包含二膦酸盐化合物的水混悬液的长期持续释放药物组合物

摘要

提供了用于长期持续释放二膦酸盐药物的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物包括固体的水混悬液，所述固体包括二膦酸盐药物的盐和五价磷氧酸的盐。所述组合物可用于治疗各种骨疾病，包括骨质疏松。

说明书

相关申请的交叉引用

[0001]本申请要求于2006年12月21日向美国专利商标局提交的美国临 时申请60/876,800的优先权和权益，其名称为“包含二膦酸盐化合物的水混悬 液的长期持续释放药物组合物”，其全部内容通过参考在此引入。

技术领域

[0002]本发明涉及用于长期持续释放二膦酸盐(bisphosphonate)药物的 无菌药物组合物。更具体的，本发明涉及用于治疗和预防骨质疏松及其他相关 骨疾病的二膦酸盐药物的长期持续释放制剂。

背景技术

[0003]骨质疏松是一种以低骨密度和骨组织结构损坏为特征的骨疾病，导 致骨脆性增加和易于骨折，特别是脊柱、臀和腕区域。骨质疏松是一种重大的 公共卫生和经济问题。根据美国国家骨质疏松基金(US Nationa l Osteoporosis Foundation)所说，骨质疏松影响大约44百万美国人。据估计在美国10百万 个体已经患病，和差不多超过34百万估计患有低骨密度，使他们患骨质疏松的 风险增加。受骨质疏松影响的人群中大约80％是女性。数据表明超过50岁的 每两个女性中的一个和每四个男性中的一个在他们生存期中将患有与骨质疏松 相关的骨折。然而，骨质疏松可以发生在任何年龄。每年骨质疏松引起超过 1.5百万例骨折。估计用于骨质疏松和相关骨折的国家直接财政支出(医院和 疗养院)的总数大约是每年140亿美元。

[0004]骨质疏松和/或其他相关骨疾病降低了患者的生活质量，使预防和/ 或治疗这种疾病成为重要课题。有许多备选方案可以用来预防和/或治疗骨质 疏松，例如：在市场上能以名称等等买到 的雌激素/激素替代疗法(ERT/HRT)；在市场上能以名称买到的选择性 雌激素受体调节剂(SERMs)；在市场上能以名称等等买到的二膦酸盐化合物。其他药物治疗也可使用，例如在市场上能以名称 买到的降钙素；钙补充剂；维生素D；和氟化钠。

[0005]二膦酸盐化合物显得是最有效和通用的选择之一，用于预防和/或治 疗骨质疏松及其他相关疾病例如佩吉特病、恶性高血钙和转移性骨疾病等等。 目前市售的二膦酸盐化合物可用于口腔或静脉内给药。由于其给药的便利性， 口服给药通常是受欢迎的。然而，二膦酸盐化合物的口服给药与低生物利用度 有关，并且还已知导致胃肠道有关的副作用，包括：食管炎、食道溃疡、胸骨 后疼痛和上胃肠道粘膜的局部刺激。另外，二膦酸盐化合物的给药涉及复杂和 不便步骤。在最佳的条件下，二膦酸盐化合物如和 的口服生物利用率小于1％，并且如果没有遵守给药的建议生物利用 率将更低。据估计仅有约50％的口服吸收二膦酸盐化合物抵达治疗位点，而其 余的从尿中排泄。

[0006]二膦酸盐化合物的静脉内(“IV”)给药对于治疗高血钙是常用的， 但是对于治疗骨质疏松不是常规的给药方法。此外，二膦酸盐化合物的静脉内 给药涉及复杂和不便的给药步骤，并且与更多副作用相关，例如颌的骨坏死 (“ONJ”)。已经报道，97％的与二膦酸盐药物相关的ONJ与静脉内给药有关系。 在任一给药方式中，药物在短期内达到其峰值，并且在几个小时内被清除出系 统。

[0007]由于它们差的生物利用度，二膦酸盐药物需要连续给药多年，以便 在预防/治疗骨质疏松中有效。然而，由于它们不便的给药要求和相关副作用， 在患者中长期应用它们预防和治疗骨质疏松是困难和受限的。

发明概要

[0008]根据本发明的某些实施方案，二膦酸盐药物的给药仅需要每隔数月 一次，并且二膦酸盐的副作用被充分地减少或消除。如此，本发明的某些实施 方案提供了非常宝贵的长期益处，包括增加的骨矿物密度和减少的骨折。

[0009]本发明的某些实施方案涉及通过肌内给药用于长期持续释放二膦 酸盐药物的无菌药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含二膦酸盐药 物的水混悬液。在另一个实施方案中，本发明涉及长期持续释放药物组合物， 包含由二膦酸盐药物的盐和五价磷氧酸的盐组成的固体的水混悬液。该固体的 水混悬液适合于把二膦酸盐药物以延长的时间期限释放到患者，例如大约两个 月或更长。所述组合物适合于肌内给药和用于治疗和预防骨质疏松及其他骨相 关疾病。

[0010]根据一个实施方案，二膦酸盐药物具有通式结构，其酸式(二膦酸) 为(HO)₂PO-R-OP(OH)₂，其中R可以包括各种基团，因此二膦酸盐包括但不限于， 帕米膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸和替鲁膦酸。

[0011]本发明的一个实施方案涉及长期持续释放药物组合物，其包含二膦 酸盐药物的盐和五价磷氧酸的盐的水混悬液，其中所述的盐是钙、锌、镁和其 组合的盐。二膦酸盐药物的盐包括但不限于正盐、酸式盐、碱式盐和其组合。 二膦酸盐药物的盐还可以包括无水盐、水合物和水合物的组合。五价磷氧酸的 盐包括但不限于正盐、酸式盐、碱式盐和其组合。五价磷氧酸的盐还可以包括 磷酸盐、焦磷酸盐、偏磷酸盐、多磷酸盐和其组合。另外，五价磷氧酸的盐可 以包括无水盐、水合物和水合物的组合。

[0012]五价磷氧酸的合适盐的非限制性实例包括二水合磷酸二钙、无水磷 酸二钙、磷酸八钙、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙、无定形磷酸钙、缺钙羟磷灰 石、羟磷灰石和磷酸四钙。

[0013]本发明的另一个实施方案涉及包含固体的长期持续释放药物组合 物，所述固体包括二膦酸盐药物的盐和五价磷氧酸的盐，其中所述固体具有按 重量以二膦酸计在盐水中小于大约0.05％的溶解度。所述固体可以是无定形的、 结晶的(其中它可以有各种晶体结构)或它们的混合物。在一个具体实施方案 中，所述固体具有小于大约100微米的粒子尺寸。

[0014]本发明的另一个实施方案涉及长期持续释放组合物，其中固体悬 浮在水介质中，和具有从大约6.0至大约9.5的pH值。用于本发明组合物的 一种水介质是美国药典中规定的注射用水。

[0015]根据一个实施方案的持续释放药物组合物可以进一步具有范围从 大约0.5至大约3.0的钙与磷的重量比。

[0016]根据一个实施方案的组合物还可以包括一种或多种非活性药物赋 形剂。合适赋形剂的非限定性实例包括表面活性剂、悬浮剂、分散剂、张力调 节剂、防腐剂、pH缓冲剂、渗透压调节剂、粘度调节剂、密度调节剂等等。

[0017]本发明的另一实施方案涉及制备组合物的方法。合适方法的非限 定性实施例包括共沉淀、共结晶、扩散、渗透、吸附等等。

[0018]总之，在本发明的一个实施方案中，无菌药物组合物包含用于注射 给药的二膦酸盐药物的水混悬液。所述组合物是包括二膦酸盐和五价磷氧酸的 盐的固体。所述组合物用于二膦酸盐的持续释放。固体具有低溶解度，即， 按重量以二膦酸计在盐水中小于大约0.05％。

[0019]根据一个实施方案，二膦酸盐药物具有通式结构，其酸式(二膦酸) 为，

在上式中，R可以具有各种结构，包括任意二膦酸盐，包括但不限于：

1-羟基-4-氨基-亚丁基               (阿仑膦酸)，

1-羟基-3-(甲基戊基氨基)亚丙基      (伊班膦酸)，

1-羟基-3-氨基-1-亚丙基             (帕米膦酸)，

1-羟基-2-(3-吡啶基)-亚乙基         (利塞膦酸)，

4-氯-苯基)-硫代-亚甲基             (替鲁膦酸)，

1-羟基-2-咪唑-1-基-亚乙基          (唑来膦酸)。

[0020]在另一个实施方案中，所述盐可以是钙、锌、镁和它们组合的盐。 二膦酸盐药物的盐可以是正盐、酸式盐、碱式盐或它们的组合。二膦酸盐药物 的盐可以是无水盐、水合物或二膦酸药物的各种水合物的组合。五价磷氧酸的 盐可以是磷酸盐、焦磷酸盐、偏磷酸盐、多磷酸或它们的组合。五价磷氧酸的 盐能是正盐、酸式盐、碱式盐或它们的组合。五价磷氧酸的盐可以是无水盐、 水合物或各种水合物的组合。五价磷氧酸的合适盐的非限定性实施例包括：

二水合磷酸二钙(DCPD)，CaHPO₄·2H₂O

无水磷酸二钙(DCPA)，CaHPO₄

磷酸八钙(OCP)，Ca₈(HPO₄)₂(PO₄)₄·5H₂O

α-磷酸三钙(α-TCP)，α-Ca₃(PO₄)₂

β-磷酸三钙(β-TCP)，β-Ca₃(PO₄)₂

无定形磷酸钙(ACP)，Ca_x(PO₄)_y·nH₂O

缺钙羟磷灰石(CDHA)，Ca_10-x(HPO₄)_x(PO₄)_6-x(OH)_2-x(x＝0～1)

羟磷灰石(HA)，Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂

磷酸四钙(TTCP)，Ca₄(PO₄)₂O

[0021]在一个实施方案中，固体可以是无定形的或具有各种晶体结构的晶 体，或它们的混合物。

[0022]根据一个实施方案，在组合物中二膦酸盐药物的盐的重量百分数是 小于大约50％。在组合物中钙与磷的重量比范围是大约0.5至大约3.0。组合 物的平均粒子尺寸范围是大约1至大约100微米。

[0023]在一个实施方案中，在组合物的无菌药物水混悬液中的药物水载体 是美国药典规定的注射用水。用于注射给药的无菌药物水混悬液组合物的pH 值范围是大约6.0至大约9.5。

[0024]在另一个实施方案中，组合物的无菌药物水混悬液可以包含各种非 活性的药物赋性剂，例如表面活性剂、悬浮剂、分散剂、张力调节剂、防腐剂、 pH缓冲剂、渗透压调节剂、粘度调节剂、密度调节剂等等。

[0025]组合物可以通过任何合适的方法制备，包括但不限于共沉淀、共结 晶、扩散、渗透等等。

[0026]根据一个实施方案，用于注射给药二膦酸盐药物的无菌药物水混悬 液组合物包括具有二膦酸盐药物的钙盐和五价磷氧酸的钙盐的固体。该组合物 是用于二膦酸盐药物的持续释放，并且固体的水混悬液适合于把二膦酸盐药物 以延长的时间期限释放到患者，例如超过大约两个月或更长。组合物具有按重 量以二膦酸计在盐水中小于大约0.05％的低溶解度。组合物以按重量计大约 50％或更少的数量包含二膦酸盐药物的钙盐。混悬组合物的粒子尺寸范围是大 约1至大约100微米。无菌药物水混悬液组合物的pH值范围是大约6.0至大 约9.5。在水混悬液中钙与磷的重量比范围是大约0.5和大约3.0。

附图说明

[0027]本发明的上述和其他特征和优点将通过参考以下详细说明，同时结 合附图被更好的理解，其中：

[0028]图1是根据本发明一个实施方案，以复合物中活性药物成分的数量 为基准，阿仑膦酸钙盐-磷酸钙复合物的溶解度图；

[0029]图2是根据本发明一个实施方案的阿仑膦酸钙盐-磷酸钙盐复合 物随时间鼠每日尿排泄量与活性现有技术对照的比较图；和

[0030]图3是在给药两种不同剂量的根据本发明一个实施方案的阿仑膦 酸钙盐-磷酸钙盐复合物和盐水安慰剂后，鼠骨矿物密度随时间的改变图。

发明详述

[0031]根据本发明的一个实施方案，无菌药物组合物包含二膦酸盐药物的 水混悬液。所述药物组合物是包含固体的水混悬液的长期持续释放组合物，所 述固体包括二膦酸盐药物的盐和五价磷氧酸的盐。固体的水混悬液适合于把二 膦酸盐药物以延长的时间期限释放到患者，例如超过大约两个月或更长。所述 组合物适合于肌内给药和用于预防和治疗骨质疏松及其他骨相关疾病。

[0032]意外地，申请人发现本发明的组合物，即二膦酸的复盐的混悬物， 与现有技术的钙盐相比产生显著更低的溶解度(大约低100至1000倍)。这使 本发明的制剂显示出非常慢和更长期持续释放的分布，如在以下给出的实施例 中所说明的。例如，如上所述，固体的水混悬液适合于把二膦酸盐药物以延长 的时间期限释放到患者，例如超过大约两个月或更长。

[0033]在一个实施方案中，二膦酸盐药物可以具有通式结构，其酸式(二 膦酸)为(HO)₂PO-R-OP(OH)₂，其中R能包括用于二膦酸盐的任意基团，其非限 定性的实施例包括1-羟基-3-氨基-1-亚丙基(帕米膦酸)，1-羟基-4-氨基-亚 丁基(阿仑膦酸)，1-羟基-3-(甲基戊基氨基)亚丙基(伊班膦酸)，1-羟基 -2-(3-吡啶基)-亚乙基(利塞膦酸)，1-羟基-2-咪唑-1-基-亚乙基(唑来膦酸)， 和(4-氯-苯基)-硫代-亚甲基(替鲁膦酸)。

[0034]根据一个实施方案，本发明涉及包含固体的持续释放药物组合物， 所述固体包括二膦酸盐药物的盐和五价磷氧酸的盐。固体悬浮在水介质中。固 体具有按重量以二膦酸计在盐水中小于大约0.05％的溶解度。固体具有小于大 约100微米的粒子尺寸，例如固体具有大约10至大约50微米的粒子尺寸。所 述固体可以是无定形的、结晶的(具有各种晶体结构)或它们的混合物。合适 水介质的一个非限定性的实施例是美国药典规定的注射用水。

[0035]用于组合物的合适盐的非限定性实施例包括钙、锌、镁和它们组合 的盐。二膦酸盐药物的盐可以包括但不限于正盐、酸式盐、碱式盐、无水盐、 水合物和它们的组合。五价磷氧酸的盐可以包括但不限于正盐、酸式盐、碱式 盐、磷酸盐、焦磷酸盐、偏磷酸盐、多磷酸盐、无水盐、水合物和它们的组合。

[0036]五价磷氧酸的合适盐的非限定性实施例包括二水合磷酸二钙 (DCPD)，CaHPO₄·2H₂O；无水磷酸二钙(DCPA)，CaHPO₄；磷酸八钙(OCP)， Ca₈(HPO₄)₂(PO₄)₄·5H₂O；α-磷酸三钙(α-TCP)，α-Ca₃(PO₄)₂；β-磷酸三钙(β -TCP)，β-Ca₃(PO₄)₂；无定形磷酸钙(ACP)，Ca_x(PO₄)_y·nH₂O；缺钙羟磷灰石(CDHA)， Ca_10-x(HPO₄)_x(PO₄)_6-x(OH)_2-x(x＝0～1)；羟磷灰石(HA)，Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂；和磷酸 四钙(TTCP)，Ca₄(PO₄)₂O。

[0037]根据一个实施方案，组合物具有大约0.5至大约3.0的钙与磷重量 比，例如，钙与磷的重量比可以是大约1.5至2.5。组合物的pH值可以是大 约6.0至大约9.5，例如，组合物的pH值可以是大约6.5至大约8.5。选择性 地，组合物还可以包含各种非活性的药物赋性剂。合适赋形剂的非限定性实例 包括表面活性剂、悬浮剂、分散剂、张力调节剂、防腐剂、pH缓冲剂、渗透压 调节剂、粘度调节剂、密度调节剂和它们的混合物。

[0038]在一个实施方案中，组合物是固体的长期持续释放制剂，所述固体 包含：(a)二膦酸盐药物的盐，和(b)五价磷氧酸的盐，其中固体悬浮在水溶 液中以形成混悬液。二膦酸盐药物的盐以按重量计小于大约50％的数量存在于 组合物中，例如，二膦酸盐药物的盐以大约5至大约30％的数量存在。对于组 合物的一个典型的盐是钙盐。在组合物中钙与磷的重量比是大约0.5至大约 3.0，例如，钙与磷的重量比可以是大约1.5至大约2.5。固体具有小于大约 100微米的粒子尺寸，例如，固体具有从大约10至大约50微米的粒子尺寸。水 溶液可以是美国药典规定的注射用水。水混悬液可以具有大约6.0至大约9.5 的pH值，例如，pH值可以是大约6.5至大约8.5。水混悬液可以包含一或多 种非活性的药物赋性剂，包括但不限于表面活性剂、悬浮剂、分散剂、张力调 节剂、防腐剂、pH缓冲剂、渗透压调节剂、粘度调节剂、密度调节剂等等。

[0039]本发明的某些组合物提供二膦酸盐药物的长期持续释放。另外， 某些组合物避免了与口服二膦酸盐药物相关的各种不良副作用。本发明组合物 的给药剂量明显小于口服剂量，其具有高生物利用度，因此避免了很多与高口 服剂量相关的不良副作用。发明的持续释放组合物还充分地消除了峰剂量(过 度剂量)和谷剂量(不足剂量)。发明的组合物对于患者来说是方便的，并且 由于它们极低的溶解度减少了组织刺激。

[0040]如上所述和以下实施例的说明，本发明组合物的某些实施方案与现 有技术组合物相比具有改善的持续释放特征。特别是，根据本发明的一个实施 方案，组合物释放的初始量(initial bolus)小于大约10％。所述初始量被 定义为在给药后第一个三天内释放的药物数量。例如，本发明的一个实施方案 释放的初始量是大约8％(其明显小于现有技术的大约55％)，如以下实施例中所 说明的。

[0041]根据本发明的另一个实施方案，组合物释放的最大浓度，或峰数量 (表示为Cmax)，小于大约10微克/天。例如，本发明的一个实施方案具有大 约8微克/天的Cmax，其明显小于现有技术的74微克/天。

[0042]在另一个实施方案中，组合物在延长的时间期限内释放峰数量 (Cmax)。释放Cmax所花费的时间被表示为tmax，和根据一个实施方案，tmax 大于大约10天。例如，本发明的一个实施方案具有大约13天的tmax，其明 显长于现有技术的1天。

[0043]根据本发明的另一个实施方案，其组合物花费延长的时间期限来释 放50％和90％的药物。组合物释放50％药物所花费的时间被表示为N₅₀，和组合 物释放90％药物所花费的时间被表示为N₉₀。根据一个实施方案，组合物具有大 于大约15天的N₅₀，和大于大约35天的N₉₀。例如，在一个实施方案中，组合 物具有大约16.6天的N₅₀，和大约38.5天的N₉₀，其也分别明显长于现有技术的 2.8和9天。

[0044]本发明的组合物可以通过多种方式制备。在一个实施方案中，例 如，组合物是通过共沉淀制备的。在另一个实施方案中，组合物是通过共结晶 制备的。在另一个实施方案中，组合物是通过扩散制备的。在另一个实施方 案中，组合物可以通过渗透或吸附来制备。本发明的持续释放组合物和制备组 合物的方法将在下面的实施例中进一步说明，其仅是用于说明性的目的，和并 不是意图限制本发明的范围。

比较实施例1：阿仑膦酸钙盐(AC)的制备

[0045]为了与本发明的某些实施方案比较，阿仑膦酸钙(AC)组合物被根 据本实施例制备，其不包括五价磷氧酸的盐。

[0046]2.03g(6.3mM)的三水合阿仑膦酸钠被溶解于60mL水中。0.94g 的二水合氯化钙被溶解于30mL水中。两种溶液都被冷却至室温。

[0047]氢氧化钠和氯化钙溶液被同时加入阿仑膦酸溶液，以保持溶液的pH 值在7.0，直至所有的氯化钙溶液都被添加。通过过滤收集沉淀并用水洗涤。 固体在烘箱中120℃过夜干燥，以获得1.5g的阿仑膦酸钙，表示为Ca_kY(其 中Y是阿仑膦酸盐阴离子)。在中性溶液(人血液的pH)中形成的阿仑膦酸钙 的k平均值是1.5+/-0.1。化学上，Ca_1.5Y相当于Ca₃Y₂。Ca_1.5Y在盐水中的溶 解度，以阿仑膦酸计，被测量是247微克/毫升或0.0247％。

[0048]盐水溶解度测量是以如下方式进行(除非另有描述，复合物产品在 盐水中的所有溶解度都是采用如下步骤测量的)：盐水被pH缓冲到pH＝7.4。 200mg的产品被添加到20mL的缓冲盐水中。这种溶液被在室温下搅拌直到平 衡。上清液被通过离心分离，并过滤通过0.1μm过滤器。通过高效液相色谱 法(HPLC)来测量阿仑膦酸盐。

实施例1：阿仑膦酸钙-磷酸钙(AC-PC)复合物(固态溶液)的制备

[0049]磷酸盐是通常使用的五价磷氧酸的盐。本实施例表明了根据本发 明的一个实施方案通过共沉淀来制备阿仑膦酸钙-磷酸钙(AC-PC)的复合物 或固态溶液。

[0050]4.06g(12.5mM)的三水合阿仑膦酸钠和相同摩尔数量的磷酸二氢 钠(无水)1.5g(12.5mM)被溶解于160mL的水中以获得溶液A。4.75g的 二水合氯化钙被溶解于50mL水中以获得溶液B。溶液A和B两者都被冷却至 室温。溶液B被添加到阿仑膦酸盐-磷酸盐溶液(溶液A)，混合物被充分混 合以获得溶液C。这种澄请溶液C的pH值是大约3。

[0051]在搅拌下1N的氢氧化钠和溶液C被同时添加到300mL的40℃水 中，以保持溶液的pH值在40℃为6.75，直至所有的溶液C都被添加。通过过 滤收集沉淀并用水洗涤。固体被在120℃的烘箱中干燥超过16小时。这样获 得了5.61g的阿仑膦酸盐和磷酸盐的钙复盐，其分子比为1∶1。由于磷酸钙的 存在，产生了阿仑膦酸钙-磷酸钙(AC-PC)的复合物或固态溶液。在AC- PC复合物中的活性药物成分(API)是阿仑膦酸盐。

[0052]进行相同的步骤，但使用不同的阿仑膦酸钠和磷酸二氢钠的摩尔 比，即，n＝3，5，6，8，10，12，15和20，来制备AC-PC的复合物。具有 不同数量API的AC-PC复合物在以下表1中概述：

表1通过共沉淀来制备AC-PC复合物

*：为反应物的比例：阿仑膦酸钠对磷酸二氢钠

**：在室温下和以阿仑膦酸计。

[0053]在表1中的数据显示AC-PC复合物的溶解度，以阿仑膦酸计，与 阿伦膦酸钙(AC)本身相比出人意料地低100到1200倍。例如，对于有12.6％ API的AC-PC复合物在盐水中API的溶解度是仅有0.44微克/mL或0.000044％， 其与阿伦膦酸钙的，即247微克/mL，如在比较实施例1中报道的相比要低558 倍。对于AC-PC复合物的这种API的极低溶解度，为API更好的持续释放提 供了基础。图1表明随着在AC-PC复合物中API数量的减少，AC-PC复合物 的实验溶解度一致的降低。

[0054]上述用来制备AC-PC 复合物的共沉淀方法的反应可以在不同条件 下进行，例如不同pH值、温度、反应物混合顺序等等。然而，对于获得具有 API低溶解度的复合物，特征保持相同。

实施例2：利塞膦酸钙和磷酸钙(PC)复合物的制备

[0055]本实施例表明，PC也能够与另一种二膦酸盐药物的钙盐，利塞膦 酸钙，形成复合物。

[0056]0.61g(2mM)无水利塞膦酸钠和2.4g磷酸二氢钠(无水)被溶于 30mL水中。5.6g二水合氯化钙被溶于10mL水中。利塞膦酸盐-磷酸盐溶液 和氯化钙溶液被在室温下混合。

[0057]利塞膦酸盐-钙-磷酸盐溶液和0.5N氢氧化钠被同时添加到 100mL水中，以保持pH在7.00，直至所有的利塞膦酸盐都被添加。通过过滤 收集沉淀并用水洗涤。固体被在105℃的烘箱中干燥。这样获得3.93g的利塞 膦酸盐与磷酸盐的钙复盐。

[0058]分析显示复合物具有12.33％的API(以利塞膦酸计)。在室温下盐 水中这种复合物的API(以利塞膦酸计)的溶解度是2.8微克/mL或0.00028％。 这是非常低的溶解度和适合于持续释放二膦酸盐药物。

实施例3：唑来膦酸钙和磷酸钙(PC)复合物的制备

[0059]本实施例表明，PC也能够与另一种二膦酸盐药物的钙盐，唑来膦 酸钙，形成复合物。

[0060]0.27g(1mM)唑来膦酸和0.6gm(5mM)磷酸二氢钠(无水)被溶 于10mL水中。1.5g二水合氯化钙被溶于5mL水中。唑来膦酸盐-磷酸盐溶 液和氯化钙溶液被在室温下混合。0.05g二水合氯化钙和0.3g氯化钠被添加 到20mL水中。氢氧化钠和唑来膦酸盐-钙-磷酸盐溶液被同时添加以保持pH 在室温下为7.00，直至所有的唑来膦酸盐-磷酸盐溶液都被添加。通过过滤 收集沉淀并用水洗涤。固体被在120℃的烘箱中干燥。这样获得了1.15g的唑 来膦酸与磷酸的钙复盐，其分子比为1∶5。

[0061]分析显示这种复合物具有24.1％的API(以唑来膦酸计)。这种复 合物在室温下水中的溶解度，以唑来膦酸计，为7.5微克/mL或0.00075％。这 也是非常低的溶解度。

实施例4：AC和焦磷酸钙(PPC)复合物的制备

[0062]焦磷酸盐也是普通的五价磷氧酸的盐。本实施例表明了一个典型 的通过共沉淀制备阿伦膦酸钙-焦磷酸钙(AC-PPC)复合物的方法。

[0063]0.81g的三水合阿伦膦酸钠和1.12g十水合焦磷酸钠(Na₄P₂O₇·10H₂O) 被溶于75mL水中。1.21g的二水合氯化钙被溶解于75mL水中。阿伦膦酸 盐-焦磷酸盐溶液的温度被升高至40至50℃。氯化钙和氢氧化钠溶液在搅拌 的同时向阿伦膦酸盐-焦磷酸盐溶液添加，以保持溶液的pH值在7.4，直至所 有的氯化钙溶液都被添加。混合物被冷却至室温。通过过滤收集沉淀并用水 洗涤。固体在105℃的烘箱中干燥整夜。这样获得了1.06g的阿伦膦酸与焦磷 酸的钙复盐，其分子比为1∶1。

[0064]由于焦磷酸钙的存在，产生了阿伦膦酸钙和焦磷酸钙(AC-PPC) 的复合物或固态溶液。进行如上相同的步骤，但使用不同的阿伦膦酸钠和焦磷 酸钠的摩尔比，即，n＝2，3，5和10，来制备更多的AC-PPC复合物。具有 不同数量API的AC-PPC复合物在以下表2中概述：

表2通过共沉淀制备AC-PPC复合物

*为反应物的比例：阿伦膦酸钠比焦磷酸钠

**在室温下和以阿仑膦酸计。

[0065]针对在盐水中API的溶解度，AC-PPC复合物显示了与AC-PC复 合物相同的特征。具体的说，对于API来说，AC-PPC复合物具有极低的溶解 度，从0.00001％至0.001％。并且，在复合物中API的量越少，则API的溶解 度越低。

实施例5：AC和三聚磷酸钙(tripolyphosphonate)(TPC)复合物的制备

[0066]本实施例表明另一种五价磷氧酸的钙盐，三聚膦酸盐，也可以通过 共沉淀形成阿伦膦酸钙-三聚膦酸钙(AC-TPC)复合物。

[0067]2.03g的三水合阿伦膦酸钠(6.25mmol)和6.9g三聚磷酸钠，Na₅P₃O₁₀被添加到100mL水中，和混合物被搅拌直至全部溶解。10.34g的二水合氯化 钙被溶解于200mL水中。氯化钙溶液被加热到40℃和pH被调节到7.0。阿 伦膦酸盐-三聚膦酸盐溶液被滴加到氯化钙溶液中，通过添加1N的NaOH保持 产物溶液的pH在7.0。通过过滤收集沉淀并用水洗涤。固体在120℃的烘箱 中干燥整夜。这样获得8.82g的阿伦膦酸与三聚磷酸的钙复盐。

[0068]分析显示这种复合物具有12.6％的API，以阿仑膦酸计。在室温下 盐水中这种复合物的API(以阿仑膦酸计)的溶解度是2.69微克/mL或 0.000269％。因此，AC-TPC也是一种具有极低API溶解度的复合物。

实施例6：阿伦膦酸锌-磷酸锌复合物的制备

[0069]在AC-PC复合物中的金属能用其他二价金属替代，例如锌、镁等 等。本实施例表明通过共沉淀来制备阿伦膦酸锌-磷酸锌复合物。

[0070]3.25g的三水合阿伦膦酸钠和1.42g的磷酸氢二钠(无水)被溶于 100mL水中。在加热板上保持溶液温度在50℃。在整个过程中都保持这个温 度。在搅拌的同时，在50mL水中的5.8g二水合醋酸锌溶液被添加到阿伦膦酸 盐-磷酸盐溶液。通过同时添加氢氧化钠溶液，溶液的pH被保持在7.4，直 至所有的醋酸锌溶液被添加。通过过滤收集沉淀并用水洗涤。然后固体在120 ℃干燥整夜。这样获得了5.28g的阿伦膦酸和磷酸的锌复盐，其分子比为1∶ 1。在室温下盐水中这种复合物的API(以阿仑膦酸计)的溶解度是2.4微克 /mL，即，0.00024％。这也是极低的API溶解度。

实施例7：通过吸附来制备AC-PC复合物

[0071]除共沉淀方法之外，AC-PC复合物也可以通过各种其他方法制备， 例如，举例，吸附和扩散。在本实施例中，市售羟磷灰石(HA)，其是磷酸钙 的多种形式之一，被用于通过吸附制备AC-PC复合物。

[0072]0.66g(2.0mM)的三水合阿伦膦酸钠被添加到50mL水中，和溶液 被搅拌直至全部溶解。pH被调节到8.0至8.5的范围。2g的羟磷灰石 (Spectrum，CA165)被添加，和溶液被在室温下搅拌20小时。在搅拌后，200mL 的水被添加，和通过过滤分离固体。固体被转移，200mL的水被添加，和固体 被再次过滤。这个步骤被再重复一次。固体产物被在105℃干燥超过3小时。 复合物具有8.8％的API，以阿伦膦酸计，和其在室温下盐水中API的溶解度是 7.9微克/mL或0.00079％。

实验例1：在大鼠模型上AC-PC复合物的药物代谢动力学(PK)研究

[0073]在本研究中，在实施例1中制备的具有12.6％API的AC-PC复合 物被肌内注射到A组雌性Sprague-Dawley大鼠(n_A＝12)。雌性大鼠的年龄 大约是4个月。每个大鼠被注射8mg的AC-PC复合物，其包含1mg的API(以 阿仑膦酸计)。通过阿伦膦酸盐在尿中的排泄来研究长期持续释放的药代动力 学分布。以24小时的间隔采集尿样。在尿中分泌的来自AC-PC复合物的阿 伦膦酸盐首先被通过磷酸钙共沉淀来沉淀下来，然后用2，3-二醛基萘 (naphthalenedialdehyde)衍生，并通过装配有荧光检测器的反相高效液相色 谱法(HPLC)来测定。

[0074]在比较实施例1中制备的现有技术活性对照，阿伦膦酸钙，被使用 于本药代动力学研究的B组雌性大鼠中(n_B＝10)。活性对照具有在盐水中404微 克/mL或0.0404％的API溶解度，其与实施例1的AC-PC复合物相比明显更高。 表3概述了在给药实施例1的AC-PC复合物和活性对照后，阿伦膦酸盐的每日 尿排泄，以阿仑膦酸计。

[0075]图2给出了在给药实施例1的AC-PC复合物(蓝色曲线)和现有 技术活性对照(红色曲线)后，大鼠每日尿排泄对应于天数的曲线。图像表明， 根据本发明某些实施方案的复合物与现有技术相比能提供显著更好和更长的持 续释放作用。

表3阿伦膦酸盐的每日大鼠尿排泄

  给药后天数   现有技术 微克/天   本发明 微克/天   0   1   3   5   7   0.1   73.5   17.5   16.7   7.5   0.0   6.7   5.1   4.7   6.5   10   13   16   17   21   23   25   5.5   1.4   0.5   7.4   8.3   7.1   5.8   4.2   30   35   42   49   2.8   1.8   1.3   0.8   56   63   70   0.5   0.3   0.2

[0076]如同在以下表4中概述的，两种产品，本发明的AC-PC复合物和 现有技术(仅AC)被在相同的动物模型(大鼠)中以相同的剂量(每只大鼠1mg) 研究，并表示为相同的总排泄数量。本发明的测试组合物(AC-PC复合物) 显示出显著更好的持续释放作用，如下所述：

(1)初始量：低7倍

[0077]初始量被定义为以总的释放量为基准，在前3天中释放量的百分 率。对于持续释放，小的初始量是被期望的，以减少过度剂量和避免由高初始 量引起的可能副作用的冲击。本发明的某些实施方案在前3天中仅释放药物总 释放量的8％(由大鼠尿排泄测得)。然而，现有技术产品在相同的期间内释放 药物总释放量的55％，即，超过半数的药物被在前3天内释放了。因此，对于 本发明的某些实施方案的初始量与现有技术相比要低7倍。

(2)Cmax：低9倍

[0078]持续释放避免了体内药物的高峰值。峰值被表示为Cmax。好的持 续释放药物应具有低的Cmax，以减少可能的由高Cmax引起的毒性和副作用。本 实施例使用尿排泄来指示持续释放。Cmax相应于最大的每日尿排泄，对于现 有技术其被测量为74微克/天和对于本发明的测试复合物是8微克/天。即， 本发明的某些实施方案具有比现有技术产品低9倍的Cmax。

(3)tmax：延迟13倍

[0079]Cmax出现的时间被定义为tmax。长期持续释放药物也将具有延迟 的tmax。对于现有技术tmax是1天，而对于本发明的测试复合物是13天。即， 本发明的某些实施方案具有比现有技术产品延迟13倍的tmax。

表4持续释放参数的比较

  项目 现有技术  本发明   本发明的优点   模型   给药   大鼠数目 大鼠      大鼠 IM        IM 10        12   剂量，mg   总排泄   总净骨吸收   净骨吸收率％ 1000      1000 230       210 770       790 77％      79％   相同   相同   相同   相同   初始量(前3天)，释放药物   的％   释放药物的C_max(每日排泄)   释放药物的tmax   释放50％API的天数   释放90％API的天数 55％      8％ 74        8 1         13 2.8       16.6 9.0       38.5   低7倍   低9倍   长13倍   时间长6倍   时间长4倍

(4)释放50％药物的天数：长6倍

[0080]持续释放药物的作用可以被表征为释放50％药物所花费的天数，其 被表示为N₅₀。长期持续释放药物将具有更长的N₅₀。对于现有技术N₅₀是2.8 天，和对于本发明的测试组合物是16.6天。因此，本发明的某些实施方案具 有比现有技术产品长6倍的N50。

(5)释放90％药物的天数：长4倍

[0081]药物的持续释放作用还可以被表征为释放90％药物所花费的天数， 其被表示为N₉₀。长期持续释放药物将具有更长的N₉₀。对于现有技术N₉₀是9.0 天，和对于本发明的测试组合物是38.5天。因此，本发明的某些实施方案具 有比现有技术产品长4倍的N₉₀。

实验例2：AC-PC复合物在大鼠模型上的效果研究

[0082]本实验例表明本发明的某些AC-PC复合物的长期持续释放的效 果。在本研究中，AC-PC复合物制剂被肌内注射到雌性Sprague-Dawley大 鼠。在本研究中使用的大鼠经受卵巢切除术(OVX)。在进行外科手术时，雌 性大鼠的年龄大约是2个半月。在切除卵巢/假手术后给予2个半月的恢复时 间，以确保手术后恢复，和在使用AC-PC复合物治疗前建立血雌激素过少和骨 质疏松。

[0083]大鼠被分为3个组：

组A：用低剂量AC-PC复合物治疗，0.25mg(阿仑膦酸)

组B：用高剂量AC-PC复合物治疗，1.0mg(阿仑膦酸)

组C：用安慰剂治疗(盐水)

[0084]治疗药物或安慰剂(盐水)被每2个月注射一次。在0、60和120 天给予三次注射。

[0085]在本实施例中使用的AC-PC复合物具有12.6％的API，和以实施例 1中同样的方式制备。复合物的骨保护作用被测量为骨矿物密度(BMD)的改 变百分率，所述骨矿物密度通过双能X-射线吸收仪(DEXA)在右股骨距近端 4.3mm处的8.6×7.2mm区域内测量。对于所有大鼠在0、7、14、28、35、42、 49、56、90、120、135、150、165和180天测量BMD。获得的数据被概述在表 5和图3中。

表5平均BMP改变，OVX大鼠的右股骨

[0086]对于全部3个大鼠组的AUC_0,180(曲线下面积)被概述在以下表6中。 效果的p值是用安慰剂组(组C)进行评价的。所有的p值都显著的低于0.05， 其证实了通过长期持续释放测试复合物对于骨质疏松的效果。

表6长期持续释放复合物的效果

*负AUC表明随时间推移BMD下降。

实验例3：通过大鼠模型来评价AC-PC复合物的组织耐受性(TT)

[0087]本实施例的目地是评价局部组织耐受性，同时进行AC-PC复合物 组织毒性/反应的目视和显微(组织病理学)检查。

[0088]在肌内注射之后，二膦酸盐能导致组织损伤和刺激。然而，与根 据现有技术的阿伦膦酸钙相比，对于根据本发明某些实施方案的AC-PC复合 物，二膦酸盐的溶解度被降低了100-1000倍。因此，对于AC-PC复合物的 组织耐受性水平可以达到FDA和患者可以接收的相同水平。

(1)研究方法

[0089]按实施例1的方法制备的具有12.6％API的AC-PC复合物被用于 通过大鼠模型来评价组织耐受性。0.9％盐水被用作阴性对照。醋酸甲羟孕酮 (MPA)混悬注射液(150mg/mL)(其是FDA批准的长期释放药物)被用作参考对 照。

[0090]在本研究中总共使用了70只大鼠。35只大鼠，分配为组T，被在 右大腿中肌内(IM)注射0.25mL的AC-PC复合物和在左大腿中肌内注射0.25mL 的0.9％盐水。另外35只大鼠，分配为组R，在右大腿中IM注射0.25mL的MPA (参考对照)。注射前在第0天检查大鼠的常规健康状况。在注射后第1、7、 14、28、56、84和120天进行全部的组织反应评价。在每个上述注射后时间 点，来自各个组(T和R)的5只大鼠被处死。

(2)目视浮肿和红斑检查

[0091]针对任意组织反应例如红斑和浮肿，在治疗位点进行目视检查。浮 肿和红斑计分系统修改自美国药典<88>生物反应试验，体内(Biological Reactivity Tests，in vivo)。

[0092]为评价肉眼可见的浮肿和红斑，使用平均组织反应计分(MTRS)。 MTRS是所有浮肿和红斑计分的平均。在7个评价点的全部3个治疗的MTRS被 列于以下表7中。

[0093]如表7所示，在整个研究期间，AC-PC复合物和参考对照MPA同 阴性对照的观察结果一样，在目视浮肿和红斑评价中确定出很小至没有的组织 刺激。对于AC-PC复合物的目视MTRS计分是0，表明在整个120天的研究期 间就浮肿和红斑来说它是无刺激的药物。

表7平均组织反应计分(MTRS)的概述

计分：0-无，1-轻微，2-明确，3-中度，4-严重

(3)显微组织病理学检测

[0094]显微评价被进行，使用0至4分级系统，其满足ASTM F 981(2004) 和ISO 10993-6：1994(E)准则的生物学相应内容。

[0095]在相同的注射后日期，使用全部5个组织的组织病理学检测计分的 平均值来计算平均组织病理学检测计分(MHES)。在7个评价点的全部3种治疗 的MHES被列于以下表8中。

表8平均组织病理学检测计分的概述*(MHES)

  注射后天数   AC-PC复合物   (T)   盐水   阴性对照   MPA(R)   T和R之间的差   异，T-R   1   8.8   2.8   10.5   -1.7   7   7.4   1.6   8.8   -1.4   14   12.0   0.6   9.6   2.4   28   16.2   0.6   13.6   2.6   56   12.2   0   7.4   4.8   84   7.6   0   8.5   -0.9   120   5.6   0   8.8   -2.1

*结论的等级：无刺激性(0.0-2.9)，轻微刺激性(3.0-8.9)，中等刺 激性(9.0-15.0)，严重刺激性(≥15.1)

[0096]如表8中所示，对于AC-PC复合物的显微组织病理学检测计分非 常类似于参考对照和MPA随时间的计分。因为MHES随时间减少，对应于炎症 反应随时间减少，AC-PC复合物的再吸收是很可能的。

(4)组织耐受性的结论

[0097]总之，根据目视和显微评价，与市售和临床使用的参考对照(MPA) 相比，根据本发明某些实施方案的AC-PC复合物可以对应于可接受程度的组织 耐受性。

[0098]上述给出的实施例和实验仅是用于说明目的，不是意图以任何方式 限制本发明的范围。虽然参考某些典型的实施方案描述了发明，可以理解发明 不被局限到描述的实施方案，因为本领域技术人员公知在不偏离本发明精神和 范围的基础上，如所附权利要求中定义的，可以对描述的实施方案进行许多改 变和修改。