定量检测人血清中自体α-突触核蛋白抗体的方法

摘要

本发明涉及一种定量检测人血清中自体α-突触核蛋白抗体的方法，本发明用抗原：重组人α-突触核蛋白和抗体：兔抗人α-突触核蛋白多克隆抗体制备成试剂盒，用抗原抗体反应原理检测帕金森病人和正常健康人血清中的自体α-突触核蛋白抗体的存在数量并进行比较，试剂盒采用显色反应来判断人血清中的自体α-突触核蛋白抗体的存在与否和数量多少。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种人血清中自体α-突触核蛋白抗体的检测方法，该方法可用于帕金森病的诊断。

背景技术：

帕金森病(Parkinsonps disease，PD)是一种发病率仅次于老年痴呆的老年神经退行性疾病，其主要病理特征以中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失和残留神经元胞浆内出现嗜酸性包涵体，称路易小体。α-突触核蛋白是构成路易小体的主要成分，主要以聚集体的形式存在。在帕金森病的发病过程中，高水平的α-突触核蛋白可形成对多巴胺能神经元具有毒性的变构形式，而这种变构形式有可能在多巴胺能神经元死亡的局部微环境形成可导致自体抗体产生，进而在帕金森病人的血清中出现自体α-突触核蛋白抗体水平增高。到目前为止，只有一篇文献报道了在希腊的家族性帕金森病人血清中自体α-突触核蛋白抗体水平增高，而且存在着病例少和定量方法不完善等缺陷。目前，帕金森病的诊断主要依靠运动症状和医生的经验，有较高的误诊率。临床病理研究表明，在散发性帕金森病的诊断中，至少有24％的误诊率。此外，由于帕金森病患者黑质多巴胺能神经元死亡特征表现为进行性死亡，只有当黑质多巴胺能神经元死亡达到了70％左右时，才开始出现运动症状，而这时已经是黑质多巴胺能神经元死亡的晚期。此时除了补充多巴胺的对症疗法外，并无根治疗法，势必严重影响病人的生活质量和给社会和家庭增加沉重的负担。因此早期发现、诊断帕金森病对于及时治疗、保护多巴胺能神经元、延缓病情、改善患者的生活质量具有十分重要的意义。

本发明研究出检测人血清中自体α-突触核蛋白抗体的方法，可用于对帕金森病的诊断，是筛选帕金森病高危人群和临床诊断帕金森病的重要手段。

发明内容：

本发明提供一种帕金森病的诊断方法，其中包括人血清中自体α-突触核蛋白抗体的检测方法。

本发明用抗原(重组人α-突触核蛋白)和抗体(兔抗人α-突触核蛋白多克隆抗体)制备成试剂盒，用抗原抗体反应原理检测帕金森病人和正常健康人血清中的自体α-突触核蛋白抗体的存在数量并进行比较，试剂盒采用显色反应来判断人血清中的自体α-突触核蛋白抗体的存在与否和数量多少。

本发明的帕金森病的诊断方法包括以下步骤：

步骤1、人α-突触核蛋白的制备

步骤2、抗α-突触核蛋白多克隆抗体的制备

步骤3、帕金森病人和正常健康人血清的制备

步骤4、人血清中自体α-突触核蛋白抗体的检测

步骤5、比较检测结果

本发明的疾病诊断方法包括使用诊断试剂对人血清中自体α-突触核蛋白抗体进行检测。

因此本发明包括诊断试剂盒。

本发明的诊断试剂盒的组成包括：

抗原(重组人α-突触核蛋白)

抗体(兔抗人α-突触核蛋白多克隆抗体)

本发明的试剂盒还包括以下辅助组成成分用于抗原抗体的反应测定。

抗原稀释液(0.05M碳酸缓冲液，pH 9.6)

抗体与血清稀释液(10％BSA/PBS)

洗板液(0.1％(v/v)Tween-20/PBS)

封闭液(10％BSA/PBS)

标记二抗(AP-山羊抗兔IgG；AP-山羊抗人IgG)

显色底物(p-Nitrophenyl Phosphate Liquid Substrate System，Sigma)96孔ELISA板。

本发明的试剂盒，各试剂分别包装，优选使用包装管，每个包装管中装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。

本发明还包括的人血清中自体α-突触核蛋白抗体的检测方法，该方法包括以下步骤：

抗原(重组人α-突触核蛋白)和抗体(兔抗人α-突触核蛋白多克隆抗体)进行反应，根据反应显色的差异判断人血清中的自体α-突触核蛋白抗体的存在与否和数量多少。

采用本发明试剂盒进行检测的方法如下：

1)包板：人α-突触核蛋白(10μg/ml，碳酸缓冲液溶解)100μl/孔包被96孔ELISA板，4℃，24小时。

2)洗板：用含0.1％(v/v)Tween-20的PBS(PBS-T)200μl/孔洗板3次，每次5分钟。

3)封闭：采用含10％BSA/PBS 200μl/孔封闭1小时。

4)加样：在96孔板的1～3列加入从1∶10000～1∶640000不同稀释度的兔抗人α-突触核蛋白多克隆抗体100μl/孔(20％山羊正常血清/PBS稀释)，每个稀释度3个做3个复孔。9～12列加入稀释的人血清样本100μl/孔(1∶100，20％山羊正常血清/PBS稀释)，每个样本做3个复孔。4℃，过夜。

5)洗板：用含0.1％(v/v)Tween-20的PBS(PBS-T)200μl/孔洗板3次，每次5分钟。

6)加入标记二抗：在1～3列的兔多抗样本加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG100μl/孔(1∶5000，10％BSA/PBS稀释)，9～12列人血清样本加入碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG 100μl/孔(1∶5000，10％BSA/PBS稀释)，室温孵育1小时。

7)洗板：用含0.1％(v/v)Tween-20的PBS(PBS-T)200μl/孔洗板3次，每次5分钟。

8)显色：加入显色底物(p-Nitrophenyl Phosphate Liquid Substrate System，Sigma)100μl/孔，37℃，30分钟。

9)终止显色反应：3N NaOH 100μl/孔终止显色反应。

10)检测吸光度：酶标仪405nm测吸光度。

11)抗体单位值计算

将最高稀释度1∶640000设置为含1抗体单位，依次1∶320000为2抗体单位，1∶160000为4抗体单位，1∶80000为8抗体单位，1∶40000为16抗体单位，1∶20000为32抗体单位，1∶10000为64抗体单位。根据各抗体单位的平均吸光度，作出标准曲线。根据线性相关公式，可计算出血清样本含自体抗人α-突触核蛋白抗体的相对量。如：80314血清3个复孔的吸光度分别是0.84973，0.86223，0.69677。吸光度均值为0.80291。根据公式可计算出该血清中自体人α-突触核蛋白抗体的相对量是37.27744。

本发明的试剂盒，其中重组人α-突触核蛋白的制备如下：

pGEX-hα-SYN重组质粒(由美国帕金森氏病研究所馈赠)常规转化BL21感受态细胞，取1菌落植入10ml 2×YTA-amp液体培养基(每升含16g蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl和0.1g氨苄青霉素)37℃振荡过夜，预培养后转移至1升新鲜的2×YTA-amp培养基中，37℃振荡培养3h后加IPTG(最终浓度0.1mmol/L)诱导蛋白表达，继续培养4h后收获细菌，以冰冷PBS悬浮细菌，超声破碎细菌后离心，上清经谷胱甘肽-Sepharose亲和层析纯化得到GST-hα-SYN融合蛋白，再经凝血酶分解、酶切过柱纯化得到重组人α-突触核蛋白。冷冻干燥，-80℃保存待用。BCA法定量α-突触核蛋白。Western Blot鉴定重组α-突触核蛋白(图1)。兔抗人α-突触核蛋白多克隆抗体的制备如下：

家兔4只，免疫前采血，制备血清备用。2mlα-突触核蛋白溶液(1mg/ml)与等量的经充分震荡的福氏完全佐剂充分乳化。每只动物接受0.8ml乳化后的抗原溶液皮下注射，初次免疫14天后，采血制备抗血清，检测免疫效果。初次免疫4周后，动物接受强化免疫，2周后，采血制备抗血清。采取硫酸铵盐析法分离纯化抗体，Western Blot检测抗体的特异性和敏感性(图2)。

在使用本发明的试剂盒时，需要采集帕金森病人和正常健康人对照血清，所述对照血清的制备方法如下：

收集静脉血在采血管(BD公司)中，避免溶血。缓慢地上下振荡采血管5次，使血液中的凝结块混匀。室温(25℃)垂直放置1小时，使血液凝结。(血液必须精确凝结1小时，否则，样品凝结时间不同可能会导致差异)。室温下，用离心机以2000g离心10分钟。吸取上清液，分装(10μl/管)到对应的已标记样品管中。立即冻存血清样品于-80℃冰箱。避免反复冻融。

在本发明的试验中，其中使用的试剂和原材料包括：pGEX-hα-SYN重组质粒均可从市场上购买得到，属于公知技术。

附图说明：

图1为96孔ELISA板示意图。

图2为标准曲线图

图3为重组人α-突触核蛋白的鉴定

图4为兔抗人α-突触核蛋白多克隆抗体的鉴定

图5为帕金森病人血清中自体α-突触核蛋白抗体含量明显高于正常健康对照

本发明的方法操作简单，灵敏度高，检测费用少，成本低，结果准确，可提前诊断，具有良好的医用效果。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

1.原核表达、纯化和鉴定重组人α-突触核蛋白

WESTERN BLOT结果显示，50～1000ng的纯化后的重组人α-突触核蛋白与小鼠抗人单克隆抗体(3D5)结合后，显示了大小不等的阳性条带，蛋白分子量的大小大约为18kD左右，与人α-突触核蛋白分子量一致，证明重组表达的蛋白为以人α-突触核蛋白(图3)。

2.：兔抗人α-突触核蛋白多克隆抗体生产

采用重组表达的人α-突触核蛋白免疫家兔后，收获的抗血清进行的WESTERNBLOT结果显示，抗血清可在1∶30000的稀释度明显显示重组表达的人α-突触核蛋白，表明该兔抗血清和抗原有很好的亲和力；而大鼠脑匀浆的结果显示，在1∶10000的稀释度，该抗体仅显示了与α-突触核蛋白分子量大小吻合的一个条带，表明该抗血清有较好的特异性。

实施例2

试剂盒的制备：

试剂盒构成：96孔ELISA板(康宁公司)、包被抗原(重组人α-突触核蛋白)、标准抗体(兔抗人α-突触核蛋白多克隆抗体)、抗原稀释液(0.05M碳酸缓冲液，pH 9.6)、抗体与血清稀释液(10％BSA/PBS)、洗板液(0.1％(v/v)Tween-20/PBS)、封闭液(10％BSA/PBS)、标记二抗(AP-山羊抗兔IgG；AP-山羊抗人IgG)、显色底物(p-Nitrophenyl Phosphate Liquid Substrate System，Sigma)有关稀释液，洗板液，封闭液，标记二抗，显色底物的组成和配制方法属于公知技术。

实施例3

血清样本中自体人α-突触核蛋白抗体的检测

采用相对定量ELISA法，对116例临床诊断的帕金森病人和78例健康对照血清中自体α-突触核蛋白抗体进行了检测。结果显示帕金森病人血清中自体α-突触核蛋白抗体含量为30.3±11.69抗体单位，帕金森病人中血清中自体α-突触核蛋白抗体最高值为64.72567；而正常健康对照血清该抗体含量为15.7±5.99抗体单位，最高值为27.665。帕金森病人血清中自体α-突触核蛋白抗体含量明显高于正常健康对照(p＜0.01)。图5.相对定量ELISA法检测人血清中自体α-突触核蛋白抗体含量。^**p＜0.01。