预防原发性肝癌的树莓提取方法

摘要

预防原发性肝癌的树莓提取方法，已有的提取方法具有很多缺点。预防原发性肝癌的树莓提取方法，其组成包括：在成熟季节摘取新鲜树莓并打碎去渣，将所述的打碎去渣后的树莓充分搅拌后放入烧杯中并置于冰块上，在100g树莓中加入80％的丙酮200ml在预冷的混合器内混合3分钟，然后使用匀浆器继续匀浆搅拌2分钟，取出匀浆液放入接有真空泵的滤过瓶中，滤过瓶上放置有滤过纸，收集滤过物置于旋转蒸发器中并在50℃条件下旋转蒸发45分钟，用去离子水调节到终体积为50ml，置于零下20℃－零下80℃冻存。本发明作为一种提取树莓的方法。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种预防原发性肝癌的树莓提取方法。

背景技术：

树莓(Raspberry)也称木莓，为蔷薇科悬钩子属(Rubus sp.)植物，鲜果中含大量的维生素C、维生素E、SOD(超氧化物歧化酶-含量居水果之首)、Y-氨基丁酸等抗衰老物质和抗癌物质-鞣化酸(Ellagic acid)，其中维生素E和鞣化酸含量为所有水果之最。美国称红树莓是癌症的克星，被誉为“红宝石”。树莓是当今风靡欧美、深受人们欢迎的高营养新兴水果。鞣化酸对结肠、宫颈、乳腺、和胰腺癌细胞有特殊疗效。树莓及其加工产品能有效地保持鞣化酸的活性成分，并能被人体吸收。树莓是当今发现的天然鞣化酸含量最高的食物，鞣化酸是一种带苯环的酚类化合物，低含量的鞣化酸还可以减慢癌细胞的生长，高含量则可杀死癌细胞。

目前国内已有科研组研究树莓，但不论是从研究的目的及研究的方向上都有很大差异，在提取工艺上也有很大的差异。

沈阳农业大学食品学院对树莓进行提取的工艺是采用了SephadexG-100柱层析的方法进行的，这种方法具有很多缺点：首先，层析运用正负电荷相吸原理进行，这种方法容易丢失中性基团基及弱电荷基团，众所周知，很多有机物都是中性的；其次，由于植物化学物质之间是有配伍功效的，层析方法不能充分提取树莓中有效成分，所以导致配伍的失衡，植物化学物质的功效不能充分发挥；再次，层析需要溶液的流动性好，致使提取物的浓度很低，不利于研究高浓度组的效果。

东北农业大学理学院应化系研究了热水法提取树莓多糖的工艺，这种方法也有比较明显的劣势：首先，树莓中抗氧化成份是有机物，水不能够将其充分萃取；其次，树莓中抗氧化成份在热水中若没有有效措施会被氧化，从而失去了抗氧化的能力，也就没有了树莓提取物的抗肿瘤的能力。

发明内容：

本发明的目的是提供一种预防原发性肝癌的树莓提取方法，能够充分地提取树莓中的有效成分并保证其抗氧化及抗肿瘤的能力。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

预防原发性肝癌的树莓提取方法，其组成包括：在成熟季节摘取新鲜树莓并打碎去渣，将所述的打碎去渣后的树莓充分搅拌后放入烧杯中并置于冰块上，在100g树莓中加入80％的丙酮200ml在预冷的混合器内混合3分钟，然后使用匀浆器继续匀浆搅拌2分钟，取出匀浆液放入接有真空泵的滤过瓶中，滤过瓶上放置有滤过纸(Whatman2#)，收集滤过物置于旋转蒸发器中并在50℃条件下旋转蒸发45分钟，用去离子水调节到终体积为50ml，置于零下20℃-零下80℃冻存。

本发明的有益效果：

1.本发明利用80％丙酮200ml做为溶剂与100g树莓混合，此种比例为最佳配比，能充分提取树莓中有效成分，使植物化学物质的功效充分发挥，并且提取物的浓度高，能最大限度的保证树莓中抗氧化成份抗氧化的能力，从而保证了树莓提取物的抗肿瘤的能力。用Whatman2#滤纸可以滤过更多杂质，使提取物更纯。

2.本发明将打碎去渣后的新鲜树莓放入烧杯后置于冰块上，可以减少由于氧化反应而引起的颜色变褐植物化学物质失活。

3.通过利用TOSC方法检测树莓提取物的抗氧化活性，结果表明各实验浓度组树莓提取物都具有抗氧化活性，随着浓度的升高，抗氧化活性上升；树莓提取物能够从抑制多种肿瘤相关基因的表达来预防和治疗肿瘤；树莓提取物中的植物化学物质具有的抗氧化特性，可以清除体内的氧自由基(ROS)，预防细胞DNA的损伤，从而预防肿瘤的发生；总的鞣化酸(Ellagic acid)可以影响肿瘤细胞的一些生物学活性如增殖，癌基因表达，凋亡的发生等；植物化学物质能够抑制肿瘤细胞VEGF的表达，影响野生型p53的表达和促进肿瘤细胞的凋亡可能是树莓提取物预防和治疗恶性肿瘤的主要机制，体内实验表明树莓提取物能够有效的发挥体内抗肿瘤的活性，其效果非常明显。

具体实施方式：

实施例1：

预防原发性肝癌的树莓提取方法，其组成包括：在成熟季节摘取新鲜树莓并打碎去渣，将所述的打碎去渣后的树莓充分搅拌后放入烧杯中并置于冰块上，在100g树莓中加入80％的丙酮200ml在预冷的混合器内混合3分钟，然后使用匀浆器继续匀浆搅拌2分钟，取出匀浆液放入接有真空泵的滤过瓶中，滤过瓶上放置有Whatman2#滤过纸，收集滤过物置于旋转蒸发器中并在50℃条件下旋转蒸发45分钟，用去离子水调节到终体积为50ml，置于零下20℃-零下80℃冻存。

TOSC实验是利用气相色谱分析方法检测纯化溶液或生物样品的抗氧化性。在氧存在的条件下，ABAP可以在高温条件下产生过氧化物自由基，这些自由基进一步氧化KMBA产生乙烯，乙烯的产量可以通过气相色谱分析来检测。TOSC实验的理论基础为：外加的抗氧化剂与KMBA竞争过氧化物自由基，从而部分地抑制乙烯的生成。在我们的实验反应系统中，不同浓度的树莓提取物(200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml)加入4ml带胶盖的Teflon/Silicone小瓶中，小瓶中含有0.2mM KMBA，20mM ABAP和100mM磷酸盐缓冲液各0.1ml，最后用去离子水调节终体积为1ml。整个反应在加入100μl，200mM ABAP后被启动。在37℃，160r/min条件下的摇床内反应15、30、45、60分钟，对照组含有除树莓提取物外的其它所有试剂。在不同时段透过小瓶瓶塞抽取0.5ml反应液上方的气体，注入气相色谱反应系统中。氦气作为运送气体，流速为25ml/min。

通过利用TOSC方法检测树莓提取物的抗氧化活性，结果表明各实验浓度组树莓提取物都具有抗氧化活性，随着浓度的升高，抗氧化活性上升，目前已经发现的清除自由基的机理有两种：一种是增强抗氧化酶活性，迅速消灭自由基，比如超氧化物岐化酶和过氧化氢酶就是存在于人体正常组织当中的清除氧自由基的重要酶系统；另外一种方法是直接摄入抗氧化剂。据报道：蔬菜及水果中的主要的抗氧化物质是多酚类及黄酮类化合物，来源于苹果中的维生素C的抗氧化性仅占总的抗氧化能力的0.4％。树莓植物化学物质中鞣化酸(Ellagicacid)的抗氧化活性是Vc的600-800倍，说明树莓具有的较强的抗氧化活性主要来源于其它植物化学成分，他们是其预防肿瘤发生的主要原因之一。

癌症的发生机制十分复杂，不仅涉及多种癌基因、抑癌基因的变化，而且一些细胞因子在癌症发生、发展的过程中也起到一定的作用。尽管这些基因、细胞因子对细胞的作用方式不同，作用途径和作用部位有别，但最终结果都将导致细胞的恶性增殖。因此，遏制细胞的恶性增殖是肿瘤治疗的基础。我们的实验结果显示，树莓提取物随浓度升高，可以明显抑制肿瘤细胞增殖，从而预防肿瘤的发生。

在人类肿瘤中，抑癌基因p53的突变是较常见的原因之一，尤以大肠癌中表现更为明显。p53基因有野生型和突变型两种，前者为肿瘤抑制基因，后者为致癌基因，前者的突变、缺失或后者的过表达均可促进肿瘤的发生。我们实验检出的野生型p53蛋白，其阳性表达具有抑癌作用，实验表明，树莓提取物中的植物化学物质能够增强野生型p53的表达。

众多研究表明，VEGF在几乎所有恶性肿瘤组织中都有高度表达，较高的VEGF表达率反映了高水平的细胞增殖状态。研究结果表明树莓提取物具有明显的抑制VEGF表达的活性，使肿瘤细胞处于较低的增殖状态，而抑制肿瘤的发生和发展。VEGF高表达与野生p53蛋白的过表达呈负相关，提示癌肿的发生发展与多种肿瘤相关基因协同作用有关，而树莓提取物能够从抑制多种肿瘤相关基因的表达来预防和治疗肿瘤。

总之，树莓提取物中的植物化学物质具有的抗氧化特性，可以清除体内的氧自由基(ROS)，预防细胞DNA的损伤，从而预防肿瘤的发生；总的鞣化酸(Ellagic acid)可以影响肿瘤细胞的一些生物学活性如增殖，癌基因表达，凋亡的发生等；植物化学物质能够抑制肿瘤细胞VEGF的表达，影响野生型p53的表达和促进肿瘤细胞的凋亡可能是树莓提取物预防和治疗恶性肿瘤的主要机制，体内实验表明树莓提取物能够有效的发挥体内抗肿瘤的活性，其效果非常明显。

目前恶性肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势，但治疗手段主要是以手术为主，化疗、放疗为辅，疗效欠佳，死亡率高居各类疾病之首。因此，有关恶性肿瘤的预防、治疗问题是当代医务工作者面临的首要问题。就药物治疗而言，目前临床上应用的绝大多数抗癌药主要为化学合成药，其作用机制主要以抑制和杀灭肿瘤细胞为主，而且往往导致正常组织细胞的损伤，因此毒、副作用较大。另外，恶性肿瘤细胞长期接触药物后容易产生耐药性，大大地影响了治疗效果。天然植物提取物，其各种成份为天然配伍，几乎没有细胞毒性及副作用，可以作为长期预防及治疗用药。树莓提取物具有很强的抗氧化活性；具有明显的抗肝癌细胞系HepG-2增殖的活性；树莓提取物能够抑制肝癌细胞系HepG-2VEGF的表达和诱导肿瘤细胞发生凋亡；树莓提取物能够影响肝癌细胞系HepG-2野生p53的表达；树莓提取物抑制VEGF及影响野生p53的表达与诱导肿瘤细胞凋亡是其抗肿瘤机理的三个主要方面；树莓提取物在体内能够明显抑制肿瘤的发生和进展。