃肠道用于在胃或肠中的药物吸收是另一种选择，但不优选，因为如果如此给药大分子药物经常易于被破坏。

合适大分子药物的实例包括核酸(例如DNA或RNA)，蛋白质，肽，激素，抗体，等，更具体地为胰岛素，抗-TNF(例如依那西普，英夫利昔单抗(inflixiamb)，阿达木单抗(adalinumab)，等)，干扰素(例如干扰素α或β)，因子VII，因子VIIa，因子VIII，因子IX，促卵泡激素，红细胞生成素，曲妥单抗，美罗华，粒细胞集落刺激因子(和PEG化的等价物)，生长激素(growthhormones)如促生长素(somatotropin)，脱铁运铁蛋白(用于治疗无运铁蛋白血症)和β-葡糖脑苷脂酶。大多数这些药物在粘膜表面具有较差的生物吸收，因此它们通常通过注射给药，相比粘膜表面给药，注射给药途径患者较不喜欢。在本发明的方法中，该药物当然可用于它们的常规适应症。合适剂量可易于根据以下从动物模型确定，即吸收的量应与常规注射剂量相当。如果需要，本发明的组合物可通过皮下或肌内给药；然而，这是较不优选的，且静脉内(iv)注射通常是不希望的。

适于掺入本发明的组合物中的合适大分子药物的实例包括以Enbrel和Remicade商品名销售的抗-TNF药物；以Rituxan商品名销售的抗-CD20；以Procrit、Eprex、Aranesp、Epogen、NeoRecormon和Epogin商品名销售的红细胞生成素；以Neulasta商品名销售的G-CSF；以Herceptin商品名销售的抗-EGFR；以Avonex、Rebif、Bseron、Neupogen和Pegasys商品名销售的干扰素；以Kogenate商品名销售的因子VIII；以NovoSeven商品名销售的因子VII；以Benefix商品名销售的因子IX；以Genotropin和Nutropin商品名销售的生长激素；以Activase商品名销售的tPA；以Follistim商品名销售的FSH；和以Cerezyme商品名销售的葡糖脑苷脂酶。这些制造商的网站给出了适应症和剂量的详情。

该大分子药物当然可为用于基因治疗的核酸。

该大分子药物优选为除了减少感染、炎症、粘膜粘度或其它肺问题的任一种作用外还具有所需生物作用的药物。特别是其优选不是核酸裂解酶、凝溶胶蛋白、葡聚糖、聚ASP或聚GLU。

大分子药物有时具有在水溶液中形成聚集物的倾向，且不希望被理论束缚，认为共同给药G-嵌段获得改善的吸收部分是由于G-嵌段减少聚集物形成的作用的结果。因此本发明尤其适用于大分子，如胰岛素，其具有该聚集的倾向。认为共同给药G-嵌段获得改善的吸收另一部分是由于G-嵌段促进通过细胞表面的糖萼(glycocalyx)结构的能力-这可能是由于G-嵌段促进大分子药物与合适的细胞表面受体的接触。

使用的G-嵌段优选为数均聚合度范围为5至18(尤其是7至15)的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(fraction)(F_G)至少为0.80(优选至少0.85，尤其是至少0.92)，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.20(优选不大于0.15，尤其是不大于0.08)，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于20(优选小于17)。当准备使用时，该G-嵌段优选存在于组合物中，以0.1-50mg/mL，尤其是0.5-25mg/mL，特别是1-10mg/mL存在于水溶液中。或者，该G-嵌段和大分子药物优选以相对重量比为约0.5∶1至10∶1，特别是约1∶1存在。

根据另一方面本发明提供治疗人或非人脊椎动物(例如哺乳动物、鸟类或爬行动物，尤其是哺乳动物)对象以降低所述对象中粘膜表面的粘膜粘度的方法，且尤其是对抗粘膜的高粘度(例如治疗胶耳(glue ear)、鼻窦炎或囊性纤维化，增加受精或性交后怀孕的可能性，增强药物递送穿过粘膜表面)，该方法包括向所述粘膜表面施用有效量的数均聚合度范围为5至18的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.92，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.08，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于20。

当寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐施用于呼吸道(即鼻、窦和肺)或耳中的粘膜表面时，其优选以40至140mg/mL的浓度配制为水溶液(基于钠盐形式的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的重量计算，下文称为″基于钠盐″)。当其给药于肺时，对于成人的日剂量将为100至2000mg/天(基于钠盐)，优选120至1000mg/天，尤其是150至500mg/天。对于儿童，该剂量可与儿童体重成比例，假设对于上述剂量范围成人体重为70kg。该日剂量优选以时间间隔分2、3或4次给予。

当寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐施用于阴道内的粘膜表面或经直肠施用时，其也可以非水溶液形式提供。因此例如其可为片剂、包衣片剂(尤其是延迟或持续释放的包衣片剂)、胶囊、栓剂、阴道栓剂、凝胶、乳剂、糖浆、分散体、混悬液、乳剂、粉末、乳膏、糊剂等形式。出于该目的其可与常规药物载体和赋形剂一起配制，且剂型可以常规方式制备。

对于阴道施用，该寡糖醛酸盐(即寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐)优选以无菌含水组合物的形式施用，例如溶液，凝胶，乳剂，乳膏或糊剂，或作为片剂，胶囊或阴道栓剂。然而凝胶形式，尤其是含水润滑剂凝胶是优选的。该组合物，不含杀精子剂，如果需要可包含其它试剂以增强精子功能，例如pH调节剂和抗氧化剂，或帮助受精，例如肌肉松弛剂、润滑剂，等。显然该组合物可包含其它生理可耐受的药物或化妆组分，如阴道施用的组合物通常包含的，例如粘合剂、稀释剂、可溶胶囊壳、香料、抗生素、维生素、油、乳化剂、栓剂基质等。

该寡糖醛酸盐优选以约0.1至2.5g/剂量单位存在，更优选对成年女性为0.5至2g/剂量单位。对其它种群(species)的剂量可参考平均身体大小类似计算，例如[(0.1至2.5)/60]g/剂量单位/kg体重等。

该组合物优选在受精前施用，例如之前的1至60小时，优选之前的2至48小时，尤其是4至36，例如之前的20至52小时。这可通过例如阴道灌洗、阴道插入水可降解的片剂或胶囊，或通过注射凝胶或糊剂而实现。施用的时间可通过监测指示排卵或接近排卵的参数，例如温度而选择。

如果需要，该组合物可施用两次或更多次，例如离受精一定时间之前和受精前不久(例如1小时内)。

当pH调节剂包含在组合物内时，这优选是例如使阴道pH变得稍碱性，例如pH 7.1至7.6，尤其是约pH 7.4。在这点上可使用常规生理可耐受的缓冲剂。

根据本发明方法治疗的雌性优选为女人，特别是诊断为由于问题粘液而具有生育问题的女性。然而该方法可用于其它能怀孕年龄的女人以增加怀孕几率。其也可由兽医和动物饲养者(例如农夫)使用，用于动物如奶牛、马、狗、猫、绵羊、山羊、猪等。

本发明用于阴道施用的组合物优选与用于本发明方法的说明书一起包装，特别优选以剂量单位形式，且尤其优选与施药器(例如注射器)一起包装。尤其优选使用预装载的注射器。或者该施药器可为子宫颈隔膜的形式，与组合物一起装载在凹侧(concave side)，在受精前去除，除非隔膜是精子可渗透的或水溶性物质。该注射器和隔膜构成本发明其它方面。

对于经直肠给药于胃肠道，日剂量通常为0.1至100mg/kg体重，更优选1至50mg/kg，尤其是1.5至25mg/kg(基于钠盐)。给药优选为每天1至4次。

对于给药于耳，日剂量通常为0.05至4mg/kg体重(基于钠盐)，更优选0.1至2mg/kg。给药优选为每天1至4次。

最佳剂量可通过常规剂量范围实验而容易地确定，任选在对动物模型，例如狗模型初始研究后确定。

本发明的组合物可使用常规药用载体和赋形剂，例如无菌溶剂(如水，尤其是注射用水)、重量克分子渗透压浓度调节剂、矫味剂、pH调节剂等制备。它们可包含其它活性组分，例如用来破坏不涉及粘液的粘蛋白基质的生物聚合物的试剂(例如DNase，特别是rhDNase)、抗细菌剂、麻醉剂和抗炎剂。

使用所述另外的药物(agent)和寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的组合治疗，分开或一起给药，是本发明方法特别优选的实施方案。该其它药物可以其正常剂量或更低的剂量使用，例如正常剂量的50％。

根据本发明使用的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐优选的数均聚合度(DP_n)为7至15，更优选8至12，尤其是约10。该分子量分布优选使得不大于5％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度(DP)高于17，更优选不大于5％摩尔的DP高于14，还更优选不大于5％摩尔的DP高于12(例如在各情况下比DP_n的相关上限大2)。同样，优选不大于5％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的DP比DP_n的相关下限低2)。

寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的抗衡离子可为任意生理可耐受的阳离子，例如通常用于带电荷的药物的任意生理可耐受的离子，例如钠、钾、葡甲胺等。然而，促进海藻酸(alginate)胶凝的离子，例如2族金属不优选使用。通常优选钠。

因此，根据另一方面本发明提供无菌可喷雾含水液体组合物，其包含数均聚合度范围为5至18(优选7至15，更优选8至12，尤其是约10)的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的水溶液，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.80(优选至少0.85，更优选至少0.90，尤其是至少0.92，最特别是至少0.95)，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.20(优选不大于0.15，更优选不大于0.10，尤其是不大于0.08，最特别是不大于0.05)，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于20(优选小于17，更优选小于14)，所述溶液含所述寡古洛糖醛酸盐的浓度为40至140mg/mL，优选50至100mg/mL，尤其是55至75mg/mL(基于钠盐)。

根据另一方面本发明提供喷雾施药器，其包含贮器(reservoir)和微滴发生器(droplet generator)，所述贮器包含本发明的无菌水溶液或组合物。该喷雾施药器，实际上寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，可用于治疗囊性纤维化，窦或鼻的堵塞，或由于普通感冒或其它原因引起的充血。

用于吸入到肺中的组合物理想地包含其它生理可耐受的粘膜粘度降低剂，例如核酸裂解酶(例如DNAse，如DNase I)，凝溶胶蛋白，巯基还原剂(thiol reducing agent)，乙酰基半胱氨酸，氯化钠，不带电的低分子量多糖(例如葡聚糖)，精氨酸(或其它一氧化氮前体或合成刺激物)，或阴离子聚氨基酸(例如聚ASP或聚GLU)。尤其优选使用DNase。

对于给药于肺，寡糖醛酸盐可为粉末形式，例如约纳米至微米(例如10至50000nm)型的颗粒尺寸。

根据另一方面本发明提供用于医药的数均聚合度范围为7至15(优选8至12)的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.92(优选至少0.95)，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.08(优选不大于0.05)，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于17(优选小于14)。

根据另一方面本发明提供数均聚合度范围为7至15(优选8至12)的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.92(优选至少0.95)，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.08(优选不大于0.05)，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于17(优选小于14)，在制备在医药治疗方法中使用的药物中的用途，该医药治疗方法通过向所述表面施用该药物而降低粘膜表面的粘膜粘度，例如治疗囊性纤维化、胶耳、鼻窦炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD，尤其是其湿型)、支气管炎、气肿(emphysema)、受损的生育力，或用于增强药物递送穿过粘膜表面。

根据另一方面本发明提供数均聚合度范围为7至15(优选8至12)的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.85(优选至少0.92)，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.15(优选不大于0.08)，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于17(优选小于14)，在制备用于医药治疗方法的药物中的用途，该药物包含无菌水溶液中的浓度为40至140mg/mL的所述寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐(基于钠盐)，该医药治疗方法通过向所述表面施用该药物而降低粘膜表面的粘膜粘度，例如治疗囊性纤维化、胶耳、鼻窦炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD，尤其是其湿形式)、支气管炎、气肿、受损的生育力，或用于增强药物递送穿过粘膜表面。

根据另一方面，本发明提供治疗人或非人脊椎动物(例如哺乳动物，鸟类或爬行动物，优选哺乳动物)对象的方法，以降低其中粘膜表面的粘膜粘度，该方法包括向所述表面给药有效量的数均聚合度范围为7至15(优选8至12)的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.92(优选至少0.95)，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.08(优选不大于0.05)，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于17(优选小于14)。

根据另一方面，本发明提供治疗人或非人脊椎动物(例如哺乳动物，鸟类或爬行动物，优选哺乳动物)对象的方法，以降低其中粘膜表面的粘膜粘度，该方法包括向所述表面给药有效量的无菌水溶液，该无菌水溶液包含(基于钠盐)浓度为40至140mg/mL的数均聚合度范围为7至15(优选8至12)的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.85(优选至少0.92)，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.15(优选不大于0.08)，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于17(优选小于14)。

在本发明的方法中，给药于粘膜表面可为直接的，例如通过插入阴道栓，通过注射阴道凝胶，通过向耳或鼻注射或给药滴剂，或将喷雾微滴吸入鼻或肺，或为间接的，例如通过给药栓剂或灌肠剂以达到胃肠道远端。

根据另一方面本发明提供治疗人或非人脊椎动物(例如哺乳动物，鸟类或爬行动物，优选哺乳动物)对象的方法，以对抗所述对象的耳、窦或肺中的粘膜的高粘度，该方法包括向所述对象的耳、鼻或肺给药有效量的数均聚合度范围为5至18的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.92，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.08，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于20，优选在无菌水溶液中的浓度为40至140mg/mL(基于钠盐)。

该方法中寡糖醛酸盐的施用可通过任何方式，其将寡糖醛酸盐输送至患者的耳或呼吸道(例如鼻旁窦或更优选肺)中的分泌粘液或携带粘液的表面。通常通过吸入，例如液体微滴(例如气溶胶)或粉末，或通过将液滴给药于鼻或耳而给药。

我们也发现寡古洛糖醛酸盐和寡半乳糖醛酸盐可用于增强生理活性剂(下文称为″医药物质(drug substance)″)跨粘膜表面的吸收。因此根据另一方面本发明提供药物组合物，其包含医药物质和数均聚合度范围为5至18的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.80，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.20，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于20，优选为上述优选的寡糖醛酸盐之一。该组合物可为任何常规形式，例如粉末，片剂，胶囊，溶液，栓剂，分散体等，且可使用常规药用载体和赋形剂以常规方式制备。该医药物质优选为带电的分子，尤其是大分子(例如分子量高于2kDa)，例如聚-电解质或两性电解质，特别是带负电的分子。因此例如，该医药物质可为复杂大分子如糖蛋白，例如转铁蛋白。根据另一方面本发明提供数均聚合度范围为5至18的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.80，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.20，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于20，优选为上述优选的寡糖醛酸盐之一，在制备进一步包含医药物质的药物中的用途，该药物用于向粘膜表面给药以在其中吸收所述医药物质。根据另一方面本发明提供治疗人或非人脊椎动物对象的方法，其通过向对象的粘膜表面给药有效量的医药物质以对抗响应于所述医药物质的病症，该改进之处包括将所述医药物质与数均聚合度范围为5至18的生理可耐受的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐一起给药，其中古洛糖醛酸盐(或半乳糖醛酸盐)分数(F_G)至少为0.80，甘露糖醛酸盐分数(F_M)不大于0.20，且其中至少95％摩尔的寡古洛糖醛酸盐或寡半乳糖醛酸盐的聚合度小于20，优选为上述优选的寡糖醛酸盐之一。给药通常为经鼻的，通过吸入，直肠或阴道。该医药物质通常以其常规剂量的50至110％使用。

尽管寡糖醛酸盐可为合成物质，其优选为天然存在的多糖衍生物。其可为单一化合物或其可为寡糖醛酸盐化合物的混合物，例如一定范围的聚合度的化合物的混合物。

寡糖醛酸盐易于从天然源获得，因为许多天然多糖为含古洛糖醛酸残基嵌段(所谓的G-嵌段)的嵌段共聚物形式，且其经常包含甘露糖醛酸残基嵌段(所谓的M嵌段)。根据本发明，M-嵌段或M/G-嵌段可代替G-嵌段使用；然而这并不优选。

多糖至寡糖的裂解以产生本发明使用的寡糖醛酸盐可使用常规多糖裂解技术如酶消化和酸水解进行。然而优选使用酸水解。然后可将所需DP_n和分子量分布的寡糖醛酸盐从多糖分解产物使用离子交换树脂色谱分离，通过分级沉淀或溶解，或通过渗析进行。

合适的多糖公开于例如″Handbook of Hydrocolloids″，Ed.Phillips和Williams，CRC，Boca Raton，Florida，USA，2000。然而使用海藻酸盐是尤其优选的，因为它们天然以甘露糖醛(M)酸和古洛糖醛(G)酸的嵌段共聚物存在，且G-嵌段寡聚物可易于从海藻酸盐原料制备。

当海藻酸盐用作制备寡糖醛酸盐的原料时，古洛糖醛酸含量可按需要通过用源自棕色固氮菌(A.vinelandii)的甘露糖醛酸(mannouronan)C-5差向异构酶差向异构化而增加。

适用于本发明的寡古洛糖醛酸盐可方便地通过以下制备：酸水解源自北极海带(Laminaria hyperborean)的海藻酸，在中性pH溶解，添加无机酸以将pH降至3.4以沉淀寡古洛糖醛酸盐，用弱酸洗涤，在中性pH重悬并冻干。

本发明将进一步参考以下非限制性实施例和附图进行描述，其中：

图1a和1b，2a和2b，以及3a和3b显示COPD患者的痰中的G^*(上部)和η^*(下部)随时间的变化，且作为添加的寡糖醛酸盐的函数；

图4为实施例7中使用的DP_n 10G-嵌段物质的Dionex色谱图，且与高分子量尾未去除的前体DP_n 19物质相比较；和

图5显示在图4的G-嵌段物质的存在下模型粘液的机械特性随时间的发展。

实施例1

制备DP_n为5至18的寡古洛糖醛酸钠

1.将富含古洛糖醛酸盐的源自北极海带的菌柄(stipe)的海藻酸(pH 2-3；15-40％干重)用无机酸或有机酸，优选HCl，在70-100℃深度水解2-12小时。

2.水解后，将寡糖混合物的pH增加至3-4且将其用低离子强度水洗涤以去除富含M的部分和低分子量组分。

3.如果需要，如步骤1和2进一步水解和纯化该纯化的寡糖混合物。

4.然后将纯化的寡糖混合物用碱(优选NaOH或Na₂CO₃)中和，以得到可溶的G-嵌段，且将干重含量调节至2.5-20％。

5.为得到具有可接受数均聚合度和分子量分布的产物，将G-嵌段溶液过滤两次。首先通过具有约1000Da的截断(cut-off)的滤器以去除低于DP 5的寡聚物。然后将渗余物(retentate)通过具有约4000Da的截断的滤器过滤以去除高于约DP 20的G-嵌段部分。

6.如果需要，调节所得渗透物的干物质含量且将溶液喷雾干燥。所得灰白至浅黄的粉末(产物)的含水量小于15％。

实施例2

制备DP_n为7至15的寡古洛糖醛酸钠

制备步骤如下所示：

1.如上述实施例1。

2.如上述实施例1。

3.如上述实施例1。

4.为优化产率和纯度，将寡糖混合物的干物质含量调节至5-15％，将寡糖混合物溶解于乙酸缓冲液(50-250mM)以达到溶液最终pH为3.8-5.0。

5.将在乙酸盐缓冲液中溶解的寡糖进一步在70-100℃均匀水解1-15小时以降低高分子量部分的含量和增加生理活性G-嵌段部分。

6.按上述实施例1的步骤5和6的描述进行过滤(也包括脱盐)和喷雾干燥。

寡古洛糖醛酸盐也可按美国专利号6121441和美国专利号6407226的描述制备，其内容在此引入作为参考。事实上，本文实施例1和2的产物可有利地使用美国专利号6121441制备的寡古洛糖醛酸盐作为原料制备。

实施例3

表征和质量控制

对于实施例1和2，包括检测中间产物，使用以下技术：

纯度(古洛糖醛酸残余物的含量)和数均聚合度通过¹H-NMR光谱法按Grasdalen等人在Carbohydr.Res.68(1)：23-31(1979)中的描述测定。

由Dionex商业化的高精度阴离子色谱法与脉冲-电流计检测的组合(HPAEC-PAD)，也用于表征寡聚物材料。以下方法用于表征G-嵌段：

1.将G-嵌段样溶解于MQ水中，1-2mg/ml

2.0.1M的NaOH溶液(无碳酸盐)用作流动相，且1.0M乙酸钠用作洗脱液。所有溶液用氦气脱气并通过0.22微米滤器过滤

3.注射20微升样品，且使用AG4A前置柱和IonPac 4×250 AS4A主柱。

4.在90分钟内将柱子用线性梯度为0至87.5％的乙酸钠于0.1M NaOH中的溶液洗脱。洗脱速度在650-750psi的压力状态为1ml/min。

5.在确定响应因子作为链长度的函数后，可计算各寡聚物的浓度，表明可测定数均分子量和重均分子量以及分子量分布。

寡糖可能的其它处理：这种考虑(即如果相关参数超出所需范围)与产物的制备产率相关。生成高-G海藻酸盐的任意水解产物以满足在所需参数范围内，这没有问题，但产率可能会低。为优化产率且仍在所需参数范围内，可提出以下建议：

a)FG太低：进一步水解(GG-连接对酸水解的稳定性更高)或/和进一步在稍高的pH-值洗涤(富含M的片段的酸溶性比富含G的片段更大)。

b)“错误的”DP_n：如果平均DP_n太低，由于当滤过1kDa滤器时损失增加，产率将会降低。然而当平均DP_n太高时，产率可增加；在此，增加的酸水解将导致更多的分子在所需的参数范围内。

实施例4

用于给药的溶液

通过将分别按实施例1和2制备的DP_n为5至18或7至15的寡古洛糖醛酸钠以浓度为6、8和10％wt溶解于无菌注射用水制备吸入溶液。

然后将等分部分(aliquots)装载至喷雾施药器中用于以1至5mL，优选2-3mL的剂量给药于肺。

将其它等分部分装载至具有带滴管的有盖子的瓶中。可将液滴给药于鼻或耳，例如每耳或鼻孔2-4滴。

实施例5

阴道凝胶

将根据实施例1和2制备的寡古洛糖醛酸钠以浓度为5和15％wt混入商业阴道润滑剂凝胶(例如K-Y Jelly(购自Johnson & Johnson)或Astroglide(购自BioFilm Inc))。该凝胶任意施加，优选受精或性交前2-4小时。

实施例7

对粘蛋白的作用

从慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者收集痰样品。将样品轻微搅拌，分为几部分，冷冻并储存在-40℃。

将对照和混合样品(痰和G-嵌段)轻微搅拌1分钟，在约10mBar脱气2×1分钟，之后置于冰箱保持5分钟，然后将它们转移至流变计检测。

纯的和混合的COPD痰的流变学测量在板/锥(cone)上(40mm/l⁰或25mm/l⁰，取决于样品的量)使用Rheologica Stress-Tech通用流变计在10℃进行，以最小化任何存在的蛋白水解酶的作用。

纯的COPD痰和与G-嵌段混合的痰的流变学表征以四个不同步骤进行：

1.在恒定应变(constant strain)0.03和频率为1Hz下振荡应变对照2分钟。

2.预剪切(以20s^-1剪切速率保持1分钟)后在恒定应变0.03和频率为1Hz下振荡应变对照60分钟。

3.在恒定应变0.03下进行范围为0.01-5Hz的频率扫描。

4.在1Hz下进行范围为0.02-20Pa的应力扫描。

处理#2(预剪切和1小时测量)表示提供的实验结果的基础。该处理在0-24小时内重复2-3次。

3个体外COPD痰样品的结果在此报道。它们已按“本身”(对照)以及在添加给药G-嵌段后进行了流变学检测：

-纯的痰(对照)

-痰+75微升150mg/ml(每0.5g痰样品)的古洛糖醛酸钠寡聚物DP10该古洛糖醛酸钠寡聚物DP 10具有以下特征：

F_G 0.79，F_M 0.11，F_GG 0.76，F_GM＝F_MG 0.03，F_MM 0.07，F_MGG＝F_GGM0.02，F_MGM 0.01，F_GGG 0.74，F_G(red)0.10，F_G(tot)0.89，DP_n 10

图1a、2a和3a显示预剪切处理结束后且在引入寡糖醛酸盐后给定时间间隔的COPD痰样品(有和没有寡糖醛酸盐)的复数模量(complex modulus)(G^*)的发展。图1b、2b和3b显示与图1a、2a和3a同样痰样品的复数粘度(complex viscosity)的发展。

加入寡糖醛酸盐明显地且随时间减少COPD痰的体外机械特性。复数动态模量和复数动态粘度都明显降低。然而，相角变化，受到的影响没有达到G^*和eta^*的程度(数据未包括)。这是最重要的，因为其清楚表明粘蛋白网的机械特性被保持。

实施例8

羊齿状结晶(Ferning)

粘蛋白组合物如下制备：

a)每mL 0.05M NaCl水溶液18mg粘蛋白；

b)每mL 0.05M NaCl水溶液18mg粘蛋白和1mg海藻酸盐；和

c)每mL 0.05M NaCl水溶液18mg粘蛋白和0.5mg古洛糖醛酸盐寡聚物(DP_n＝10，如实施例7)

将组合物风干且记录显微照片。这些(本文未包含)清楚表明古洛糖醛酸盐寡聚物促进羊齿状结晶。

实施例9

粘液的机械特性

制备两种模型粘液材料，第一种为水中的18mg/mL粘蛋白和0.6mg/mL海藻酸盐，第二种仅为18mg/mL粘蛋白。将4mg/mL G-嵌段DP_n＝10(如实施例7)或DP_n＝19添加至每种中，且对各样品记录动态复数模量G^*随时间的发展。G^*是粘液的机械特性的指标。结果示于图5：从上面起，粘蛋白/海藻酸盐；粘蛋白；粘蛋白/海藻酸盐加DP_n 19；以及粘蛋白/海藻酸盐加DP_n10。可以看出，缺少高分子量尾的DP_n 10G-嵌段，相比DP_n 19G-嵌段减少了更多的粘液固体样性能。图4为两种使用的G-嵌段的Dionex色谱图。可以看出，该DP_n 19样品具有肩部延伸至右端，表明高分子量尾的存在。

实施例10

依那西普组合物

将DP_n＝10G-嵌段(如实施例7)以40mg/mL溶于50mg/mL注射用依那西普水溶液(购自Amgen，CA，USA，注册商标Enbrel)中。

实施例11

英夫利昔单抗组合物

将DP_n＝10G-嵌段8mg/mL(如实施例7)和英夫利昔单抗10mg/mL(购自Centocor，PA，USA，注册商标为Remicade)溶于无菌水中。

实施例12

美罗华(rituximab)组合物

将DP_n＝10G-嵌段(如实施例7)以10mg/mL溶于10mg/mL注射用美罗华水溶液(购自Genentech，CA，USA，注册商标Rituxan)中。

实施例13

红细胞生成素组合物

将8mg/mL的DP_n＝10G-嵌段(如实施例7)溶于4000U/mL注射用阿法依伯汀水溶液(购自Amgen，CA，USA，注册商标Epogen)中。

实施例14

G-CSF组合物

将9mg/mL的DP_n＝10G-嵌段(如实施例7)溶于10mg/mL注射用聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(pegfilgrastin)水溶液(购自Amgen，CA，USA，注册商标Neulasta)中。

实施例15

曲妥单抗组合物

将15mg/mL的DP_n＝10G-嵌段(如实施例7)和22mg/mL的曲妥单抗(购自Genentech，CA，USA，注册商标Herceptin)溶于抑菌的注射用水中。

实施例16

干扰素组合物

将DP_n＝10G-嵌段(如实施例7)以1mg/mL溶于30微克/mL注射用干扰素β-1a水溶液(购自Biogen Idec，Hoofddorp，NL，注册商标Avonex)中。

实施例17

胰岛素组合物

将DP_n＝10G-嵌段(如实施例7)以10mg/mL溶于100U/mL注射用胰岛素水溶液(购自Ely Lilly，IN，USA，注册商标Humulin)中。

实施例10至17的组合物通常经鼻、阴道或舌下给药，通常剂量的数量级由这些实施例涉及的商购药物化合物的供应者所建议。