好食脉孢霉及由该好食脉孢霉培制纤溶酶的方法

摘要

本发明公开了一种好食脉孢霉以及由该好食脉孢霉培制纤溶酶的方法，是以微生物好食脉孢霉(N.sitophila)菌株17号为菌种，经浅盘固体发酵培养产生纤溶酶，将发酵物用生理盐水浸提6h，滤去菌体和固形物，收集滤过液，用硫酸铵分级盐析，再采用现代色谱分离技术进行纯化，使酶纯度达到色谱纯。优点是本发明中纤溶酶分子小，分子量为34000±3000，易于人体吸收；最适作用温度为41℃，更加接近于人体的体温。本发明产品纤溶酶酶活力的稳定范围为23℃-42℃，适宜温度更加放宽，可以置于室温下保存。原方案的纤溶酶只有Fe

说明书

技术领域

本发明涉及一种好食脉孢霉，本发明还涉及一种由该好食脉孢霉培制纤溶酶的方法。

背景技术

血栓类疾病严重的威胁着人类的生命和健康，是导致当今人类死亡的最主要原因之一，而且这种病的发病率目前仍然在逐年上升。溶栓疗法是当前血栓疾病的一种最常用的治疗手段，所使用的溶栓剂现在已经发展到了第三代，从自然界各种生物资源中开发溶栓物质是这一代溶栓剂产品研发的重要途径。本申请人于1999年3月筛选到了一种具有优良溶栓性能的好食脉孢霉菌株，该菌株已由本申请人于2006年10月12日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供了保藏，分类学命名为好食脉孢霉(N.sitophila)菌株17号，保藏号为CGMCC No.1836。利用该菌株本申请人培养出了一种具有良好溶栓性能的纤溶酶，并于2006年12月14日向国家知识产权局提交了申请号为200610163479.6的发明专利申请。该发明申请中的纤溶酶具有如下特征：“经SDS-PAGE法和凝胶过滤层析法的分析测定，被证实该纤溶酶酶分子由两个亚基组成，相对分子量分别为30000和15500，IEF测定等电点为7.9±0.2。该纤溶酶酶分子有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的作用，可以顺次降解纤维蛋白原α、β和γ链。还可以水解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，测得的酶促反应的米氏常数为0.24mmol/L；该纤溶酶不降解人血清蛋白，最适作用pH为7.4，适宜在人体生理pH下发挥作用，在pH4.8-9.8范围内37℃保温24h后酶活力保持在80％以上；最适作用温度为50℃，在32℃-42℃保温4h酶活力保持在75％以上；Fe²⁺和Fe³⁺在离子浓度为0.5mmol/L时对酶的活性有激活作用，该纤溶活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制。”好食脉孢霉(N.sitophila)17号菌株是一种很难得的优良菌种，在制备该纤溶酶过程中还分离到一种理化性质与该纤溶酶完全不同的纤溶酶，本发明内容属于对该项目的继续研究。

发明内容

本发明要解决的技术是提供一种好食脉孢霉菌株发酵产生的纤溶酶，该纤溶酶不仅具有很好的溶栓性能，而且使用上安全性好，相对分子量小，易于人体吸收，制备成本也很低廉。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种由该好食脉孢霉培制制纤溶酶的方法。

本发明的好食脉孢霉是本申请人于1999年3月在中国北方酱类食品发酵中间产物酱块中分离、筛选得到的，为一种具有良好溶栓性能的好食脉孢霉菌株，该菌株已由本申请人于2006年10月12日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供了保藏，分类学命名为好食脉孢霉(N.sitophila)菌株17号，保藏号为CGMCC No.1836。脉孢霉广泛分布在自然界土壤中、禾本科植物上以及富含淀粉的食物上。此脉孢霉属于好氧微生物，氧气充足时，孢子形成迅速。最适生长pH为5～7.5。25～36℃下生长最快，菌落最初白色，成丛，很快变为淡黄色，绒毛状。菌丝蔓延生长，有横隔。菌落成熟后，上层覆盖成团块的分生孢子。分生孢子球形或近似球形，成链，橙红色。

本发明产品的培制方法是以微生物好食脉孢霉(N.sitophila)菌株17号为菌种，经浅盘固体发酵培养产生纤溶酶，将发酵物用生理盐水浸提6h，滤去菌体和固形物，收集滤过液，用40％～80％(W/V)饱和度的硫酸铵分级盐析，再采用现代色谱分离技术进行纯化，使酶纯度达到色谱纯。

本发明培制的纤溶酶具有以下酶学性质：经SDS-PAGE法和凝胶过滤层析法测定该纤溶酶酶分子相对分子量为34000±3000，IEF测定等电点为9.3±0.2。该纤溶酶酶分子直接溶解纤维蛋白，可以顺次降解纤维蛋白α、β和γ链。该纤溶酶最适作用pH为7.6，适宜在人体生理pH下发挥作用，在pH5.8-10范围内37℃保温24h后酶活力保持在80％以上；最适作用温度为41℃，在23℃-42℃范围内酶活力保持较稳定，适宜在人体温度条件下发挥作用；Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺、Mn²⁺、K⁺、Zn²⁺对酶的活性有不同程度激活作用，该酶为丝氨酸蛋白酶，Q-TOF2串联质谱鉴定此脉孢霉纤溶酶为新型蛋白质，并测得其中三个肽段的序列分别为：L-A-S-T-A-N-S-G-V-L-S-G-L-L-A-G-T-V-G-G-K；A-Y-T-S-K-S-S-V-P-S-S-V-G-L-A-R；L-L-D-T-G-L-N-T-A-H-S-D-F-N-R。

本发明与申请号200610163479.6发明专利申请技术方案中的产品制备方法对比，原方案中纤溶酶色谱提纯方法Sephadex G-25凝胶过滤层析使用pH7.4磷酸盐缓冲液洗脱，收集有纤溶活性组分；SP-Sephar离子交换层析使用含0～0.8mol/L NaCl的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)梯洗，收集有纤溶活性组分。本发明中纤溶酶色谱提纯方法Sephadex G-25凝胶过滤层析使用pH6.0磷酸盐缓冲液洗脱，收集有纤溶活性组分；SP-Sephar离子交换层析使用含0～0.8mol/L NaCl的磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)梯洗，收集有纤溶活性组分。

本发明的优点是：原方案中纤溶酶酶分子复杂，分子量相对较大，而本发明中纤溶酶分子小，分子量为34000±3000，易于人体吸收；原方案中纤溶酶的最适作用温度为50℃，本发明产品纤溶酶的最适作用温度为41℃，温度下限明显降低，更加接近于人体的体温。原方案中纤溶酶酶活力的稳定范围为32-42℃，本发明产品纤溶酶酶活力的稳定范围为23℃-42℃，适宜温度更加放宽，可以置于室温下保存。原方案的纤溶酶只有Fe²⁺和Fe³⁺对其有激活作用，在本发明的技术方案中，Ca2⁺、Mg²⁺、Na⁺、Mn²⁺、K⁺、Zn²⁺对本发明的纤溶酶都有不同程度激活作用。

附图说明

图1一级MS谱图I

图2一级MS谱图II

图3一级MS谱图III

图4二级MS谱图I

图5二级MS谱图II

图6为利用血纤维蛋白平板法证实本发明产品纤溶酶溶纤作用的图片

图7为SDS-PAGE测定本发明产品纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解图片

本发明所使用的菌种好食脉孢霉(N.sitophila)17号已由本申请人于2006年10月12日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

(CGMCC)提供了保藏，保藏号为CGMCC No.1836。

具体实施例

实施例1：

1、菌种：好食脉孢霉(N.sitophila)菌株17号

2、培养基及培养条件：

(1)斜面培养基(PDA斜面)：葡萄糖2％、琼脂2％、用20％土豆汁配制，pH自然，28℃恒温培养3d。

(2)制霉素抗性初筛平板培养基：斜面培养基中含10U/ml制霉菌素，0.02％(w/v)入LiCl·H₂O，0.08(w/v)去氧胆酸钠，25～28℃恒温培养36h；

(3)复筛用固体发酵培养基：豆渣∶麸皮＝4∶1(干重比)，CaCl₂0.75％、FeSO₄·7H₂O 0.045％、pH自然，接种量为5×10⁵个/瓶，28～30℃发酵3d。

实施例2

1、斜面培养同实施例1

2、固体发酵培养：摇瓶发酵培养基的组成是：豆渣∶麸皮(4∶1)+CaCl₂0.75％+FeSO₄·7H₂O 0.045％。每瓶培养基接种3.4×10⁵个孢子，在28℃恒温箱培养48h，然后用生理盐水浸提4～6h，浅盘发酵培养基组成和培养条件同摇瓶培养。

3、纤溶酶的分离纯化：固体发酵产物经过生理盐水浸提后，依次经过40～80％(W/V)饱和度硫酸铵分级盐析、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用层析、SP-SepharoseHP离子交换层析、Phenyl疏水相互作用层析和RESOURCE疏水相互作用层析，收集有纤溶活性成分。

实施例3

1、斜面培养同实施例1

2、固体发酵同实施例2浅盘发酵；

3、纤溶酶的分离纯化：脉孢霉固体发酵液经过生理盐水浸提、40～80％(W/V)硫酸铵分级盐析后，采用Octyl-Sepharose FF疏水相互作用层析、Sephadex G-25凝胶过滤层析、SP-SepharoseHP强阳离子交换层析、Superdex75凝胶过滤层析，收集有纤溶活性组分。

实施例4

1、斜面培养同实施例1

2、固体发酵同实施例2浅盘发酵；

3、纤溶酶分离纯化同实施例3

4、测定分离纯化后的纤溶酶的性质：脉孢霉纤溶酶相对分子量为34000±3000，等电点9.3±0.2，顺次降解纤维蛋白α、β和γ链，测得其中三个肽段的序列分别为：L-A-S-T-A-N-S-G-V-L-S-G-L-L-A-G-T-V-G-G-K；A-Y-T-S-K-S-S-V-P-S-S-V-G-L-A-R；L-L-D-T-G-L-N-T-A-H-S-D-F-N-R，见图1-图5。

实施例5

纤溶酶纤溶活性证明：

采用血纤维蛋白平板法和电泳法检验此酶对纤维蛋白的溶解性。

A血纤维蛋白平板法

此平板法含有血纤维蛋白原(市售的血纤维蛋白原中可能含有纤维蛋白)和凝血酶，可溶性纤维蛋白原在凝血酶作用形成纤维蛋白单体，血纤维蛋白单体自发缔结，多聚化形成可见的血纤维蛋白凝胶，将酶液加到平板凝胶表面后，经过一段时间培养后即将血纤维蛋白溶解，在平板凝胶表面形成透明圈。见图6。

B电泳法

将纤溶酶和人血纤维蛋白原等体积混匀在37℃作用，用SDS--PAGE检测脉孢霉纤溶酶是否降解人血纤维蛋白原，降解图谱见图7(从右至左泳道依次为人血纤维蛋白原、脉孢霉纤溶酶与纤维蛋白原混合后作用5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h)。

如图7所示：5min后对α链降解完全，1h后对β链降解完全，而在24h时对γ链已经完全降解，这一降解顺序与人纤溶酶降解纤维蛋白原各亚基的情况相似。见图6、图7。