赭曲霉毒素A的高密度分子模拟表位肽的制备方法及应用

摘要

赭曲霉毒素A的高密度分子模拟表位肽的制备方法及应用，其特征是先用化学方法合成二条包含赭曲霉毒素A模拟表位及5′端分别有核酸内切酶位点EcoRI和BamHI的互补核苷酸序列，退火；然后将序列与经相同酶切的噬菌体载体PC89在连接酶作用下连接，连接产物转化感受态的E.coli细胞，培养扩增，挑单菌落进行阳性克隆鉴定；再表达和纯化；本发明制备出的赭曲霉毒素A的高密度分子模拟表位肽，模拟表位密度高，无需偶联载体蛋白可直接提纯后作为竞争抗原广泛应用于赭曲霉毒素A的免疫学检测中，并且可以扩增，使成本大为降低，且安全无毒保护了操作人员的身体健康。

说明书

技术领域

本发明涉及一种模拟表位肽的制备方法及应用，具体说涉及一种赭曲霉毒素A高密度分子模拟表位肽的制备方法及其作为竞争抗原在赭曲霉毒素A免疫学检测方法中的应用。

技术背景

当前，大量有毒有害物质如黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A等对人体健康和环境造成了严重危害，以酶联免疫吸附分析方法为代表的免疫学检测方法具有较高的灵敏度和特异性，对样品的纯度要求不高，且操作简单，特别适合于大批量样本的检测，已被广泛应用黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A等有毒有害物质的快速检测。

大多数有毒有害物质属小分子物质，没有供二株不同抗体结合的表位，必须采用竞争免疫分析方法进行检测。因此，需要制备用于竞争免疫分析的竞争抗原。常规制备竞争抗原用化学方法将这些有毒有害物质与载体偶联，该方法存在以下弊病：①试剂本身含有毒有害物质，若操作不慎，会对生产和操作人员的健康造成极大的危害，并可导致二次污染等环保隐患。②大多数标准品依赖进口，部份标准品难以获得且价格昂贵，使检测试剂的成本居高不下。③偶联反应的重复性差，部份标准品不稳定，致使检测产品的质量难以控制。

由此，科学家们设想用有毒有害物质的替代品参与免疫竞争反应，建立无毒的免疫学检测方法。新兴的噬菌体随机肽库展示技术可高效挑选出能与靶分子相结合的噬菌体，并利用这些噬菌体再感染大肠杆菌进行扩增，即可获得大量的能模拟该靶分子表位的肽。展示用噬菌体的基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白，与噬菌体展示密切相关的是二种不同的结构蛋白pVIII和pIII。pVIII是噬菌体的主要衣壳蛋白，单链DNA被包裹在大约2700-3000个pVIII分子组成的管状结构中。展示在pVIII上的外源蛋白或多肽由于pVIII拷贝数量大，特别适用于制备基因药物等需要大量表达的抗原。次要衣壳蛋白pIII其前体由424个氨基酸残基组成，形成3-5个拷贝，位于噬菌体的尾部，是噬菌体感染宿主所必需的。展示在次要衣壳蛋白pIII上的展示肽库由于拷贝数少，特别适用于筛选与靶分子有高度亲和力的配体分子，如抗原表位研究等。

有文献报道(刘仁荣，随机肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位及其应用，中国公共卫生，2005，21(8)：944-946)：用抗赭曲霉毒素A单克隆抗体淘选融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上的Ph.D.-7噬菌体展示随机肽库，并公布了赭曲霉毒素A的模拟表位肽序列。然而，这些与抗体有高度亲和力的模拟表位肽都是表达在次要衣壳蛋白上，拷贝数量太少，无法将其直接应用于竞争抗原的制备。其原因在于：竞争免疫分析方法对竞争抗原上的小分子半抗原表位的密度有一定的要求，若密度太低，竞争抗原上能结合的抗体数量就太少，导致抗原抗体复合物无法被检测。因此，在获得模拟表位的氨基酸序列后，通常采用化学方法合成模拟表位肽，再通过化学方法将其偶联到载体分子上，形成具有一定密度的模拟表位竞争抗原，可以替代赭曲霉毒素A竞争抗原用于免疫学检测分析，毒性较赭曲霉毒素A竞争抗原极大降低，但其不可扩增，成本较使用赭曲霉毒素A标准品有所下降但仍然较高，且费时费力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种赭曲霉毒素A模拟表位肽的制备方法，得到的模拟表位肽模拟表位密度高，无需偶联载体蛋白即可直接替代赭曲霉毒素A竞争抗原用于竞争免疫分析。

为解决上述技术问题本发明提供如下技术方案，它包括如下步骤：

(1)模拟表位核苷酸序列合成：用化学方法合成二条包含赭曲霉毒素A模拟表位及5′端分别有核酸内切酶位点EcoRI和BamHI的互补核苷酸序列，退火；

(2)序列导入噬菌体载体扩增：将序列与经相同酶切的噬菌体载体PC89在连接酶作用下连接(如图1)，连接产物转化感受态的E.coli细胞，培养扩增，挑单菌落进行阳性克隆鉴定；

(3)高密度模拟表位肽的表达和纯化。

步骤(1)中所述的所述的互补核苷酸序列最好为

T₁：5′-GAATTCATTCGTCCTATGGTGGATCCG-3′(EcoRI)

和T₂：5′-GGATCCCGGATCCACCATAGGACGAAT-3′(BamHI)。

本发明还涉及到所述方法制备出的赭曲霉毒素A高密度分子模拟表位肽作为竞争抗原在赭曲霉毒素A酶联免疫检测分析中的应用。

还涉及到以赭曲霉毒素A高密度模拟表位蛋白作为竞争抗原替代赭曲霉毒素A人工抗原，合成模拟表位多肽替代赭曲霉毒素A标准品用于ELISA检测。

本发明还涉及到一种赭曲霉毒素A免疫层析检测试纸的制作方法，包括如下步骤，(A)赭曲霉毒素A抗原的制备，包括单克隆抗体的免疫抗原和赭曲霉毒素A检测抗原的制备；(B)硝酸纤维素膜的检测线和质控线的制备；(C)示踪粒子结合物垫的制备；(D)组装试纸条。

具体地说，本发明所述的赭曲霉毒素A免疫层析检测试纸(参见附图2)，包括衬垫[1]，样品垫[2]，示踪粒子结合物垫[3]，硝酸纤维素膜[4]，吸水垫[5]，检测线[6]，质控线[7]，在衬垫[1]上按顺序有样品垫[2]，示踪粒子结合物垫[3]，硝酸纤维素膜[4]，吸水垫[5]；示踪粒子结合物垫[3]上有示踪粒子标记的抗赭曲霉毒素A的抗体[9]，硝酸纤维素膜[4]上还设有检测线[6]和质控线[7]，检测线[6]上有赭曲霉毒素A检测抗原[8]，质控线[7]上有抗抗体[10]，其中抗抗体[10]是抗赭曲霉毒素A的抗体[9]的抗体。

本发明所述的示踪粒子，可选用胶体金颗粒、乳胶颗粒、胶体硒颗粒、明胶颗粒或者磁性颗粒。

本发明所述的示踪粒子若选用常用的显色标记，当检测线、质控线正常显色，肉眼可直接分辨，若采用磁性颗粒作为示踪粒子，则需仪器判读。仪器分辨磁性颗粒的灵敏度更高。

本发明具有如下优点：本发明制备出的赭曲霉毒素A的高密度分子模拟表位肽，模拟表位密度高，无需偶联载体蛋白可直接提纯后作为竞争抗原广泛应用于赭曲霉毒素A的免疫学检测中，并且可以扩增，使成本大为降低，且安全无毒保护了操作人员的身体健康，具有良好的经济效益和市场前景。

附图说明

图1为PC89噬菌体载体的构建。

图2为间接竞争ELSEA标准曲线。

图3为赭曲霉毒素A免疫层析检测试纸条结构示意图。1为衬垫，2为样品垫，3为示踪粒子结合物垫，4为硝酸纤维素膜，5为吸水垫，6为检测线，7为质控线，8为赭曲霉毒素A检测抗原，9为抗赭曲霉毒素A的抗体。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但所述实施例不以任何形式限制本发明。

实施例1。

赭曲霉毒素A的高密度分子模拟表位肽的制备方法

(1)模拟表位表达载体的构建及鉴定

根据赭曲霉毒素A的序列，用化学方法合成二条包含赭曲霉毒素A模拟表位及核酸内切酶位点的核苷酸序列，以其中一模拟表位肽为例，

合成T₁：5′-GAATTCATTCGTCCTATGGTGGATCCG-3′(EcoRI)

和T₂：5′-GGATCCCGGATCCACCATAGGACGAAT-3′(BamHI)，加dd H₂O分别配成20pmol/μl的寡聚核苷酸单链溶液，各取10μl混合后，置于PCR仪，65℃保温10min，然后缓慢降温至室温，-20℃保存。

(2)序列导入、鉴定：

取PC89质粒DNA 32μl(30μg)，加10×酶切buffer 4μl，EcoRI(10U/μl)2μl，BamHI(10U/μl)2μl，37℃酶切2h，65℃20min灭活，2.5％琼脂糖电泳观察结果。在紫外灯下迅速切下目的条带，用UNIQ₂₁₀胶回收试剂盒回收。将回收后的PC89DNA片段与双链寡聚核苷酸连接。连接反应体系：双链寡聚核苷酸4μl，PC89载体DNA 4μl，T4DNA ligase(10U/μl)1μl，10×T4DNA ligation buffer1μl，总体积10μl，16℃连接过夜。连接液全量转化大肠杆菌感受态细胞，热激后涂布已加入40μl X-gal(4mg/ml)及4μl ITPG(40mg/ml)的含Amp的LB平板，37℃培养过夜，挑单菌落扩增细胞进行阳性克隆鉴定。

(3)高密度模拟表位蛋白的表达：

经鉴定后的阳性克隆挑单菌落接种于2ml Amp+Tet双抗SOC培养液中，37℃振荡培养2h，转移至400ml Amp+Tet双抗SOC培养液中，37℃振荡培养至A600约0.4时，加入1×10¹²PFU的VCSM13，37℃振荡培养1h，再加入终浓度为70mg/L的卡那霉素以及终浓度为1mmol/L的ITPG，37℃振荡培养过夜。

(4)高密度模拟表位蛋白的纯化：

将培养液4℃10000rpm离心10min，上清液加入PEG/NaCl，4℃沉淀过夜；4℃10000rpm离心15min，去上清，再用1mL TBST悬浮噬菌体，加入PEG/NaCl冰上孵育60min；4℃离心15min，去上清，沉淀用200μl TBST悬浮并测滴度，4℃保存。

实施例2。

赭曲霉毒素A的高密度分子模拟表位肽的在赭曲霉毒素A酶联免疫吸附检测方法中的应用

(1)取实施例1中纯化的高密度模拟表位蛋白，紫外分光光度计测定其在280nm的吸光值(A280nm)，根据Warburg-christian公式：蛋白质浓度(mg/ml)＝1.55A280nm-0.76A260nm，确定其蛋白浓度。

(2)采用方阵滴定确定高密度模拟表位蛋白和抗赭曲霉毒素A抗体的最佳使用浓度。具体如下：

A、用磷酸缓冲溶液(PBS，pH7.2)将高密度模拟表位蛋白配制成40、20、10、5、2.5、1.25和0.625μg/ml的浓度，按每条酶标板一个浓度(每条8个孔)，每孔100μL加入酶标板中，4℃过夜。

B、倾去包被液，PBST(PBS加0.2％的吐温20)洗涤三次，每次在厚叠吸水纸上扣干，每孔加入300μL 3％的脱脂牛奶(溶于PBST)作为封阻液，37℃保温保湿1小时；倾去封阻液，PBST洗涤三次，每次在厚叠吸水纸上扣干。

C、将抗赭曲霉毒素A抗体用PBS倍比稀释成1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000和1∶64000的浓度，依次加入各条处理好的酶标板板孔中，最后一孔加入PBS作空白对照，37℃保温保湿1小时。

D、PBST洗板三次，每次在厚叠吸水纸上扣干。每孔加100μL辣根过氧化物酶标记的抗抗体(酶标二抗)，37℃，保温保湿1小时。

E、PBST洗板三次，每次在厚叠吸水纸上扣干。每孔加OPD或TMB底物液100μL，37℃保温保湿避光反应10分钟后，每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，以空白对照孔调零，在酶标仪上测定酶标板492nm(OPD)或450nm(TMB)的吸光值，根据所有孔吸光值进行比较选择吸光值在1.5左右最低的高密度模拟表位蛋白包被浓度和最大的抗体稀释度即为高密度模拟表位蛋白和抗赭曲霉毒素A抗体的最佳使用浓度。

(3)通过化学合成模拟表位多肽(IRPMDVP)，制作标准曲线确定合成模拟表位多肽(IRPMDVP)与赭曲霉毒素A标准品的剂量关系，以之替代赭曲霉毒素A标准品。具体实施如下：

A、根据方阵滴定确定的赭曲霉毒素A高密度模拟表位蛋白的浓度。高密度模拟表位蛋白溶于0.1M pH8.6的NaHCO₃，100μL/孔，4℃包被过夜。

B、PBST洗板四次，3％脱脂牛奶300μL/孔4℃封闭2h。

C、PBST洗板四次，各孔分别加入不同浓度的赭曲霉毒素A标准品、合成模拟表位多肽50μL，再全部加入方阵滴定确定的抗赭曲霉毒素A抗体50μL，振荡混匀，37℃保温保湿1h。

D、PBST洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗抗体(100μL/孔)，37℃作用1h。

E、洗涤6次。联苯二胺(OPD)显色，2M H₂SO₄终止反应，测定492nm波长光密度(OD值)，计算各浓度的结合率，结合率(％)＝B/B₀×100％(B₀为不加赭曲霉毒素A或不加合成多肽的OD值，B为加赭曲霉毒素A或加入合成多肽的OD值)。

F、根据赭曲霉毒素A的浓度和结合率绘制赭曲霉毒素A竞争抑制曲线，根据合成模拟表位多肽的浓度和结合率绘制多肽竞争抑制曲线，通过参照标准曲线中相同结合率可得出标准品赭曲霉毒素A与合成模拟表位多肽的剂量关系。

(4)高密度模拟表位蛋白作为竞争抗原替代赭曲霉毒素A人工抗原，合成模拟表位多肽替代赭曲霉毒素A标准品用于ELISA检测，具体步骤如下：

A、根据方阵滴定确定的最佳高密度模拟表位蛋白浓度，用磷酸缓冲溶液(PBS，pH7.2)稀释，在酶标板中每孔加100μL高密度模拟表位蛋白，4℃过夜。

B、倾去包被液，PBST(PBS加0.2％的吐温20)洗涤三次，每次在厚叠吸水纸上扣干，每孔加入300μL 3％的脱脂牛奶(溶于PBST)作为封阻液，37℃保温保湿1小时；倾去封阻液，PBST洗涤三次，每次在厚叠吸水纸上扣干。

C、在酶标板各孔中加入浓度为40000，20000，10000，5000，2500，1250，625，312.5，156，100，50和0pg/mL的合成模拟表位多肽或待测样品(溶于35％甲醇PBS)50μL，再全部加入以PBS稀释的抗赭曲霉毒素A抗体50μL，同时设置空白对照(以PBST代替抗体)，37℃，保温保湿1小时；

D、PBST洗板三次，每次在厚叠吸水纸上扣干。每孔加100μL辣根过氧化物酶标记的抗抗体(酶标二抗)，37℃，保温保湿1小时

E、PBST洗板三次，每次在厚叠吸水纸上扣干。每孔加OPD或TMB底物液100μL，37℃保温保湿避光反应10分钟后，每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止反应，以空白对照孔调零，在酶标仪上测定酶标板492nm(OPD)或450nm(TMB)的吸光值，计算各浓度的结合率，结合率(％)＝B/B₀×100％(B₀为合成模拟表位多肽浓度为0时的吸光值，B为合成模拟表位多肽各浓度的吸光值)，同样计算各待测样品孔的结合率(B为待测样品孔的吸光值)，以各合成模拟表位多肽浓度的常用对数值(1gC)为横坐标，各浓度合成模拟表位多肽相应的结合率(B/B₀％)为纵坐标制作竞争抑制曲线(如图2)。

F、以各待测样品孔的结合率对应的纵坐标，查标准曲线对应的横坐标，再通过步骤(3)确定的合成模拟表位多肽与赭曲霉毒素A标准品的剂量关系的标准曲线，即可得出样品中赭曲霉毒素A的含量，或可用酶联免疫吸附检测方法专用分析软件对数据进行分析得出结果。

实施例3

将实施例2中的合成模拟表位多肽替换成高密度模拟表位肽，其余同实施例2。

实施例4。

赭曲霉毒素A免疫层析检测试纸

一种赭曲霉毒素A免疫层析检测试纸(图3)，包括衬垫1，样品垫2，示踪粒子结合物垫3，硝酸纤维素膜4，吸水垫5，检测线6，质控线7，在衬垫1上按顺序有样品垫2，示踪粒子结合物垫3，硝酸纤维素膜4，吸水垫5；示踪粒子结合物垫3上有示踪粒子标记的抗赭曲霉毒素A的抗体9，硝酸纤维素膜4上还设有检测线6和质控线7，检测线6上有赭曲霉毒素A检测抗原8，质控线7上有抗抗体10，其中抗抗体10是抗赭曲霉毒素A的抗体9的抗体。

检测原理是这样的：在样品垫2上滴加样品，如果样品中有赭曲霉毒素A，则赭曲霉毒素A经层析作用移动到示踪粒子结合物垫3，与限量的抗赭曲霉毒素A的抗体9结合，当移动到检测线6时，示踪粒子标记的抗赭曲霉毒素A的抗体9已无多余的结合位点与检测线6上的检测抗原(高密度模拟表位蛋白)8结合，检测线6不显色或不出现磁性增强。示踪粒子标记的抗赭曲霉毒素A的抗体9继续向前移动到质控线7，与质控线7上的抗抗体10反应，质控线7显色或出现磁性增强。若样品中无赭曲霉毒素A8，则示踪粒子结合物垫3上的示踪粒子标记的抗赭曲霉毒素A的抗体9和检测线6上的检测抗原8结合，检测线6显色或出现磁性增强，质控线7显色或出现磁性增强。

本实施例选用的示踪粒子为胶体金颗粒。