检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒及其使用方法

摘要

本发明公开了一种检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒及其使用方法。本发明所述试剂盒包含酱油DNA提取试剂和PCR检测引物。本发明使用盐酸胍和CTAB法相结合的方式，有效地去除蛋白质和多糖等杂质，从而能从酱油中得到纯度较高的DNA，为PCR检测奠定良好基础。同时本发明以1个大豆内源基因和3个外源基因为检测对象，成功建立起四重PCR法，一次扩增就可以同时检测出酱油中的全部转基因成分，以大豆内源基因为参照，使检测结果更为容易判断和可靠。此试剂盒不仅适用于酱油的DNA提取，也可应用于大豆制品中转基因成分的检测，应用范围广。本发明中的四重PCR法是多重PCR检测转基因产品技术的又一创新，特异性强。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒及其使用方法。

背景技术

目前世界人口已经超过60亿，粮食匮乏的问题日益严重。在耕地日益减少的情况下，要想满足全球粮食的供给，只有靠改良和选育高产作物品种。而植物基因工程技术是实现这一目标的重要方法。

转基因作物(genetically modified/transgenic crops，GM crops)，又被称为生物技术作物(biotech crops)，是运用DNA重组技术将外源基因整合到受体植物基因组中，从而改变其基因组成的植物及其后代。转基因作物具有以下优点：1)可以解决发展中国家贫困人口的温饱问题；2)可以缓解因未来人口的急剧增长而造成的粮食大量不足问题；3)可以为农民带来巨大的经济效益；4)可以为国家粮食出口带来经济效益；5)由于减少喷施农药，保护了生物多样性。但有人认为：人类在基因生物工程上所做的工作还很初步，没有充分控制基因重组后果的能力，忽略了在转基因技术中，随机和超量插入的外源DNA对物种基因组本身和对环境生态、对人体健康的长远有副作用等问题。迄今为止由于缺乏肯定或否定转基因技术的科学依据，有关转基因作物及其产品对生态环境和人类健康所构成的安全隐患，日益引起了人们的普遍关注。

我国的转基因植物的研究开始与上世纪八十年代初，在1986年863计划实施以后，其发展步伐大大加快。我国已经开展了棉花、水稻、小麦、玉米和大豆等方面的转基因研究，目前已经取得了很多研究成果，目前我国正在研究和开发的转基因植物达48种，涉及食品植物9项，批准环境释放的转基因食品植物7种。转基因作物以较低的成本实现了优质高产，对解决温饱问题和提高农业收益有重要意义，因此在我国受到高度重视。

我国已经加入了WTO，这就意味着今后将有大量的进口农产品进入我国市场。我们在履行义务的同时，更要慎重考虑我国的权利和农业安全，特别是对那些有可能会对我国生物及环境造成污染和破坏的外来物种，尤其需要加强转基因检测。

近年来，许多农业公司利用包括转基因技术在内的现代生物技术开发新的植物品系。由于转基因植物存在的安全性问题使得转基因农作物的标签问题成为公众关注的主要热点，已有30多个国家制定了相应的法律法规对转基因作物及其制成品进行标签。

国内外转基因检测试剂盒的开发方面研究的很多，但没有一种试剂盒是普适通用的，针对不同的产品需要开发特定的检测试剂盒。而且，一般的检测试剂盒都是针对作物，对于加工产品方面检测试剂盒报道较少。

目前，有关基因组DNA提取方面的试剂盒研发的较多，德国CONGEN公司生产一种深加工转基因产品的DNA提取试剂盒，日本TaKaRa公司生产的D9093DNA提取试剂盒只适用于作物干粉等加工程度较低的产品，Promega等公司只生产一般产品的DNA提取试剂盒，针对性差。国内也有很多生物公司研制出提取基因组DNA的试剂盒，但大都针对新鲜组织的提取，对于深加工产品DNA提取试剂盒现在还没有一个好的产品。

我国是大豆产品生产和消费大国，豆制品的出口在我国进出口贸易中占有很大比例。为了保障我国大豆制品在国际市场中保持竞争能力，一个快速检测大豆加工产品中转基因成分的试剂盒的研究就显得更为迫切。而大豆的深加工产品酱油是我国主要的出口豆制品之一，也是广东省主要的出口豆制品，年出口量较大。由于转基因大豆在我国进口量的日趋增大，使得许多酱油生产厂家会在原料大豆中全部或部分采用转基因大豆以降低成本，这势必为我国酱油出口带来潜在的风险。目前针对酱油中转基因大豆成分的检测还没有一个确定的方案，而且我国标签制度对酱油并没有明确的规定，因此酱油产品的标签中均未标明是否有转基因成分的存在。但是随着转基因食品标签制度的不断完善，为了维护消费者的“知情权”，一个针对酱油中转基因成分快速准确检测的试剂盒的开发十分具有应用价值。

发明内容

为了解决现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种快速、简便、灵敏度高的检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒的使用方法。

本发明的目的是由下述技术方案实现的：一种检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒，包含酱油DNA提取试剂和PCR检测引物；所述的酱油DNA提取试剂由溶液I、溶液II、溶液III、溶液IV和溶液V组成。

所述的溶液I为pH 8.0、100mmol/L的Tris-HCl(三(羟基)氨基甲烷盐酸盐)溶液；

所述的溶液II为DNA提取缓冲液，包含pH8.0、20mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，500mmol/L NaCl和质量体积比为1.5％的SDS(十二烷基硫酸钠)；

所述的溶液III含有质量体积比2％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和体积百分比为0.2％的β-巯基乙醇；

所述的溶液IV为1.5mol/L的盐酸胍溶液；

所述的溶液V为20μg/ml的蛋白酶K溶液；

所述的溶液I、溶液II、溶液III、溶液IV和溶液V的溶剂均为水；

所述的PCR检测引物由检测大豆内标基因的PCR引物与检测转基因外标基因组成的PCR引物组成；

所述的大豆内标基因优选为大豆凝集素基因；

所述大豆凝集素基因的PCR引物如下：

lec-1(上游引物)：5’-TGGTGGAGGCATCATAG-3’

lec-2(下游引物)：5’-ACCCAGAATGTGGTTGTAT-3’

扩增片段长590bp；

所述的转基因外标基因优选为cp4-epsps(抗草甘膦基因)、CaMV 35S(花椰菜花叶病毒基因)启动子或NOS终止子中的至少一种；

所述抗草甘膦基因的PCR引物如下：

eps-1(上游引物)：5’-ATGGCTCAAGGGATACAAACC-3’

eps-2(下游引物)：5’-ACCGCCGAACATGAAGGA-3’

扩增片段长315bp；

所述CaMV 35S启动子的PCR引物如下：

35S-1(上游引物)：5’-ATTGTGCGTCATCCCTTAC-3’

35S-2(下游引物)：5’-CCGACAGTGGTCCCAAAGA-3’

扩增片段长129bp；

所述NOS终止子的PCR引物如下：

NOS-1(上游引物)：5’-CGTCATGGGCCTCGTGTCGG-3’

NOS-2(下游引物)：5’-AGTAACATAGATGACACC-3’

扩增片段长480bp。

所述检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：酱油与无水乙醇按体积比1∶3～1∶3.5混匀，-20℃冷却10～12分钟，4℃10000rpm离心10分钟，弃上清；在沉淀中加入溶液I，迅速混匀，搅拌1.5～2小时，室温12000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀；溶液I的加入量为酱油的3倍体积；

(2)样品DNA提取：

A、在步骤(1)所得样品沉淀中加入溶液II、溶液IV和溶液V，溶液II、溶液IV和溶液V的加入量分别为酱油体积的80/1000～85/1000、10/1000～15/1000和8/1000～8.5/1000；再加入预热至65℃的溶液III，溶液III的加入量为酱油体积的15/1000～20/1000；

B、接着，65℃水浴30分钟，加入与步骤A最终得到的溶液等体积的体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇溶液，4℃振荡10分钟，15000rpm离心10分钟，取上清液，重复氯仿∶异戊醇溶液抽提步骤至少一次；

C、在上清液中加入2/3上清液体积的异丙醇，于-20℃沉淀DNA 2小时，6000rpm离心6分钟收集DNA沉淀；加入500～550μl 70％乙醇轻柔漩涡打散DNA沉淀，6000rpm离心6分钟收集DNA沉淀，再加入300μl无水乙醇洗涤DNA沉淀；待无水乙醇挥发完全后，将DNA重溶解于20～30μl TE(三羟甲基氨甲烷缓冲液)，得到酱油总DNA；

(3)PCR：

PCR反应体系总体积为25μl，其中成分有：

10×PCR Buffer(缓冲液)          2.5μl

2.5mM dNTP(脱氧核糖核苷酸)      3.0μl

引物eps-1和eps-2各为            10pmol

引物lec-1和lec-2各为            20pmol

引物35S-1和35S-2各为            10pmol

引物NOS-1和NOS-2各为            15pmol

Taq DNA Polymerase(DNA聚合酶)   0.675U

酱油总DNA                       0.5～1ng

水                              余量；

其中水为双蒸水、三蒸水或超纯水；

PCR扩增条件如下：预变性：94℃5分钟；循环反应：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸8分钟，4℃保存；

在步骤(2)和(3)之间，优选取2μl DNA样品在0.8％Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小，同时测定DNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀的值，得到DNA含量及纯度；

检测PCR产物优选琼脂糖凝胶电泳或PAGE电泳进行检测；

所述琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖的浓度为质量体积比2％；

所述检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒应用于大豆制品中转基因成分的检测；

所述的大豆制品优选为酱油；

所述检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒特别应用于检测抗草甘膦转基因成分。

本发明所述的试剂盒具有以下特征：酱油的DNA提取采用盐酸胍和CTAB法相结合的方式；酱油中的转基因成分检测是采用四重PCR检测法，以大豆内源基因lectin和外源基因cp4-epsps、CaMV35S启动子、NOS终止子为检测对象。PCR反应程序中的最佳退火温度为58℃。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明所述的试剂盒操作简单、快捷、应用范围广，得到的检测结果准确。本发明针对酱油加工的特点，改良了DNA的提取方法，使用盐酸胍和CTAB法相结合的方式，有效地去除蛋白质和多糖等杂质，从而能从酱油中得到纯度较高的DNA，为PCR检测奠定良好基础。同时本发明以大豆内源基因lectin和外源基因cp4-epsps、转基因元件CaMV35S启动子、转基因元件NOS终止子为检测对象，成功建立起四重PCR法，一次扩增就可以同时检测出酱油中的全部转基因成分，以大豆内源基因为参照，使检测结果更为容易判断和可靠。由于CaMV35S启动子和NOS终止子为通用的转基因元件，cp4-epsps外源基因广泛应用于转基因大豆中，lectin基因为大豆保守基因，因此，此试剂盒不仅适用于酱油的DNA提取，也可应用于大豆制品中转抗草甘膦基因成分的检测。本发明的四重PCR法是多重PCR检测转基因产品技术的又一创新，特异性强。

附图说明

图1为使用本发明的试剂盒提取酱油中大豆DNA的电泳检测结果。

图2为以本发明试剂盒提取到的酱油总DNA为模板的PCR产物电泳检测图：

其中，泳道M为DNA分子Marker；泳道1为含有转基因成分的酱油总DNAPCR检测结果；泳道2为不含转基因成分的酱油总DNA PCR检测结果。

图3为不同提取方法提取的酱油总DNA的电泳检测图：

其中，泳道M为DNA分子Marker；泳道1～3为用本发明的试剂盒提取的酱油总DNA；泳道4～6为用在售试剂盒提取的酱油总DNA；泳道7～9为用普通CTAB法提取的酱油总DNA。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

使用本发明所述检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒抽提酱油中的总DNA以及检测大豆转基因成分，具体步骤如下：

(1)样品的预处理：选择样品，一个样品为含大豆转基因成分的生抽酱油(海天)，一个样品为不含大豆转基因成分的生抽酱油(海天)。将两个样品，分别进行处理，具体处理过程如下：在10ml酱油加入30ml无水乙醇混匀，置超低温冰箱(-20℃)放置10分钟，4℃10000rpm离心10分钟，弃上清，在沉淀中加入30ml溶液I，用力摇匀，全部转移至100ml烧杯中，于磁力搅拌器上搅拌2小时，室温12000rpm离心10分钟，弃上清。

(2)样品DNA的提取：

A、在步骤(1)中留下的沉淀中加入800μl的溶液II，100μl溶液IV，80μl溶液V，混匀转移至3ml离心管中；加入150μl预热至65℃的溶液III(临用前混合CTAB和β-巯基乙醇，溶液III中含有质量体积比2％的CTAB和体积百分比为0.2％的β-巯基乙醇)，65℃水浴30分钟；

B、加1130μl氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)提取，冰盒中振荡10分钟，15000rpm离心10分钟，小心取出上清；

C、重复步骤B一次；

D、在上清液中加入2/3体积的异丙醇，于-20℃2小时，6000rpm离心6分钟，收集沉淀；在沉淀中加入500～550μl 70％乙醇轻柔漩涡打散沉淀，6000rpm离心6分钟，收集沉淀；用无水乙醇洗涤沉淀，待无水乙醇挥发完全后，加入25μl TE缓冲液溶解，得到酱油总DNA；

E、0.8％琼脂糖凝胶电泳检测提取的酱油总DNA片段的大小及其质量，如图1所示：泳道M为DNA分子标准(即DNA Marker)，泳道1为本实施例所提取的不含大豆转基因成分的酱油总DNA，泳道2和3为本实施例所提取的含大豆转基因成分的酱油总DNA；从图1中可以看出本实施例所提取的酱油总DNA比较完整，电泳带型清晰，DNA分子量接近20kb；用紫外分光光度检测样品DNA的浓度和纯度，然后将样品DNA稀释至50ng/μl作为PCR反应的模板。

(3)PCR检测：

将所有引物干粉分别用TE缓冲液溶解，浓度分别为10μmol/L。

PCR反应体系总体积为25μl，其中成分有：

10×PCR Buffer(缓冲液)        2.5μl

2.5mM dNTP(脱氧核糖核苷酸)    3.0μl

10μmol/L引物eps-1            1μl

10μmol/L引物eps-2            1μl

10μmol/L引物lec-1            2μl

10μmol/L引物lec-2            2μl

10μmol/L引物35S-1            1μl

10μmol/L引物35S-2            1μl

10μmol/L引物NOS-1            1.5μl

10μmol/L引物NOS-2            1.5μl

5U/μl Taq DNA Polymerase     0.125μl

样品DNA：                     0.2μl

双蒸水                        8.175μl；

PCR扩增条件如下：

(4)琼脂糖凝聚电泳检测PCR产物：10μl PCR产物上样，2％琼脂糖凝胶，电泳电压为180V，时间为30分钟。电泳检测结果如图2所示：泳道M为DNA分子标准(即DNA Marker)，泳道1为本实施例所提取的含大豆转基因成分的酱油总DNA PCR检测结果，泳道2为本实施例所提取的不含大豆转基因成分的酱油总DNA PCR检测结果；图2显示不含大豆转基因成分的酱油只能扩增出大豆内标基因，含大豆转基因成分的酱油除了扩增出大豆内标基因外，还扩增出了外源基因cp4-epsps以及转基因元件CaMV35S启动子和NOS的片段。电泳条带清晰。

不同酱油总DNA提取方法比较：

1、酱油总DNA的抽提，各方法所用的样品为同一样品，均是生抽酱油(海天)

(A)CTAB法从酱油中提取的总DNA：通过普通CTAB法(栾凤侠，张洪祥，白月.大豆精加工产品DNA提取方法及转基因检测[J].大豆科学，2005，3(24)：233-235.)提取，得到的总DNA如图3泳道7、8和9所示。

(B)在售的试剂盒从酱油中提取的总DNA：使用Promega DNA提取试剂盒得到的总DNA如图3泳道4、5和6所示。

(C)使用本发明所述检测酱油中大豆转基因成分的检测试剂盒抽提的酱油总DNA，即通过实施例1步骤(1)和(2)抽提的酱油总DNA，如图3泳道1、2和3所示。

抽提到的酱油总DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，泳道1～3提取的DNA条带无拖尾，点样口干净无污染；4～9泳道DNA条带拖尾说明提取条件使DNA链降解较严重，点样口污染说明蛋白杂质未除干净。可见本发明所述检测酱油中大豆转基因成分的检测试剂盒抽提酱油中的总DNA效果较好。

实施例2

使用本发明所述检测酱油中大豆转基因成分的检测试剂盒抽提酱油中的总DNA，具体步骤如下：

(1)样品的预处理：同实施例1步骤(1)，区别仅在于：在10ml酱油加入35ml无水乙醇混匀，置超低温冰箱(-20℃)放置12分钟，其他操作相同。

(2)样品DNA的提取：

A、在步骤(1)中留下的沉淀中加入850μl的溶液II，150μl溶液IV，85μl溶液V，混匀转移至3ml离心管中；加入200μl预热至65℃的溶液III，65℃水浴30分钟；

B、加1285μl氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)提取，冰盒中振荡10分钟，15000rpm离心10分钟，小心取出上清；

C、重复步骤B两次；

D、同实施例1步骤(2)D；

E、同实施例1步骤(2)E，电泳检测，所提取的酱油总DNA带型清晰，DNA分子量接近20kb，说明抽提到的总DNA效果为完整。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>中山大学

<120>检测酱油中大豆转基因成分的试剂盒及其使用方法

<130>9

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>lec-1primer

<400>1

tggtggaggc atcatag                           17

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>lec-2primer

<400>2

acccagaatg tggttgtat                         19

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>eps-1 primer

<400>3

atggctcaag ggatacaaac c                      21

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>eps-2 primer

<400>4

accgccgaac atgaagga                          18

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>35S-1 primer

<400>5

attgtgcgtc atcccttac                         19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>35S-2 primer

<400>6

ccgacagtgg tcccaaaga                         19

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>NOS-1 primer

<400>7

cgtcatgggc ctcgtgtcgg                        20

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>NOS-2primer

<400>8

agtaacatag atgacacc                          18