抗草甘膦转基因大豆及其加工品快速检测试剂盒的制备和检测方法

摘要

本发明属于食品和饲料中转基因成分的检测技术，具体地说是用环介导等温扩增方法检测抗草甘膦转基因大豆及其加工品的试剂盒及方法。试剂盒包括环介导等温扩增反应液A、环介导等温扩增反应液B、Bst DNA聚合酶C、显色剂D、阳性对照DNA E；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、甜菜碱、上游内引物A：5′－AGGTGGCACCTACAAATGCCATCGGCAGAGGCATCTTGAAC－3′、下游内引物A：5′－TAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGTCTCAGAAGACCAAAGGGC－3′、上游外引物A：5′－TCCATCTTTGGGACCACTGT－3′、下游外引物A：5′－CGACACTCTCGTCTACTCCA－3′；反应液B含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、甜菜碱、上游内引物B：5′－AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC－3′、下游内引物B：5′－AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG－3′、上游外引物B：5′－CCATGGGCGCCAGGAT－3′、下游外引物B：5′－ATCGGGCGCTTTGTGAG－3′。检测抗草甘膦转基因大豆及其加工品的方法包括样品DNA的提取、花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子和抗草甘膦CP4－EPSPS基因的环介导等温扩增、显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、重复性好、而且成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环介导等温扩增技术进行转基因产品快速检测的方法，具体是一种快速检测抗草甘膦转基因大豆及其加工品的方法。

背景技术

大豆是重要的油料作物和植物蛋白质来源，其蛋白含量丰富，氨基酸组成均衡，富含亚油酸、卵磷脂、维生素E等营养因子，是目前应用最广的食品和饲料原料之一。自1996年开始种植抗草甘磷大豆以来，抗草甘磷大豆以其大大减少田间劳作、降低生产成本、缓解环境恶化的优越性，迅速被广大农民接受，种植面积不断扩大。目前，抗草甘膦大豆已成为国际市场上主要的转基因产品之一，约占转基因植物总面积的40％，其在世界大豆贸易中，占据绝对的主导地位。我国是转基因农产品的主要进口国，每年进口抗草甘磷大豆达1000万吨以上。

在享用转基因技术带来的巨大实惠的同时，转基因产品潜在的生态安全、食品安全问题也日益引起人们关注，各国纷纷制定相应的法律法规对转基因产品进行监管。除美国、加拿大、阿根廷、和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上大多数国家如欧盟各国、匈牙利、瑞士、波兰、日本、韩国等均制定了强制性标识制度。我国于2001年、2002年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，启动了农业转基因生物的监督监管机制。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因作物，应当加以标识，未标识和不按规定标识的，不得进口和销售，因此，必须对转基因产品进行有效的检测。

目前转基因产品的检测，主要采用蛋白检测和DNA检测的方法。两类方法，对于不同产品中转基因成分的检出和定量检测，各有优、缺点。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在产品成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受产品基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样易受加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，主要采用聚合酶链式反应(PCR)，该方法灵敏、特异，但需要昂贵的试剂和仪器。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)技术，是一种新型的体外恒温核酸扩增方法，具有高特异性、高效率和快速灵敏的特点，可以大量扩增所需的靶序列。实验结果可通过使用染料，在日光下肉眼直接判定。该方法只需要极少的试剂费用和一个水浴锅即可完成绝大多数检测过程，是真正普及型的核酸检测方法。

发明内容

本发明的目的是建立一种快速检测抗草甘膦转基因大豆及其加工品的方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些产品检测中的局限性，为转基因产品检测提供有效工具，从而加强转基因产品的监督监管，确保产品标签的一致性，保护消费者的知情权和选择权。

本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10⁹-10¹⁰拷贝。扩增结果可通过荧光染料染色肉眼观察。

本发明涉及的抗草甘膦转基因大豆及其加工品快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下：

(1)环介导等温扩增反应液A

包括10×Bst buffer反应缓冲液、1-2mmol/L dNTP、10-15mmol/L硫酸镁、1-1.5μmol/L上游内引物A、1-1.5μmol/L下游内引物A、0.1-0.4μmol/L上游外引物A、0.1-0.4μmol/L下游外引物A和0.2-0.6mol/L甜菜碱；

其中10×Bst buffer反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

其中上游内引物A的序列为：5′-AGGTGGCACCTACAAATGCCATCGGCAGAGGCATCTTGAAC-3′；下游内引物A的序列为：5′-TAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGTCTCAGAAGACCAAAGGGC-3′；上游外引物A  的序列为：5′-TCCATCTTTGGGACCACTGT-3′；下游外引物A的序列为：5′-CGACACTCTCGTCTACTCCA-3′；

其中上游内引物A、下游内引物A、上游外引物A、下游外引物A体积比为：6∶6∶1∶1；

(2)环介导等温扩增反应液B

包括10×Bstbuffer反应缓冲液、1-2mmol/LdNTP、10-15mmol/L硫酸镁、1-1.5μmol/L上游内引物B、1-1.5μmol/L下游内引物B、0.1-0.4μmol/L上游外引物B、0.1-0.4μmol/L下游外引物B和0.2-0.6mol/L甜菜碱；

其中10×Bst buffer反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

其中上游内引物B的序列为：5’-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3’；下游内引物B的序列为：5’-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3’；上游外引物B的序列为：5’-CCATGGGCGCCAGGAT-3’；下游外引物B的序列为：5’-ATCGGGCGCTTTGTGAG-3’；

其中上游内引物B、下游内引物B、上游外引物B、下游外引物B体积比为：6∶6∶1∶1；

(3)Bst DNA聚合酶C：8U/μL

(4)显色剂D：荧光染料PICO Green

(5)阳性对照DNAE

上面所述环介导等温扩增反应液A和环介导等温扩增反应液B，每管22μL的最佳组成为：10×Bstbuffer反应缓冲液2.5μL、25mmol/L dNTP1.3μL、100mmol/L硫酸镁3uL、2mol/L甜菜碱5μL、10μmol/L上游内引物3μL、10μmol/L下游内引物3μL、10μmol/L上游外引物0.5μL、10μmol/L下游外引物0.5μL、ddH₂O(灭菌双蒸水)3.2μL。

使用上述引物，检测产品中抗草甘膦转基因大豆成分的方法，依次包括下列步骤(1)(3)：

(1)待检样品DNA的提取

DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。

(2)CaMV 35S启动子和CP4-EPSPS基因的环介导等温扩增

A.在装有22μL环介导等温扩增反应液A和环介导等温扩增反应液B的反应管中分别加入1μL BstDNA聚合酶C和2μL待检样品DNA，混匀；

B.于恒温水浴上65℃放置60min；

C.将水浴调到85℃中止反应，5min后取出待检。

(3)显色检测

在待检的每个反应管中加入1μL显色剂D，直接用肉眼观察颜色变化。如果样品的扩增反应液A管和扩增反应液B管颜色均变为红色，说明待检样品不含抗草甘膦转基因大豆成分，如果颜色均变为橙黄色，则说明待检样品含有抗草甘膦转基因大豆成分。

本发明根据花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子和抗草甘膦CP4-EPSPS基因的保守序列，设计了两组特异性引物。两组引物可保证不同转基因产品中花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子和抗草甘膦EPSPS基因的检出。使用该两组引物，采用环介导等温扩增技术，可灵敏、特异地检出CaMV 35S启动子和CP4-EPSPS基因，从而确定待检产品中是否含有抗草甘膦转基因大豆成分。该方法不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料观察即可，简单而快速，特别适用于一些基层单位。

附图说明

图1用环介导等温扩增技术检测某待测豆腐样品DNA，样品的显色反应。

图2用环介导等温扩增技术检测某待测豆芽样品DNA，样品的显色反应。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

按下列配方制作抗草甘膦转基因大豆的环介导等温扩增检测试剂盒：

(1)环介导等温扩增反应液A

10×Bst buffer反应缓冲液2.5μL、25mmol/LdNTP1.3μL、100mmol/L硫酸镁3μL、2mol/L甜菜碱5μL、10μmol/L上游内引物A 3μL、10μmol/L下游内引物A 3μL、10μmol/L上游外引物A 0.5μL、10μmol/L下游外引物A0.5μL、ddH₂O(灭菌双蒸水)3.2μL；

其中上游内引物A的序列为：5′-AGGTGGCACCTACAAATGCCATCGGCAGAGGCATCTTGAAC-3′；下游内引物A的序列为：5′-TAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGTCTCAGAAGACCAAAGGGC-3′；上游外引物A  的序列为：5′-TCCATCTTTGGGACCACTGT-3′；下游外引物A  的序列为：5′-CGACACTCTCGTCTACTCCA-3′；

其中上游内引物A、下游内引物A、上游外引物A、下游外引物A体积比为：6∶6∶1∶1；

(2)环介导等温扩增反应液B

10×Bst buffer反应缓冲液2.5μL、10mmol/LdNTP1.3μL、100mmol/L硫酸镁3μL、2mol/L甜菜碱5μL、20μmol/L上游内引物B 3μL、20μmol/L下游内引物B 3μL、20μmol/L上游外引物B 0.5μL、20μmol/L下游外引物B 0.5μL、ddH₂O(灭菌双蒸水)3.2μL；

其中上游内引物B的序列为：5’-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3’；下游内引物B的序列为：5’-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3’；上游外引物B的序列为：5’-CCATGGGCGCCAGGAT-3’；下游外引物B的序列为：5’-ATCGGGCGCTTTGTGAG-3’；

其中上游内引物B、下游内引物B、上游外引物B、下游外引物B体积比为：6∶6∶1∶1；

(3)Bst DNA聚合酶C：8U/μL

(4)显色剂D：荧光染料PICO Green

(5)阳性对照DNAE

按照以下程序进行检测：

(1)待测豆腐样品DNA的提取

A.称取0.1g豆腐，剪碎，转至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65℃水浴保温10min；

B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；

C.12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置10min后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；

D.在沉淀中加入60μL RNA酶，37℃放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；

E.取出离心柱，将离心柱放置在1个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min；

F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；

G.在离心柱中加入200L70％乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；

H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；

I.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37℃放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。

(2)待测豆腐样品DNA的环介导等温扩增

A.在装有22μL环介导等温扩增反应液A和环介导等温扩增反应液B的反应管中分别加入1μL BstDNA聚合酶C和2μL待检样品DNA，混匀；

B.于恒温水浴上65℃放置60min；

C.将水浴调到85℃中止反应，5min后取出待检。

(3)显色检测

样品的扩增反应液A管和扩增反应液B管颜色均变为橙黄色，见图1。阴性对照和阳性对照结果均正常，据此可判定该样品检出花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子和抗草甘膦CP4-EPSPS基因，样品中含有抗草甘膦转基因大豆成分。

实施例2

按下列配方制作抗草甘膦转基因大豆的环介导等温扩增检测试剂盒：

(1)环介导等温扩增反应液A

10×Bst buffer反应缓冲液2.5μL、25mmol/LdNTP1.3μL、100mmol/L硫酸镁3μL、2mol/L甜菜碱5μL、10μmol/L上游内引物A 3μL、10μmol/L下游内引物A 3μL、10umol/L上游外引物A 0.5μL、10μmol/L下游外引物A0.5μL、ddH₂O(灭菌双蒸水)3.2μL；

其中上游内引物A的序列为：5′-AGGTGGCACCTACAAATGCCATCGGCAGAGGCATCTTGAAC-3′；下游内引物A的序列为：5′-TAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGTCTCAGAAGACCAAAGGGC-3′；上游外引物A  的序列为：5′-TCCATCTTTGGGACCACTGT-3′；下游外引物A的序列为：5′-CGACACTCTCGTCTACTCCA-3′；

其中上游内引物A、下游内引物A、上游外引物A、下游外引物A体积比为：6∶6∶1∶1；

(2)环介导等温扩增反应液B

10×Bstbuffer反应缓冲液2.5μL、10mmol/LdNTP1.3μL、100mmol/L硫酸镁3μL、2mol/L甜菜碱5μL、20μmol/L上游内引物B 3μL、20μmol/L下游内引物B 3μL、20μmol/L上游外引物B 0.5μL、20μmol/L下游外引物B 0.5μL、ddH₂O(灭菌双蒸水)3.2μL；

其中上游内引物B的序列为：5’-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3’；下游内引物B的序列为：5’-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3’；上游外引物B的序列为：5’-CCATGGGCGCCAGGAT-3’；下游外引物B的序列为：5’-ATCGGGCGCTTTGTGAG-3’；

其中上游内引物B、下游内引物B、上游外引物B、下游外引物B体积比为：6∶6∶1∶1；

(3)Bst DNA聚合酶C：8U/μL

(4)显色剂D：荧光染料PICO Green

(5)阳性对照DNAE

按照以下程序进行检测：

(1)待测豆芽样品DNA的提取

A.称取0.1g豆芽，剪碎，转至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65℃水浴保温10min；

B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；

C.12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置10min后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；

D.在沉淀中加入60μL RNA酶，37℃放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；

E.取出离心柱，将离心柱放置在1个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min；

F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；

G.在离心柱中加入200μL70％乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；

H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；

I.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37℃放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。

(2)待测豆芽样品DNA的环介导等温扩增

A.在装有22μL环介导等温扩增反应液A和环介导等温扩增反应液B的反应管中分别加入1μL BstDNA聚合酶C和2μL待检样品DNA，混匀；

B于恒温水浴上65℃放置60min；

C.将水浴调到85℃中止反应，5min后取出待检。

(3)显色检测

样品的扩增反应液A管和扩增反应液B管颜色均变为橙黄色，见图2。阴性对照和阳性对照结果均正常，据此可判定该样品检出花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子和抗草甘膦CP4-EPSPS基因，样品中含有抗草甘膦转基因大豆成分。

核苷酸序列表

<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>抗草甘膦转基因大豆及其加工品快速检测试剂盒的制备和检测方法

<160>8

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim bind

<222>(1)…(41)

<400>1

aggtggcacctacaaatgccatcggcagaggcatcttgaac    41

<210>2

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(42)

<400>2

tagctgggcaatggaatccgaggtctcagaagaccaaagggc    42

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(20)

<400>3

tccatctttgggaccactgt    20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(20)

<400>4

cgacactctcgtctactcca    20

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(38)

<400>1

aatcgagcggcgcctcaggccgtaaggaaggcgacacc    38

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(33)

<400>1

aatgccgccacgggctcgtcgccgatgaaggtg    33

<210>7

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(16)

<400>1

ccatgggcgccaggat    16

<210>8

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)…(17)

<400>1

atcgggcgctttgtgag    17