HNF4α诱导分化治疗人体恶性实体瘤

摘要

本发明涉及HNF4α诱导分化治疗人体恶性实体瘤。具体地，本发明涉及利用肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor－4α，HNF4α)诱导人体恶性实体瘤细胞发生分化，从而应用于恶性实体肿瘤治疗的方法和用途。本发明的研究表明，通过调控恶性实体肿瘤细胞HNF4α基因表达，可有效地对肿瘤细胞的产生诱导分化作用，从而提供了一种肿瘤诱导分化治疗的新手段。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、细胞生物学以及医学领域。具体地，本发明涉及利用肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor-4α，HNF4α)诱导人体恶性实体瘤细胞发生分化，从而应用于实体肿瘤治疗的方法和用途。

背景技术

肿瘤诱导分化治疗(differentiation therapy)是近20年来肿瘤临床治疗方面的重要突破。诱导分化治疗是通过诱导分化方法促进肿瘤细胞向成熟阶段分化，恢复正常的细胞表型和功能并抑制恶性肿瘤细胞的增殖。诱导分化治疗打破了肿瘤发展不可逆的传统认识，有力的推动了整个癌症研究领域的发展。

我国学者曾率先运用全反式维甲酸诱导分化治疗急性早幼粒细胞性白血病，取得了较好的疗效。然而，尽管白血病的分化治疗取得了很大进展，但恶性实体瘤的分化治疗仍然是肿瘤治疗研究领域的难题。迄今为止，对于诸如肝癌、胃癌、肠癌、肾癌以及胰腺癌等人体恶性实体肿瘤的诱导分化治疗仍未见明确报道。迄今实验表明，全反式维甲酸对恶性实体瘤的分化无明显作用。

选择合适的药物或相关物质进行特异性靶向调控是肿瘤诱导分化治疗的难点。有研究利用药物或蛋白体外调控实体肿瘤的分化状态，但效果有限。体内实验大多提示：上述方法在诱导肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤组织坏死方面有一定的作用，但是很难实现显著调控或逆转实体瘤低分化程度。

在众多候选物质中筛选出有效的诱导肿瘤分化的试剂是非常困难的，也是收效甚微的。因此，选择出与肿瘤细胞诱导分化密切相关的关键蛋白、分子和基因进行特异性靶向调控是肿瘤诱导分化治疗的核心问题之一。

近年来，随着人类基因组计划研究的不断深入，为人们利用基因技术手段调控甚至改变细胞重要基因的表达以改变其表型、分化状态和生物学功能创造了条件。然而，虽然已经证实有一些物质或基因在体外实验中可改善肿瘤细胞的某些生物性特性(如增殖及克隆形成能力降低、部分正常细胞功能基因表达上调)，一些物质甚至证实了可降低癌细胞在动物体内的成瘤作用，但是往往发现这些物质对正常细胞也有影响(副作用)，并不能特异性地在体内诱导实体肿瘤发生分化。本发明人曾研究了全反式维甲酸、生长抑素、肿瘤坏死因子以及三氧化二砷等物质体外对肝癌细胞株分化的调控作用，均未筛选出有明确分化治疗作用的药物或蛋白，同时体内研究也发现这些物质不能有效地诱导实体肿瘤发生分化。

因此，本领域迫切需要开发与恶性实体瘤细胞诱导分化密切相关的特定蛋白或基因，能够作为特异性调控的靶标，从而有效地诱导分化实体瘤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与恶性实体瘤细胞诱导分化密切相关的特定的基因-HNF4α基因及其编码产物HNF4α蛋白，以及HNF4α基因/蛋白在诱导分化实体瘤中的用途。

本发明的另一个目的在于提供一种通过HNF4α基因/蛋白分化诱导恶性实体瘤从而治疗肿瘤的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种肝细胞核因子4α(Hepatocyte NuclearFactor-4α，HNF4α)基因和/或蛋白的用途，它们被用于制备诱导恶性实体瘤细胞分化的诱导分化试剂或组合物。

在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物含有(a)HNF4α蛋白、HNF4α编码序列或含所述编码序列的表达载体以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体和非病毒载体。较佳地，所述的非病毒载体为脂质体。

在另一优选例中，所述的实体瘤选自：肝癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌或生殖腺肿瘤。

在另一优选例中，所述的药物组合物还用于体内抑制实体瘤的形成。

在另一优选例中，所述的肝细胞核因子4α是人的肝细胞核因子4α。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有化疗剂。

在本发明的第二方面，提供了一种诱导或促进哺乳动物中实体瘤分化的方法，它包括步骤：给需要治疗的哺乳动物对象施用肝细胞核因子4α蛋白、其编码序列或含所述编码序列的表达载体。

在另一优选例中，所述的哺乳动物是人。

附图说明

图1.RT-PCR检测人肝肿瘤细胞株HNF4α基因和肝细胞相关功能基因的表达。

图2.RT-PCR获得HNF4α cDNA片段。

图3.体外连接获得穿梭质粒pAdTrack-CMV-HNF4α Bgl II和EcoRV酶切鉴定。

图4.Pac I酶切鉴定重组腺病毒质粒pAdHNF4α。

图5.酶切鉴定重组腺病毒质粒pAdHNF4α。

图6.AdHNF4α分别感染HepG2(A、B)和Hep3B(C、D)细胞3天后GFP表达。

图7.AdHNF4α感染肝肿瘤细胞3天后Western blot检测HNF4α蛋白表达。

图8.AdHNF4α感染肝肿瘤细胞3天后HNF4α蛋白表达定量分析。

图9.检测人肝肿瘤细胞株HNF4α基因和肝细胞相关功能基因mRNA表达定量分析

图10.AdHNF4α感染肝肿瘤细胞3天后氨代谢检测。

图11和图12.AdHNF4α感染肝肿瘤细胞后CD133表达测定。

图13和图14.外源导入HNF4α对人肝肿瘤细胞克隆形成的影响。

图15.AdHNF4α感染肝肿瘤细胞后ICG吸收染色测定。

图16.AdHNF4α感染肝肿瘤细胞后体内接种成瘤实验。

图17.HNF4α基因诱导分化治疗实验性肝肿瘤模型。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了一种可有效地在体内诱导或促进恶性实体瘤向正常细胞分化的关键基因/蛋白即HNF4α基因/蛋白。实验表明，HNF4α不仅对肿瘤细胞凋亡有影响，更可对实体瘤细胞的分化产生诱导或促进作用(细胞形态变化、肝细胞相关功能基因表达明显上调及体内对肿瘤的预防、干预和治疗作用)。因此HNF4α作为首次被证实的可有效地在体内诱导或促进恶性实体瘤向正常细胞分化的关键基因/蛋白，具有潜在的应用前景。本发明人在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“基因/蛋白”指基因和/或蛋白。

如本文所用，术语“HNF4α蛋白”、“HNF4α多肽”、“本发明多肽”、“本发明蛋白”可互换使用，都指肝细胞核因子4α(Hepatocyte NuclearFactor-4α)蛋白。它们可包括含有或不含起始甲硫氨酸(Met)的HNF4α。狭义上，所述术语指人的HNF4α；广义上，所述术语不仅包括人的HNF4α，还包括其他哺乳动物的HNF4α，尤其是灵长类动物的HNF4α，如猿或猴的HNF4α。该术语还包括HNF4α蛋白的活性片段、活性衍生物和类似物。

本发明多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然HNF4α蛋白(如人HNF4α)相同的生物学功能或活性的多肽。这些多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

例如，在本发明中，术语“人HNF4α多肽”指具有野生型HNF4α序列的多肽。该术语还包括具有与人HNF4α蛋白相同的诱导实体瘤分化功能的、野生型序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。同样，该术语还包括人HNF4α蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明还包括人HNF4α蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人HNF4α多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人HNF4α蛋白保守性变异多肽”指与野生型氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

  最初的残基  代表性的取代  优选的取代  Ala(A)  Val；Leu；Ile  Val  Arg(R)  Lys；Gln；Asn  Lys  Asn(N)  Gln；His；Lys；Arg  Gln  Asp(D)  Glu  Glu  Cys(C)  Ser  Ser  Gln(Q)  Asn  Asn  Glu(E)  Asp  Asp  Gly(G)  Pro；Ala  Ala  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg  Arg  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe  Leu  Leu(L)  Ile；Val；Met；Ala；Phe  Ile  Lys(K)  Arg；Gln；Asn  Arg  Met(M)  Leu；Phe；Ile  Leu  Phe(F)  Leu；Val；Ile；Ala；Tyr  Leu

  Pro(P)  Ala Ala  Ser(S)  Thr Thr  Thr(T)  Ser Ser  Trp(W)  Tyr；Phe Tyr  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser Phe  Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

如本文所用，术语“HNF4α基因”或“本发明基因”可互换使用，都指编码HNF4α蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与野生型编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有野生型氨基酸序列的蛋白质，但与野生型编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，只要这些多核苷酸变异体编码与本发明上述的HNF4α多肽或其的活性片段、活性类似物和活性衍生物。

在本发明中，人HNF4α核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据人HNF4α的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明也涉及包含HNF4α编码序列的载体(尤其是病毒载体)，以及用本发明的载体或HNF4α编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用HNF4α多核苷酸序列可用来表达或生产重组的HNF4α多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用编码人HNF4α多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人HNF4α多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人HNF4α编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母；动物细胞如CHO、COS、293细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，可用CaCl₂法或电穿孔方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达HNF4α多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

重组的HNF4α多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的HNF4α多肽可直接做为诱导分化试剂诱导或促进恶性实体瘤发生分化。此外，编码HNF4α蛋白的多核苷酸或携带HNF4α编码序列的载体也可用于诱导或促进实体瘤分化。

将多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达野生型的HNF4α蛋白，以增加实体瘤中HNF4α蛋白的数量和活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将HNF4α基因转移至细胞内。构建携带HNF4α基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人HNF4α基因可包装到脂质体中，然后再转入细胞内。

本发明HNF4α蛋白、HNF4α多核苷酸及载体，当施用(给药)于哺乳动物对象(如人)时，可诱导或促进恶性实体瘤发生分化。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质(包括水性载体介质)，形成药物组合物。水性载体介质的pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于诱导实体瘤的分化(治疗)，代表性的例子包括(但并不限于)：肝癌、胃癌、肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌及生殖腺肿瘤等。在使用本发明HNF4α基因/蛋白或药物组合物时，还可同时或辅助使用其他治疗剂，如顺铂、TNF等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量(如0.0001-90wt％)的本发明HNF4α蛋白、HNF4α多核苷酸或载体以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明药物组合物中还可含有其他治疗剂，如化疗药物。

使用药物组合物时，是将安全有效量的HNF4α蛋白、HNF4α多核苷酸或载体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还提供了一种诱导和/或促进恶性实体瘤分化的方法，该方法包括给需要的哺乳动物对象(如人)施用本发明的HNF4α蛋白、HNF4α多核苷酸或载体，从而在该对象体内诱导和/或促进实体瘤分化。

本发明还提供了一种肿瘤细胞(尤其是恶性实体瘤)基因治疗的方法，它包括将HNF4α基因导入肿瘤细胞，使之表达，其中所述将HNF4α基因导入肿瘤细胞的方法包括用质粒转染、腺病毒或腺相关病毒介导。

本发明的主要优点在于：

(a)利用多种基因工程技术方法研究并首次证实了恶性实体瘤的分化治疗。

(b)筛选并证实重要转录因子HNF4α对恶性实体瘤分化的调控作用。

(c)在体内外证实恶性实体瘤分化治疗的可行性及其对临床研究的潜在意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

RT-PCR检测人肝肿瘤细胞株HNF4α基因以及肝细胞相关功能基因的表达

1.将市售的常规肝肿瘤细胞株Huh-7、Hep3B、HepG2均以8×10⁵/皿接种于六孔板，以含10％胎牛血清的新鲜培养液培养，第二天抽提细胞RNA，分光光度计测定OD₂₆₀值，配成工作浓度(1μg/μl及0.1μg/μl)，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

2.RT-PCR：取4μg RNA、2μl随机引物、DEPC水加至33μl于70℃置5min、0℃置5min后，加入10μl 5×Buffer、3μl dNTP、2μlRNA逆转录酶和2μl RNA酶抑制剂混匀后，37℃置1.5h，即可得到逆转录产物。将逆转录产物稀释后取1μl为模版进行PCR扩增，检测的基因引物序列、反应条件、和反应体系见表2和3。各组RT-PCR产物于1.5％琼脂糖胶电泳鉴定、扫描图象后，用市售的Multy-Analasyst图象分析软件进行光密度扫描并测序分析。

表2 反应体系人引物序列以及反应条件

表3 人引物序列以及反应条件

肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α)；葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-P)；白蛋白(albumin，ALB)；谷胺酰氨合成酶(glutamine synthetase，GS)；细胞色素P450家族1a2(cytochromeP450 1a2，CYP1a2)；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)；甲状腺激素结合蛋白(transthyretin，TTR)；甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)；载脂蛋白CIII(apolipoprotein cIII，APOCIII)

结果表明：肝肿瘤细胞株Huh-7、Hep3B以及HepG2的HNF4α表达均明显下调，HNF4α基因的表达与肝细胞相关的重要功能基因表达呈正相关(图1和图9)。

实施例2

构建表达HNF4α的重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α

1.获取HNF4α 1425bp cDNA片段：根据人HNF4α cDNA序列设计、合成引物。正义引物(在5′端加入Bgl II酶切位点)：5′-CCG AGA TCT AGA ATGCGA CTC TCC AAA ACC-3′(SEQ ID NO：21)。反义引物(在5′端加入EcoR V酶切位点)：5′-CGC GAT ATC GGC TTG CTA GAT AAC TTC CTG CT-3′(SEQID NO：22)。

PCR扩增HNF4α cDNA片段，产物1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定片段大小，并割胶回收置入Eppendorf管内，称取胶重量。Eppendorf管中加入NT液200ml/100mg胶，50℃ 5-10min至胶熔化，将液体过柱，13,000rpm离心1min，加入600μl NT3缓冲液，13,000rpm离心2min。30μl双蒸水过柱洗脱DNA片段，静放1min，13,000rpm离心1min，小心移取洗脱液于干净的Eppendorf管内。分光光度计测定OD₂₆₀值，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小(图2)。

反应条件：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，35个循环。

2.构建表达HNF4α的腺病毒质粒pAdHNF4α：EcoRV、Bgl II酶切穿梭质粒pAdTrack-CMV(购自霍华德-休斯医学研究所，美国)和HNF4α cDNA 4h后并纯化，取0.1μg质粒pAdTrack-CMV、0.4μg HNF4α cDNA、10×T₄缓冲液2μl、T₄ DNA连接酶1μl(2U)以及ddH₂O，总体积20μl，16℃连接过夜。将连接产物加入常规的感受态大肠杆菌DH5α转化，用含卡那霉素的LB培养基平皿铺板，37℃恒温过夜，选择单菌落克隆，将扩增出HNF4α cDNA片段的菌落克隆用Qiagen-tip 100试剂盒中抽，获取质粒pAdTrack-CMV-HNF4α并鉴定(图3)。Pme I内切酶酶切线性化pAdTrack-CMV-HNF4α，分别取0.4μg线性pAdTrack-CMV-HNF4α和0.1μg超螺旋pAdEasy-1质粒2,000V、200Ohms、25μFD电穿孔共转化20μl感受态BJ5183细菌，卡那霉素LB培养基平板筛选，选择病毒质粒pAdHNF4α鉴定(图4和图5)。

3.包装、扩增腺病毒AdHNF4α：复苏常规的293细胞，以4.8×10⁶/皿接种于10-cm的组织培养皿，加入DMEM 37℃、5％CO₂培养，24h后细胞密度生长至60％～80％。Pac I酶切线性化pAdHNF4α，与不含血清的DMEM培液250μl混匀，配成A液；取Lipofectamin 20μl，加入不含血清的DMEM培液250μl混匀，配成B液，A液与B液充分混匀，室温放置30min后加入待转染的293细胞中，4h后更换培液。7d后收集293细胞以及上清，于液氮和37℃水浴中反复冻融4次，5,000rpm离心5min，收集病毒上清，病毒上清再次感染293细胞进行扩增，2～3d后收集病毒；重复感染、收集步骤，将最终收集的病毒上清分装，测定病毒上清滴度，最终得到滴度约为1×10¹⁰efu/ml的AdHNF4α，置于-80℃保存备用。

实施例3

RT-PCR和Western blot检测AdHNF4α感染人肝肿瘤细胞株后HNF4α的表达

1.人肝肿瘤细胞株HepG2和Hep3B均以5×10⁵/皿接种于六孔板，将病毒AdHNF4α分别以MOI 40、100感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜DMEM培液，3d后观察GFP表达(图6)。以Trizol试剂盒抽提总RNA，逆转录反应2h，取1μl稀释的逆转录产物为模板进行HNF4α PCR扩增，反应条件同前，同时以β-actin在相同反应条件进行PCR反应作为内参照，反应体系如下。

反应条件为95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，27个循环。

RT-PCR产物于1.5％琼脂糖胶电泳鉴定、扫描图象后，用Multy-Analasyst图象分析软件进行光密度扫描并测序分析。

结果表明：AdHNF4α感染人肝肿瘤细胞株后HNF4α mRNA在肿瘤细胞中表达明显上调(图7和8)。

2.AdHNF4α分别感染HepG2和Hep3B，细胞裂解液收取全细胞蛋白，蛋白标准定量后，各取10μg于10％ SDS-PAGE电泳分离蛋白，将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)ddH2O冲洗，将电泳胶、PVDF膜、滤纸放于转移缓冲液(TransferringBuffer)中平衡后，置于电转移槽中，18V，40min。用5％ BSA/PBST 20ml室温封闭膜2h后，HNF4α多抗(1∶500)4℃孵育过夜，次日PBST洗涤后，与驴抗羊荧光二抗(1∶2000)室温孵育30min，PBST洗涤2次后，经Odyssey红外激光成像系统检测荧光并进行灰度扫描。

结果显示，AdHNF4α感染人肝肿瘤细胞株后HNF4α蛋白表达分别增加约3.4倍(HepG2)和5.2倍(Hep3B)(图7，8)。

实施例4

外源导入HNF4α对人肝肿瘤细胞生物学特性影响

1.RT-PCR检测肝细胞相关功能基因的表达：将常规的人肝肿瘤细胞株HepG2和Hep3B均以5×10⁵/皿接种于六孔板，将病毒AdHNF4α分别以MOI 40、100感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜DMEM培液，3d后观察GFP表达；以Trizol试剂盒抽提总RNA，逆转录反应2h，取1μl稀释的逆转录产物为模板进行PCR扩增，检测的基因引物序列以及反应条件同实施例1，反应体系如下。

各组RT-PCR产物于1.5％琼脂糖胶电泳鉴定、扫描图象后，用Multy-Analasyst图象分析软件进行光密度扫描并测序分析。

结果表明：AdHNF4α感染组中肝细胞相关功能基因表达较对照组明显上调，其中G-6-P mRNA表达上调近50倍；ALB、TTR表达未见明显变化，AFP表达则明显下调(表3-1)。

表3-1 半定量分析HNF4α基因导入后肝细胞相关功能基因表达

2.流式细胞仪测定人肝肿瘤细胞凋亡率：将常规的肝癌细胞株HepG2和Hep3B均以5×10⁵/皿接种于六孔板，分别将病毒AdHNF4α以MOI 40、100感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜DMEM培液，第3天收集细胞，于EPICS XL流式细胞仪(Coulter)测定细胞凋亡率并进行统计学分析。各组复设2盘，重复3次。

结果表明：上调肝肿瘤细胞HNF4α表达后细胞的凋亡率有一定影响。

3.流式细胞仪测定人肝肿瘤细胞细胞周期变化：将肝癌细胞株HepG2和Hep3B均以5×10⁵/皿接种于六孔板，分别将病毒AdHNF4α以MOI 40、100感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜DMEM培液，第3天收集细胞，于EPICS XL流式细胞仪(Coulter)测定细胞周期变化并进行统计学分析。

结果表明：在病毒感染后72h、96h，HepG2表现为S期减少。

4.用常规试剂盒检测细胞上清的氨浓度。

结果表明，与对照组(不加病毒或空病毒)相比，试验组的氨代谢能力明显增强(图10)。

实施例5

外源导入HNF4α对人实体肿瘤细胞增殖的影响

人肝肿瘤细胞株、胃癌细胞株和结肠癌细胞株分别以5×10³/孔接种于96孔板，24h后感染病毒AdHNF4α，此后每天用CCK8试剂检测450nm波长的吸光度以判断有活性细胞的数量。

结果表明：HNF4α表达对实体肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用，最早从感染病毒后第3天，AdHNF4α感染组肿瘤细胞的增殖开始下降，至第5天细胞数量明显减少，抑制率高达50％-68％。同时研究发现，随着病毒感染滴度的增高，HNF4α上调对部分实体肿瘤细胞增殖抑制作用表现为时间和剂量的依赖性。

实施例6

外源导入HNF4α对人肝肿瘤细胞CD133表达的影响

将人肝肿瘤细胞HepG2和Hep3B均以5×10⁵/皿接种于六孔板，分别将病毒AdHNF4α以MOI 40、100感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜DMEM培液，第3天收集细胞，CD133/1-PE(Miltenyi Biotec，Aubum，CA)作为一抗孵育，流式细胞仪CD133+细胞的比例。

结果表明，AdHNF4α感染后肝肿瘤细胞中CD133+的细胞比例明显减少(图11和图12)。

CD133+是肿瘤干细胞的特异性标志物，CD133+的细胞比例明显减少表明AdHNF4α促进诱导肿瘤干细胞发生分化，比例明显下降。另外，未对全反式维甲酸或三氧化二砷对肿瘤干细胞的有明显诱导分化作用(数据未示出)。

实施例7

外源导入HNF4α对人实体肿瘤细胞克隆形成的影响

人肝肿瘤细胞株、胃癌细胞株和结肠癌细胞株分别以2×10⁵接种于35mm培养皿，病毒AdHNF4α感染24h后，各取8×10³细胞接种于10cm培养皿，每3天换液，培养3-4周，直至可见明显克隆，4％PFA固定，结晶紫染色，计数克隆。

结果表明，AdHNF4α感染后人实体肿瘤细胞株形成的克隆均较对照组减少，HNF4α上调可明显降低实体肿瘤细胞株的克隆形成能力(图13和14)。

实施例8

外源导入HNF4α对人肝肿瘤细胞衰老相关的β-gal染色

将Hep3B和HepG2分别以2×10⁵接种于六孔板，分别于感染后72h、96h，4％ PFA固定细胞，然后用新配置的衰老相关的β-gal溶液染色，37℃，4～6h，PBS洗涤，光学显微镜下拍照。溶液配方：1mg/ml5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside(X-Gal)，40mM citricacid/sodium phosphate(pH 6.0)，5mM K₄Fe(CN)₆(亚铁氰化钾)，5mMK₃Fe(CN)₆(铁氰化钾)，150mM NaCl，and 2mM MgCl₂。

结果表明：HNF4α基因导入后，在HepG2细胞中β-gal染色阳性的细胞较对照组明显增多，提示上调HNF4α对部分肝肿瘤细胞的抑制作用是通过诱导衰老来实现的(图15)。

实施例9

上调人肝肿瘤细胞株HepG2和Hep3B中HNF4α表达对体内成瘤的影响

分别取AdHNF4α感染24h后的Hep3B 5×10⁶和HepG2 1×10⁷接种于裸鼠腋下，观察体内成瘤情况，同时用游标卡尺测量新生肿瘤的大小。

结果表明Hep3B对照组早在接种后第2周检测出肿瘤生长，第3周所有裸鼠均有肿瘤生成；HepG2对照组在接种后第3周检测出肿瘤生长，到第5周75％的裸鼠均有肿瘤生成。在观察的5周中，AdHNF4α感染后的肝肿瘤细胞接种的裸鼠体内没有明确的肿瘤生成(图16和17)。

实施例10

HNF4α基因诱导分化治疗实验性肝肿瘤模型(1)

5×10⁶Hep3B重悬于200ul的无血清的MEM中，通过脾脏注射裸鼠体内，同时于细胞注射后0d和2d，将5×10⁹pfu的AdHNF4α通过尾静脉注射导入动物体内。8周后处死裸鼠，取出肝脏，冰冻切片并作HE染色和病理分析。

结果表明：病毒通过尾静脉注射3天后，取出肝脏，冰冻切片，荧光显微镜下观察80％肝细胞有GFP表达。8周后，对照组肝脏中均发现明显肿瘤生长，HNF4α基因治疗组中有2只裸鼠无肿瘤生长，一只仅出现较小肿瘤。进一步HE染色分析，HNF4α基因治疗组中2只肉眼无肿瘤的裸鼠肝脏HE染色为正常的肝脏组织结构，对照组均可见恶性细胞。

实施例11

HNF4α基因诱导分化治疗实验性肝肿瘤模型(2)

利用颈部皮下接种肝癌细胞株构建形成实验性肝肿瘤裸鼠模型后，将1×10¹⁰pfu的AdHNF4α通过颈静脉注射导入动物体内。

结果显示：病毒注射3天后，荧光显微镜下观察80％以上的肿瘤细胞有GFP表达。治疗1周后，定期测定肿瘤大小，HNF4α基因治疗组中8只裸鼠肿瘤大小平均值在不同时间节点均显著小于对照组；生存时间比较，HNF4α基因治疗组明显长于对照组。免疫组化结果显示，治疗组肿瘤细胞异型性有明显改变(形态相对规则，胞核小，核畸形及核分裂增多少见)；与凋亡相关的蛋白如Bcl-2、Bax等表达未见明显变化。该结果表明，HNF4α基因/蛋白可有效地在体内诱导或促进实体瘤向正常细胞分化。

实施例12

全反式维甲酸、生长抑素(Somatostatin)、肿瘤坏死因子以及三氧化二砷等对肝癌细胞株HepG2和Hep3B的体外作用

人肝肿瘤细胞株HepG2和Hep3B均以5×10⁵/皿接种于六孔板，分别加入全反式维甲酸、生长抑素、肿瘤坏死因子以及三氧化二砷；以Trizol试剂盒抽提总RNA，逆转录反应2h，取1μl稀释的逆转录产物为模板进行PCR扩增，检测肝细胞相关功能基因mRNA表达，免疫组化测定Cyclin、Bax、Bcl-2等增殖及凋亡相关蛋白表达。

结果表明：各组肝细胞相关功能基因表达未见明显差别，与肿瘤分化相关的部分基因表达(HNF4α、HNF1α、C/EBP)表达未见明显上调，细胞形态学无明显改变；肿瘤坏死因子和三氧化二砷组细胞凋亡明显增多、增殖下调。这提示这些物质对照物质对肝癌细胞没有诱导分化作用(因为细胞形态无变化)。

讨论

肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor，HNF4)是一种细胞核激素受体家族的转录因子，是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白，在分化成熟的肝细胞中高表达，其中HNF4α是HNF4的重要亚型。野生型的人HNF4α序列的登录号为(GeneID：419198)。

对HNF4α基因敲除小鼠研究发现：不同发育阶段的肝细胞中都出现大量功能基因表达下调，这些基因不仅影响肝细胞分化表型，还影响肝细胞中参与脂肪代谢、白蛋白合成以及药物解毒等重要基因表达。HNF4α以二聚体的形式与顺式作用元件结合，当HNF4α的DNA及配体结合域和孕烷X受体α形成二聚体时，其利用锌指DNA结合域识别DNA序列，并可通过乙酰化、磷酸化以及与SMADS 3或4结合调节自身活性，与一些转录激活蛋白如SRC-1、GRIP-1和CBP/p300等相互作用来改变启动子或增强子附近的染色体结构，从而在转录水平实现对分化和功能基因表达的调控。

由于绝大多数物质或基因虽然在体外实验中可改善肿瘤细胞的某些生物性特性或可降低癌细胞在动物体内的成瘤作用，但是几乎都是通过诱导细胞凋亡实现，并不能特异性地在体内诱导实体肿瘤发生分化。因此早先的研究虽认为上调肝癌细胞株HNF4α的表达可改善肿瘤细胞的某些生物性特性，但并不相信也未证实HNF4α居然具有诱导分化恶性实体瘤，进而逆转肿瘤低分化状态的能力；HNF4α对其它恶性实体肿瘤的分化调控作用亦不明确；更未将上调HNF4α表达作为诱导分化治疗手段加以研究。

本发明的创新研究的表明：利用基因工程技术调控实体肿瘤细胞HNF4α基因表达，可有效地对肿瘤细胞的产生诱导分化作用。HNF4α调控众多细胞分化基因和功能基因的表达，如通过上调胚胎干细胞HNF4α表达，可明显增强一些重要功能基因如载脂蛋白、醛缩酶B、苯丙氨酸羟化酶、TFN和视黄醇结合蛋白等表达。

更为重要的是，上调HNF4α表达还可逆转肝癌细胞的去分化状态。因此，这提示，HNF4α可能还在不同类型肿瘤的分化转录调控中发挥重要作用。因此，本发明通过体内HNF4α腺病毒载体注射明确HNF4α表达上调对人体恶性实体瘤动物模型的诱导分化治疗作用，从而提供了一种肿瘤诱导分化治疗的新手段。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>HNF4α诱导分化治疗人体恶性实体瘤

<130>081083

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<170>PatentIn version 3.2

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