赭曲霉毒素A模拟表位及无噬菌体的模拟表位肽ELISA的建立

摘要

赭曲霉毒素A(OchratoxinA.OTA）是指自然条件下在大麦，玉米等粮食作物被青霉菌、曲霉菌等污染后，产生的一种毒性危害大、可致突变、致畸和致癌的小分子化合物，建立高灵敏监控手段是防止OTA污染食品进入人类食物链的有效措施之一。酶联免疫吸附方法（enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA）是用于OTA筛查检测最常用方法，但建立检测OTA的ELISA方法需要大量使用OTA毒素合成竞争抗原，大量接触毒素对操作人员存在潜在的危害，因此寻找OTA毒素替代物，并建立简便、快速、高灵敏的OTA的筛查方法具有重要意义。
　　本研究利用商业化的噬菌体随机七肽库，通过改进的淘选方法，得到了与抗OTA单克隆抗体2A11特异性结合的噬菌体模拟表位肽序列，并以此核心序列为模板，合成生物素化的肽段（生物素化的模拟抗原）为竞争抗原，建立了无噬菌体的直接竞争ELISA方法，并应用于玉米提取液中OTA的定量检测。
　　具体研究过程如下：首先以驴抗鼠二抗包被酶标孔，并进一步定向结合抗OTA单克隆抗体2A11。加入噬菌体随机七肽库与单抗结合，前三轮富集采用酸洗脱，第四轮富集采用超低浓度的OTA（0.1ng/mL）竞争洗脱。经鉴定随机挑选的30个噬菌体粒子均为与抗体2A11具有结合能力的阳性噬菌体粒子，其中16个噬菌体粒子在OTA浓度为0.1ng/mL显示较高的竞争抑制率。挑选这16株噬菌体测序，得到6个不同的肽段序列。其中序列为“GMVQTIF”的噬菌体粒子具有最高的检测灵敏度。
　　其次，以GMVQTIF序列为模板，合成生物素化的12肽（生物素化的模拟抗原）“GMVQTIF-GGGSK-biotin”为竞争抗原，建立直接竞争ELISA。在最优的条件下，基于模拟肽为竞争抗原的ELISA检测OTA的线性范围为0.005ng/mL—0.2ng/mL，半数抑制浓度(IC50值)为0.024ng/mL，最低检出限为0.001ng/mL,与商业化ELISA试剂盒相比灵敏度提高了5倍。通过BLI分析了生物素化的模拟肽和OTA全抗原与抗体的亲和常数，结果表明抗体2A11与生物素化的模拟表位亲和力远低于与普通OTA全抗原亲和力。特异性实验表明，本实验建立的ELISA方法与黄曲霉毒素B1、伏马毒素 B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇以及玉米赤霉烯酮无交叉反应。加标回收实验结果显示，该方法检测玉米加标样品批内回收率在98.7％-120.3%，变异系数在3%-10%之间，批间回收率在97.4%-105.2%之间，批间变异系数8%-20%，以上数据表明本实验方法具有良好的特异性及精密度。进一步将该方法与商业化ELISA试剂盒检测数据进行相关性分析，显示两种ELISA方法具有良好的相关性，表明本实验获得的“GMVQTIF-GGGSK-biotin”可以替代OTA作为竞争抗原建立无噬菌体的直接竞争ELISA方法，并用于玉米样本中OTA的高灵敏检测。

目录

声明

缩略语表

第1章 前言阐述

1.1赭曲霉毒素A

1.2 抗原物质和抗体的反应动力学

1.3 噬菌体展示技术的研究进展

1.4 本论文研究的主要内容及意义

第2章 OTA噬菌体模拟表位的淘选及鉴定

2.1 实验材料和仪器设备

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4讨论

第3章 基于模拟抗原表位肽的无噬菌体ELISA

3.1 实验材料和仪器设备

3.2 实验方法

3.3 结果和讨论

3.4结论

第4章 结论与展望

4.1 OTA噬菌体模拟抗原表位的淘选及鉴定

4.2模拟抗原表位肽为竞争抗原的无噬菌体ELISA

致谢

参考文献

附录1 仪器设备

攻读学位期间的研究成果

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