酶法制备手性4－取代－2，6－二氧哌啶－3，5－二甲酸单酰胺类化合物的方法

摘要

本发明涉及一种基于生物酶催化制备手性化合物的方法，尤其是指一种酶法制备手性4－取代－2，6－二氧哌啶－3，5－二甲酸单酰胺类化合物的方法。所述的方法为以4－取代－2，6－二氧哌啶－3，5－二甲酸类化合物为原料，在生物酶的作用下与有机胺或氨气反应，在有机溶剂中于15－60℃下制备4－取代－2，6－二氧哌啶－3，5－二甲酸单酰胺类化合物。本发明提供的制备方法反应条件温和，收率＞85％，纯度＞97％，并且后处理简单，原子利用度比较高，符合绿色化学的要求。应用该方法可以大大降低成本，来满足社会对手性4－取代－2，6－二氧哌啶－3，5－二甲酸单酰胺类化合物的需求。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于生物酶催化制备手性化合物的方法，尤其是指一种酶 法制备手性4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化合物的方法。

背景技术

手性4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化合物(I)，尤其是 (4R，5S)-5-取代甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸是合成帕 罗醇的重要中间体。帕罗醇是合成抗艾滋病药物和抗抑郁症药物帕罗西汀及其 衍生物的一种重要的中间体。

(R₁＝甲基、乙基、羟基、对，邻或间氟苯基或者对甲苯基等芳环取代基；R₂＝ NR₄R₅，R₄、R₅＝氢、甲基、乙基、正或异内基等烷基；R₃为C₁-C₆的烷基、 C₂-C₆的烯烃烷基、C₂-C₆的炔烃烷基、C₁-C₆的卤代烷基、C₁-C₆杂原子取代烷 基、C₃-C₈的环烷基和芳烃取代基等。)

(I)

帕罗西汀由美国Smith-Kline Beecham公司开发，是几种SSRI中抑制5-HT 再摄取效力最强者，但其抑制NE的再摄取能力则小得多，其高选择性5-羟色胺 再摄取抑制剂对多巴胺、组胺受体不敏感，仅对M受体有很弱的亲和力。帕罗西 下制备如式(I)所示的4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化合物，其 反应方程式为：

其中，

R₁＝甲基、乙基、羟基、对，邻或间氟苯基或者对甲苯基；

R₂＝NR₄R₅，R₄、R₅＝氢、甲基、乙基、正或异丙基；

R₃为C₁-C₆的烷基、C₂-C₆的烯烃烷基、C₂-C₆的炔烃烷基、C₁-C₆的卤 代烷基、C₁-C₆杂原子取代烷基、C₃-C₈的环烷基和芳烃取代基；

所述的生物酶为脂肪酶、酯酶或者水解酶。所述生物酶酶为：Lipase from Thermomyces lanuginosus，Lipase B from Candida antarctica，Lipase from Candide Rugosa，Lipase PS“Amano”SD，Lipase AS“Amano”，Lipase AK “Amano”，Lipase AYS“Amano”，Esterase from Escherichia coli.K12中 的任一种。

进一步的，所述的4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸类化合物与有机胺或 氨气的物质的量之比为1∶1～20；所述的4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸类化 合物与生物酶的质量之比为1∶0.005～0.1。

进一步的，所述有机胺为一烷基取代胺或二烷基取代胺。

进一步的，所述的有机溶剂为环己烷，正己烷，异辛烷，丙烷，乙醚，甲 基叔丁基醚和异丙醚中的一种或任意几种的混合；且所述有机溶剂的物质的量 为4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸类化合物物质的量的5～30倍。

进一步的，所述反应过程中使用无水硫酸铜，分子筛，高分子膜或者除水 设备来除去反应中生成的水。

进一步的，所述反应的反应时间为5～72小时。

进一步的，该反应是以TLC小板跟踪监测反应，展开剂是乙酸乙酯与石油 醚体积比为1～2∶1的混合试剂；通过监测反应中新产生的点的浓度和剩下的点 的浓度来判断反应终点。

进一步的，该反应可以液相监测反应进度，通过监测液相色谱中4-取代-2， 6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化合物的形成和4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5- 二甲酸类化合物的消失来判断反应终点。

进一步的，反应的是按照以下步骤进行：

a.按照4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸类化合物：有机胺或氨气物 质的量之比为1∶1～1∶3进行投料，所述的4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲 酸类化合物：生物酶质量之比为1∶0.005～1∶0.1，所述有机溶剂的物质的 量为4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸类化合物质的量的5～10倍，将4- 取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸类化合物，溶解有有机胺或氨气的有机溶 液，固定化生物酶和溶剂依次投入到反应器中；

b.控制温度于15～60℃进行反应，期间用TLC硅胶板或液相色谱进行 跟踪监测，直至反应基本不再进行；

c.过滤反应液，将生物酶除去，然后去除有机溶剂和未反应的有机胺或 氨气，即可得到粗制的手性4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化 合物。

本发明提供的制备方法反应条件温和，收率＞85％，纯度＞97％，并且后处理 简单，原子利用度比较高，符合绿色化学的要求。应用该方法可以大大降低成 本，来满足社会对手性4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化合物的 需求。

具体实施方式

设备来除去反应中生成的水。

进一步的，所述反应的反应时间为5～72小时。

进一步的，该反应是以TLC小板跟踪监测反应，展开剂是乙酸乙酯与石油 醚体积比为1～2∶1的混合试剂；通过监测反应中新产生的点的浓度和剩下的点 的浓度来判断反应终点。

进一步的，该反应可以液相监测反应进度，通过监测液相色谱中4-取代-2， 6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化合物的形成和4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5- 二甲酸类化合物的消失来判断反应终点。

进一步的，反应的是按照以下步骤进行：

a.按照4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸类化合物：有机胺或氨气物 质的量之比为1∶1～1∶3进行投料，所述的4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲 酸类化合物：生物酶质量之比为1∶0.005～1∶0.1，所述有机溶剂的物质量 为4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸类化合物质量的5～10倍，将4-取代-2， 6-二氧哌啶-3，5-二甲酸类化合物，溶解有有机胺或氨气的有机溶液，固定 化生物酶和溶剂依次投入到反应器中；

b.控制温度于15～60℃进行反应，期间用TLC硅胶板或液相色谱进行 跟踪监测，直至反应基本不再进行；

c.过滤反应液，将生物酶除去，然后去除有机溶剂和未反应的有机胺或 氨气，即可得到粗制的手性4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化 合物。

本发明提供的制备方法反应条件温和，收率＞85％，纯度＞97％，并且后处理 简单，原子利用度比较高，符合绿色化学的要求。应用该方法可以大大降低成 本，来满足社会对手性4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化合物的 需求。

具体实施方式

以下具体实例来说明本发明的技术方案，但保护的范围并不仅限于此。

本专利所涉及到的生物酶全部购于天野酶制品公司(Amano Enzyme Inc.)， 其余反应物及试剂均为市场购买所得。如未特别说明，该方法所使用的生物酶 均为固定化的生物酶，Lipase from Thermomyces lanuginosus酶固定化后称为： Lipozyme TLIM，Lipase B from Candida antarctica酶固定化后称为：Novozym 435， Lipase from Candide Rugosa(CRL)，Lipase PS“Amano”SD，Lipase AS“Amano”， Lipase AK“Amano”，Lipase AYS“Amano”，Esterase from Escherichia coli.K12 (Esterase from gene code b3412)。另外，本发明所使用的生物酶，有机溶剂和干 燥剂(分子筛或者无水硫酸铜)可回收并加以重复使用。

实施例中采用4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸为底物，简 称：化合物(IIA)；手性4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化合物， 简称：化合物(I)。

实施例1

将装有温度计，干燥管，和磁力搅拌的50ml的三口或者两口烧瓶内，加入 化合物(IIA)6.19g，乙胺1.0g，生物酶CRL 0.03g，正己烷20ml。加入完 毕，将温度固定在35℃，磁力搅拌，反应24小时，期间TLC小板监测或高效 液相色谱监测，反应完毕后，后处理，去除有机溶剂和未反应的乙胺，纯化处 理得到白色固体(4R，5S)-5-甲酰乙胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3- 羧酸。

(4R，5S)-5-甲酰乙胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸，收率 54％，纯度＞97％，ee值96％。

实施例2

将化合物(IIA)6.19g，正丙胺1.2g，生物酶0.025g，异辛烷25ml，加 入到反应器中，加入完毕，将温度固定在37℃，磁力搅拌，反应48小时，期 间TLC小板监测或液相色谱监测，使用的酶为Lipase from Candide Rugosa (CRL)。

其他操作如同实施例1，纯化处理得到白色固体(4R，5S)-5-甲酰正丙胺 -4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

白色固体(4R，5S)-5-甲酰正丙胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3- 羧酸，收率67％，纯度＞98％，ee值＞99％。

实施例3

将化合物(IIA)6.19g，甲胺0.8g，生物酶0.25g，异辛烷20ml，加入到 50ml的锥形瓶中，所使用的酶为Lipase B from Candida antarctica。加入完毕， 将锥形瓶放在摇床里。固定温度在35℃，转速200r/分。反应10小时，然后加 入0.5g生物酶，继续反应14小时，期间TLC小板监测或液相色谱监测。

反应完毕，后处理，去除有机溶剂和未反应的甲胺，纯化处理得到白色固 体(4R，5S)-5-甲酰甲胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

(4R，5S)-5-甲酰甲胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸，收率 83％，纯度98％，ee值96％。

实施例4

将化合物(IIA)6.19g，正丁胺1.8g，生物酶0.13g，甲基叔丁基醚 (MTBE)15ml，加入到50ml的锥形瓶中，所使用的酶为Lipase AS“Amano”。 加入完毕，将锥形瓶放在摇床里。固定温度在45℃，反应15小时，然后加入 0.3g生物酶，继续反应15小时，期间TLC小板监测或液相色谱监测。

其他操作如同实施例3纯化处理得到白色固体(4R，5S)-5-甲酰正丁胺 -4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

(4R，5S)-5-酰正丁胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸，收率 43％，纯度94％，ee值90％。

实施例5

将化合物(IIA)6.19g，溶有氨气0.8g的异丙醚溶液20ml，生物酶0.03g， 加入到50ml的锥形瓶中，所使用的酶为Lipase AK“Amano”。加入完毕，将 锥形瓶放在摇床里。固定温度在25℃，转速200r/分，反应10小时，期间TLC 小板监测或液相色谱监测。

其他操作如同实施例3纯化处理得到白色固体(4R，5S)-5-甲酰胺-4-(4-氟 苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

(4R，5S)-5-甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸，收率 54％，纯度98％，ee值95％。。

实施例6

将化合物(IIA)6.19g，二乙胺1.5g，生物酶0.1g，甲基叔丁基醚(MTBE) 15ml加入到50ml的锥形瓶中，所使用的酶为Lipase AK“Amano”。

加入完毕，将锥形瓶放在摇床里。固定温度在25℃，转速200r/分，反应 15小时，期间TLC小板监测或液相色谱监测。

其他操作如同实施例3纯化处理得到白色固体(4R，5S)-5-N，N-二乙基甲酰 胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

(4R，5S)-5-N，N-二乙基甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3- 羧酸，收率62％，纯度98％，ee值95％。

实施例7

将化合物(IIA)6.19g，溶有氨气0.8g的异丙醚溶液20ml，生物酶0.25g 加入到50ml的锥形瓶中，所使用的酶为Lipase from Candide Rugosa(CRL)。

加入完毕，将锥形瓶放在摇床里。固定温度在25℃，反应10小时，期间 TLC小板监测或液相色谱监测。

其他操作如同实施例3纯化处理得到白色固体(4R，5S)-5-甲酰胺-4-(4-氟 苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

(4R，5S)-5-甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸，收率 70％，纯度94％，ee值96％。

实施例8

将化合物(IIA)6.19g，二乙胺1.5g，生物酶0.08g，异丙醚20ml，加入 到50ml的锥形瓶中，加入完毕，所使用的酶为Lipase AYS“Amano”。加入 完毕，将锥形瓶放在摇床里。固定温度在25℃，反应15小时，期间TLC小板 监测或液相色谱监测。

其他操作如同实施例3纯化处理得到白色固体(4R，5S)-5-N，N-二乙基甲酰 胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

(4R，5S)-5-N，N-二乙基甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3- 羧酸，收率37％，纯度92％，ee值90％。

实施例9

将化合物(IIA)6.19g，二乙胺1.5g，生物酶0.08g，异丙醚20ml，加入 到50ml的锥形瓶中，加入完毕，所使用的酶为Novozym 435。将锥形瓶放在摇 床里。固定温度在37℃，转速200r/分，反应12小时，期间TLC小板监测或液 相色谱监测。

其他操作如同实施例3纯化处理得到白色固体4R，5S)-5-N，N-二乙基甲酰 胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

(4R，5S)-5-N，N-二乙基甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3- 羧酸，收率87％，纯度98％，ee值98％。

实施例10

将化合物(IIA)6.19g，二乙胺1.5g，生物酶0.08g，异丙醚15ml，加入 到50ml的锥形瓶中，加入完毕，所使用的酶为Lipase PS“Amano”SD。加入 完毕，将温度固定在30℃，转速200r/分，反应16小时，期间TLC小板监测或 液相色谱监测。

其他操作如同实施例1，纯化处理得到白色固体(4R，5S)-5-N，N-二乙基甲 酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

(4R，5S)-5-N，N-二乙基甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3- 羧酸，收率50％，纯度97％，ee值94％。

实施例11

将化合物(IIA)6.19g，溶有氨气0.8g的异丙醚溶液20ml，生物酶0.25g 加入到50ml的锥形瓶中，所使用的酶为Lipase B from Candida antarctica。加 入完毕，将温度固定在30℃，转速200r/分，反应5小时后再加入0.5g生物酶 (Lipase B from Candida antarctica)，继续反应8小时。期间TLC小板监测或液 相色谱监测。

其他操作如同实施例3，纯化处理得到白色固体4R，5S)-5-甲酰胺-4-(4- 氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

(4R，5S)-5-甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸，收率 72％，纯度96％，ee值96％。

实施例12

将化合物(IIA)6.19g，二异丙胺2.1g，生物酶0.08g，异丙醚20ml，加 入到50ml的锥形瓶中，加入完毕，所使用的酶为Lipase from Thermomyces lanuginosus。加入完毕，将温度固定在30℃，转速140r/分，反应5小时后再 加入0.6g生物酶(Lipase from Thermomyces lanuginosus)，继续反应10小时。 期间TLC小板监测或液相色谱监测。

其他操作如同实施例3，纯化处理得到白色固体(4R，5S)-5-N，N-二异丙基 甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶-3-羧酸。

((4R，5S)-5-N，N-二异丙基甲酰胺-4-(4-氟苯基)-1-甲基-2，6-二氧哌啶 -3-羧酸，收率72％，纯度96％，ee值96％。

序列表

<110>浙江大学

浙江中贝化工有限公司

<120>酶法制备手性4-取代-2，6-二氧哌啶-3，5-二甲酸单酰胺类化合 物的方法

<130>CS 233275，DE 3238530

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>771

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

atgaataaca tctggtggca gaccaaaggt caggggaatg ttcatcttgc gctgctgcac ggatggggac   70

tgaatgccga agtgtggcgt tgcattgacg aggaacttac ctcgcatttt acgctgcacc ttgttgacct  140

gcccggcttc gggcgtagcc ggggatttgg tgcgctgtca cttgctgata tggccgaagc cgtgctgcaa  210

caggcacctg ataaagccat ttggttaggc tggagtctgg gcgggctggt ggcaagccag attgcgttaa  280

cccatcccga gcctgttcag gcgctggtca ccgtggcgtc gtcaccttgt tttagtgctc gtgacgagtg  350

gccggggata aaaccggacg tgctggcggg atttcagcag caactcagtg atgattttca gcgtacagtg  420

gagcggttcc tggcgttaca aaccatgggg actgaaacgg cgcgccagga tgcgcgggcg ttgaagaaaa  490

ccgttctggc gttaccgatg ccggaggttg acgtgcttaa tggcgggctg gaaatcctga aaacggtcga  560

tctccgtcag ccgctgcaaa acgtgtccat gccgtttttg cgattgtatg gctatctcga cggtctggtg   630

ccgcgcaaag tggtgccgat gctggataaa ctttggcctc acagcgaatc atatatcttc gccaaagcgg   700

cccatgcgcc atttatttcg catccggccg agttttgtca cctgctggtg gcgttgaagc agagggtgta   770

g                                                                              771