高密度赭曲霉毒素A模拟表位噬菌体的构建及其ELISA应用研究

摘要

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)模拟表位是能够良好模拟OTA分子抗原.决定簇空间结构的短肽,其能够与OTA抗体特异性结合,有望以其无毒、廉价的特点成为免疫学研究中天然OTA的替代物。本研究以带有OTA模拟表位(IRPMVDP)和肠激酶酶切位点(DDDDK)的寡链核苷酸为材料,将这段序列克隆至噬菌体载体pC89S4。再运用噬菌体展示技术将OTA模拟表位短肽以高密度展示于丝状噬菌体KM13表面。之后对该重组噬菌体进行免疫原性鉴定、保存方法研究以及应用研究。其主要内容如下:
　　 1.构建带有肠激酶酶切位点与赭曲霉毒素A模拟表位序列的噬菌粒载体
　　 将肠激酶酶切位点与OTA表位cDNA序列克隆至噬菌粒载体pC89S4,构建出了噬菌粒pC89-COTA。对pC89-COTA测序,结果显示序列完全正确。
　　 2.高密度OTA表位噬菌体的构建及无毒OTA ELISA检测方法的建立
　　 通过丝状噬菌体pⅧ展示系统,表达出了具有高密度OTA模拟表位的重组噬菌体且模拟表位N末端连接有肠激酶酶切位点。利用肠激酶酶切该重组噬菌体,获得了高滴度的重组噬菌体,证明了模拟表位N末端的噬菌体蛋白残余序列会妨碍其与OTA抗体的结合。利用高滴度重组噬菌体建立了无毒OTA ELISA检测方法。
　　 3.重组噬菌体表位蛋白表达量优化以及保存方法研究
　　 通过对噬菌体加入量、IPTG诱导时间和剂量的测试,优化了重组噬菌体表达条件,获得了大量具有高密度OTA表位的重组噬菌体。进行了重组噬菌体保存方法的研究,寻找到了良好的重组噬菌体保护剂。