用质谱法定量分析源自表面的样品

摘要

掺入内标的衬底有助于通过表面测量质谱技术定量分析样品中的被分析物，而无需湿化学法样品制备。使用者将待分析的样品处理至经预处理的衬底表面。然后载荷样品的固态衬底即可用于测量，所述衬底中掺入待定量的各被分析物的内标。

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及表面测量(surface-interrogating)质谱技术。具体而言， 本发明涉及用这些技术对处理至表面上的样品进行一步定量分析。

背景信息

美国每年至少对4百万婴儿—超过所有新生儿的98％—进行先 天性疾病的测试，未确诊的先天性疾病可能引起智力迟钝、严重疾病 和婴儿早夭。每种特定的代谢病症(例如苯丙酮酸尿症[PKU])、血液 系统病(例如镰状细胞贫血病)和内分泌病(例如甲状腺机能减退)都可 通过测定分别对应于特定病症的被分析物、例如氨基酸、异常血红蛋 白或激素的血液水平是否在预期的正常水平内来诊断。

通常将在医院于出生后48小时内采自婴儿脚后跟的血液样品置 于滤纸卡上。以该方式固定在卡上的“血斑点”在进行样品制备和分 析前稳定并易于管理。一般而言，这些步骤不在采集样品的医院处 理，而是将样品送到州公共卫生机构或其它参与的实验室，以较大批 量来处理。

质谱法很适合该分析，因为其能够同时证明几种独特的被分析物 的量，因此可用于在一次测定中筛选多种疾病。但是，每一次测定都 包括若干制备步骤，每一步都提供由于样品污染或被分析物损失而引 入错误的机会。也就是说，为了通过该方法检测感兴趣的被分析物， 将滤纸卡载荷样品的部分打孔，并置于样品孔中以用溶剂提取血液。 在某些情况下，还将被分析物衍生。此外，为了定量测定所检测的被 分析物，样品制备必须包括将每一被分析物的已知量的内标加入到洗 脱的样品中。

质谱法的最近进展业已促进直接从表面上的样品中对被分析物 的检测，除去了样品制备程序中将所述样品置于溶液中的需要。第一 个开放式质谱技术DESI(电喷雾解吸电离)用例如甲醇或甲醇水溶液 的液态喷雾，将其喷雾到目的样本构成的表面上，以从样本产生离子。 这些离子被吸入质谱仪用于分析。(参见例如Takáts等，“Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization(用电喷雾解吸电离在环境条件下的质谱分析 制样)”Science；2004；36，471-3；和美国专利申请公开第 2005/0230635号。)

在称为DART(实时直接分析)的商业技术中，激发态的核素(亚 稳态的氦或氮分子)与样品中的分子并与大气中的分子例如水反应， 形成吸入到质谱仪的离子。(参见例如Cody等，“Versatile New Ion Source for the Analysis of Materials in Open Air under Ambient Conditions(在环境条件下开放空气中用于物质分析的挥发性新型离 子源)”，Anal.Chem.；2005；77(8)，2297-2302和美国专利申请公开第 2005/0196871号。)

DESI和DART业已用于直接定性测量各种表面，藉此获得各种 分子的高品质质谱。通过这些方法业已成功将包括炸药、化学战模拟 物、氨基酸、肽、蛋白质、药物分子、生物碱、萜类化合物和类固醇 在内的化合物电离。应该注意生物学流液可呈在纸上或其它合适表面 的干斑点形式通过DESI直接分析。(参见例如Takáts等，“Ambient mass spectrometry using desorption electrospray ionization(DESI)： instrumentation，mechanisms and applications in forensics，chemistry， and biology(用电喷雾解吸电离(DESI)的开放式质谱法：在法医学、化 学和生物学中的仪器设备、机理和应用)，”J.Mass Spectrom.；2005； 40：1261-1275)。可在不到1分钟内收集含鉴别干流液例如血液、尿 或血浆等样品组分的几百个峰的DESI谱。

此外，业已提出通过DESI定量测定诊断相关的血液组分—例如 酰基肉碱、胆汁酸、葡萄糖、肌酸酐和胆红素。这样的定量测定可通 过在将同位素标记的内标加到血液样品中再沉积到衬底上来实现。与 现行实践比较，将DESI型技术用于血液筛选将减少制备步骤。然而， 与现行定量血液筛选实践相反，其要求将其余的样品制备湿化学法从 特定分析场所移到医院。将更多的筛选程序责任移到医院，将会在更 多场所和执行者中扩散该方法的复杂性，将更多可变性引入样品制 备，因此，将更大的误差风险引入到分析结果中。

发明概述

本发明提供用于通过表面测量质谱分析技术定量分析样品中的 一种或多种被分析物的方法。所述方法通过掺入内标的新型载荷样品 的固态衬底构造来实现。本发明衬底包含载体材料和各待定量被分析 物的已知量的内标，在将样品沉积到表面之前掺入内标。

依照本发明方法，将待分析的样品沉积到已制备好的衬底上。然 后，对衬底施行表面测量的质谱分析技术，该技术需要将能量转移至 衬底表面，以使各指定的被分析物、样品中的组分和相应的内标电离， 然后在质谱仪中分选离子，测定相对信号强度。用得到的数据，评估 被分析物的存在及其量。质谱技术分选的能力使若干个被分析物得以 在一次运行中定量。大体上，该能力可归纳为一步分析含许多被分析 物的样品。

例如，为了评估婴儿血液中氨基酸和肉碱在诊断上的相应水平， 本发明提供掺入内标的已制备好的衬底，该内标为同位素标记的氨基 酸和肉碱类似物形式。血液样品可在从新生儿采集后立即或采集后不 久在医院实验室沉积到衬底上。然后载荷样品的衬底即可取走用于分 析，无需任何的进一步制备。在分析期间，被分析物和内标一起被电 离，得到的质谱指示被分析物和相应内标的水平。可从这些数据可计 算血液样品中各被分析物的浓度。对于具有最直接诊断的疾病而言， 血液样品可根据未超出或超出单个指示性被分析物的预期正常范围 来判断。对于具有更为复杂的诊断的疾病而言，可关联若干被分析物 的水平。

本发明不限于将血液或甚至生物学流液作为质谱分析种类。更正 确地，本发明方法适合定量分析具有如下相应内标的任何被分析物： 易于加到载体材料中以形成本发明衬底，并然后易于在表面测量过程 中电离的相应内标。

本发明方法也不限于用于电离衬底的感兴趣组分的任何特定技 术。能够电离表面上存在的被分析物的任何技术均可用于产生用于输 入质谱仪的带电荷核素。例如，比在表面测量的方法中已经提到的将 粒子导向衬底更强的是，辐射可能用于解吸被分析物和内标。基质辅 助激光解吸电离(MALDI)是适合本发明的一种这样的方法。(参见例 如美国专利申请公开第2007/0065949号。)

本发明的固态衬底可包括载体材料，例如用于血液筛选中的滤纸 卡(例如市售纸质材料，例如FTA和Schleicher、Schueil 903和CEP 纸以及其他商用“血卡”材料)、玻璃、纺织品、陶瓷、树脂、金属和 非金属—适于接受样品并能够在分析前稳定地保留所选择的内标的 任何材料。

此外，本发明衬底可具有多种物理形态中的任何一种。除了用于 保存血点的熟悉的纸卡之外，实例还包括膜；药签；管形、柱形、滑 片或器皿构成的表面；空心或实心珠；微粒；凝胶；和基质 (matrix)。本文所用“固态衬底”表示与例如液态溶液相对的固相或半 固态的衬底—不涉及衬底的多孔性或藉此包裹的任何孔穴。

本文所用关于衬底和内标的术语“掺入”表示在正常储存条件下 和在暴露于测量手段前的操作下，内标为衬底的稳定组成部分。同样 地，衬底可被阐述为结合或附着内标的载体材料。已制备的衬底可用 允许在测量期间从内标形成合适内标离子的任何物理方式来掺入内 标。

同样地，载荷样品的衬底上的样品可占有位于该表面的明显的体 积，或被部分或完全吸附以便其渗入载体材料。因此，短语“将样品 处理至表面上”指将样品转移至已制备的衬底的方式，不排除从该表 面吸附该样品的衬底。

通过掺入内标构成已制备的衬底，本发明避免了在沉积之前适时 地将内标引入到样品的必要。因此，通过表面测量质谱技术提供的简 单化样品制备不再限于检测被分析物。本发明将该优点扩展到定量分 析。用这样的方法，本发明能够进行快速精确的质谱分析。在健康筛 选情况下，该优点转化为降低假阳性或假阴性诊断的风险。

附图简述

以下本发明说明的附图，其中：

图1A-1D描述具有表面内标涂层的本发明衬底，图1A为俯视平 面图，图1B为本发明已制备的衬底的正面图，图1C和1D为相应的 已制备的载荷用于分析的样品的衬底的视图；

图2A-2B描述具有扩散到载体材料顶层的内标的本发明衬底， 图2A为载荷样品的衬底的俯视平面图，图2B为正面图；

图3A-3B描述具有渗入到衬底一端的载体材料内的内标的本发 明衬底，图3A为载荷样品的衬底的俯视平面图，图3B为相应的正 面图；

图4A-4B描述具有渗入到整个载体材料的内标的本发明衬底， 图4A为载荷样品的衬底的俯视平面图，图4B为相应的正面图；和

图5示意性描述与本发明兼容的表面测量质谱系统。

一般而言，附图中的要素并不是按比例画出。

例示性实施方案详述

已制备的本发明固态衬底包含加入到载体材料的内标。图1表示 例示性实施方案的固态衬底10的具体要素。将具有顶面14的载体材 料平板12通过基本不同的含内标涂层16覆盖。为了用于质谱分析， 将样品沉积到衬底10上以便将所述样品S处理至涂层16上。关于图 2，在另一实施方案中，内标包含在渗入载体材料平板12的浸渍层 26内。为了分析，将样品S处理至在浸渍层26上的载体材料的面14 上。关于图3，在另一实施方案中，内标在一端浸透载体材料平板12 的整个厚度形成浸渍区36。为了分析，将样品S处理至载体材料平 板12的面14上。关于图4，在又一实施方案中，内标浸透平板12 的整个厚度，由此整个载体材料为浸渍体积46。为了分析，将样品S 沉积到平板12的面14上，从该处该样品被吸附到平板12。

衬底10的载体平板12包括：纸、玻璃、纺织品、陶瓷、金属、 或塑料诸如聚苯乙烯、聚乙二醇、二乙烯基苯；异丁烯酸酯、聚异丁 烯酸酯、聚丙烯酰吗啉、聚酰胺、聚(四氟乙烯)、聚乙烯、聚丙烯、 聚(4-甲基丁烯)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚 偏氟乙烯(PVDF)、硅酮、聚甲醛。硅酸盐琼脂糖(silicate agarose)、乙 酸纤维素、硝酸纤维素、棉花、人造纤维，天然塑料也是载体材料的 候选材料。

本发明不限制将内标结合至衬底10的载体材料的方式。所述内 标可在载体材料的所有或部分面上干燥，浸渍或扩散到载体材料的部 分或全部，与载体材料化学结合，或另外经由氢键结合、毛细管力或 表面张力共价或非共价结合至载体材料。通过以下方法可达到让内标 与载体材料结合的目的：例如将内标喷雾到载体材料面上；将载体材 料浸泡于含有内标的溶液中；或通过从包含内标以及形成载体材料 的前体的浆料形成衬底。例如，用于浸透含化学原料的纸的方法为本 领域技术人员所熟知，其如美国专利第6,890,481号中所述。

图4示意性地例示用于表面测量质谱系统的图1-3的衬底10。适 用于本发明的DESI系统40使用常规电喷雾装置41来产生喷雾42。 能够产生由喷雾气体射流载运的液滴流的任何装置可用于形成DESI 喷雾42。

装置40包括喷雾毛细管43，通过该毛细管输送液态溶剂44。喷 雾器毛细管45围绕喷雾毛细管43形成环形空隙，通过该空隙将喷雾 气体46高速输送。氮为喷雾气体46的典型候选物。业已将甲醇水溶 液用作液态溶剂44。

电源47给液态溶剂44施以高电压。快速流动的喷雾气体46和 离开毛细管43的液体44之间的相互作用形成包含液滴的解吸离子化 喷雾42。喷雾42还可包括中性大气分子、雾化气体和气态离子。

将喷雾42导向样品材料S，后者载荷于已制备的掺入内标的衬 底10上。衬底10可在可移动平台上，通过熟知的驱动手段随时间解 吸和电离不同区域的样品S，例如以产生整个衬底表面的光栅。这样 的平台的电压和温度也可通过已知方法来控制。

离子传输线52收集离开衬底10的解吸离子54，并将其导入大 气入口或质谱接口56用于分析。通常在质谱仪里发现的任何大气接 口适合用于DESI型系统。业已发现运转良好的接口包括典型的加热 的毛细管大气接口和经由用金属或绝缘体制成的延长的柔韧离子传 输线取样的大气接口。

关于选择掺入衬底10的内标的注意事项为本领域技术人员所熟 知，所述内标用于通过特定实验设置评估特定被分析物。一般而言， 合适的内标化学上与被分析物相似，此即意味着内标“对应于”被分析 物。此外，内标必须可用质谱法与被分析物分离。最后，内标在化学 上不与被分析物反应，且基本上不含有痕量被分析物。

通常发现被分析物的稳定的同位素标记形式满足这些要求。大量 的已出版参考资料为本领域技术人员选择内标提供指导。(参见例如 Liu等，“Selecting an appropriate isotopic internal standard for gas chromatography/mass spectrometry analysis of drugs of abuse—pentobarbital example(选择合适的同位素内标用于气相色谱/ 质谱分析滥用药物-戊巴比妥实例”，J.Forensic Sci.；Nov.1995； 40(6)：938-9。)可通过在具体离子化条件下对掺入特定衬底的特定内 标的经验测定来预先确定在样品分析期间所检测到的内标的绝对量。 通常内标的量充分高于定量限但不能高至抑制被分析物的离子化。

用本文所述方法可分析多种类型的样品，包括生物学样品、医学 样品、工业样品、农业样品、实验室样品和食物样品。对于生物学和 医学应用而言，样品可包括任何生物学流液、细胞、组织或其流分， 其包括对应于所选择的内标的分子。举例而言，样品可获自对象(例 如哺乳动物诸如人类)或源自这样的对象。例如，样品可为通过活检 获得的组织切片，或位于组织培养物中或适应组织培养的细胞。因 此，例示性样品包括培养的成纤维细胞、经培养的羊水细胞、和绒毛 膜绒毛样品。样品还可为生物学流液样本，例如尿、血液、血浆、血 清、唾液、精液、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液等等。若有需要，可进 一步将样品分级分离为含特定细胞类型的部分。例如，血液样品可分 级分离为血清或包含特定类型的血细胞诸如红血细胞或白血细胞(白 细胞)的部分。若有需要，样品可为来自受试对象的样品的组合，例 如组织和流液样品的组合等等。保持样品中的分子的活性或完整性的 用于获得样品的方法为本领域技术人员所熟知。这样的方法包括用合 适的缓冲剂和/或抑制剂，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶的抑制剂， 其维持或最小化样品中分子的改变。这样的抑制剂包括例如螯合剂， 诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙醚)N，N，N1，N1-四乙酸 (EGTA)；蛋白酶抑制剂，诸如苯甲磺酰氟(PMSF)、抑肽酶、亮肽素、 抗蛋白酶(antipain)等等；和磷酸酶抑制剂，诸如磷酸盐、氟化钠、钒 酸盐等等。分离分子的合适缓冲剂和条件为本领域技术人员所熟知， 且可视例如待鉴定的样品中分子的类型而变化(参见例如，Ausubel 等Current Protocols in Molecular Biology(现行分子生物学方案)(增刊 47)，John Wiley & Sons，New York(1999)；Harlow和Lane， Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Press (1999)；Tietz Textbook of Clinical Chemistry(临床化学Tietz教科书)， 第三版。Burtis和Ashwood，编辑.W.B.Saunders，Philadelphia， (1999))。

本发明很适合新生儿血液筛选，其通常涉及测定超过20种的样 品中的被分析物。表1和2列举通常在新生儿血液化验中检测的被分 析物。对于很多可利用这些被分析物在新生儿血液中的水平诊断的疾 病，业已在文献中报道若干诊断标准。例如，苯丙酮酸尿症可单独通 过苯丙氨酸水平指示(如CDC，U.S.Department of Health和Human Services所报道，“Using Tandem Mass Spectrometry for Metabolic Disease Screening Among Newborns(用串联质谱法在新生儿中筛选代 谢病)，”MMWR_2001年4月13日；Vol.50，No.RR-3；Rashed等， Clinical Chemistry(临床化)学；1997；43(7)：1129-41；和The Wisconsin NBS Laboratory-Wisconsin State Laboratory of Hygiene， “Health Professionals Guide to Newbom Screening(新生儿筛选健康专 业指南)，”于2003年10月28日检索自The Board of Reagents of the University of Wisconsin System网站)。或者，可附加考虑酪氨酸水平 (ACMG/ASHG Test和Technology Transfer Committee Working Group， Tandem Mass Spectrometry in Newborn Screening(新生儿筛选中的串 联质谱法)，Genetics in Medicine；2000年7月/8月；2(4)；和Schulze 等，Pediatrics；2003；111(6)：1399-1406)。第三种方法考虑苯丙氨 酸水平和Phe/Tyr比率(Zytkovicz等，Clinical Chemistry；2001；47 (11)：1945-55)。

业已报道用于诊断称为中链酰基-辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD) 的脂肪酸氧化失调的6种标准，其中没有一种依靠单一指示物。一个 范例是利用C8和C10:1的水平。(ACMG/ASHG Test和Technology Transfer Committee Working Group)。第二个范例附加利用C10和C6 (CDC)水平。第三个范例除了这四种单个水平之外，还考虑C8/C10 比率(Chace等，Clinical Chemistry；2001；47：1166-82)。第四种方 法仅仅考虑C6、C8、C10:1(Rashed等和Zytkovicz等)的水平。第五 种方法考虑C6、C8、C10的单个水平和C8/C2、C8/C10和C8/C12 的比率(Schulze等)。第六种选择C6、C8和C10:1的单个水平和C8/C10 比率(Wisconsin NBS Laboratory)。本发明衬底能够掺入用于所有这几 个被分析物的内标。

表1  在新生儿血液筛选中化验的氨基酸

 

氨基酸      缩写    

 

丙氨酸          Ala             精氨酸          Arg             瓜氨酸          Cit             甘氨酸          Gly             亮氨酸          Leu             甲硫氨酸        Met             鸟氨酸          Om              5-羟脯氨酸    5-Oxo Pro      苯丙氨酸        Phe             酪氨酸          Tyr             缬氨酸          Val             脯氨酸          Pro             

表2.在新生儿血液筛选中化验的肉碱

 

肉碱                        缩写      游离肉碱                    C0        乙酰肉碱                    C2        丙酰肉碱                    C3        丙二酰肉碱                  C3DC      丁酰肉碱                    C4        3-羟基-丁酰肉碱           C4OH      异戊酰肉碱                  C5        甲基巴豆酰肉碱              C5:1    戊二酰肉碱                  C5DC      3-羟基-异戊酰肉碱       C5OH      己酰肉碱                    C6        己二酰肉碱                  C6DC      辛酰肉碱                    C8        辛烯酰肉碱                  C8:1    

 

癸酰肉碱                          C10            癸烯酰肉碱                        C10:1         癸二烯酰肉碱                      C10:2         十二烷酰肉碱                      C12            十二烯酰肉碱                      C12:1         十四烷酰肉碱(肉豆蔻酰肉碱)        C14             十四烯酰肉碱                      C14:1          十四碳二烯酰肉碱                  C14：2          3-羟基-十四烷酰肉碱             C14OH           十六烷酰肉碱(棕榈酰肉碱)          C16            十六烯酰肉碱                      C16:1         3-羟基-十六烷酰肉碱             C16OH           3-羟基-十六烯酰肉碱             C16:1OH        十八烷酰肉碱(硬脂酰肉碱)          C18            十八烯酰肉碱(油酰肉碱)            C18:1         十八碳二烯酰肉碱(亚油酰肉碱)      C18:2         3-羟基-十八烷酰肉碱             C18OH           3-羟基-十八烯酰肉碱             C18:1OH      

因此，应该看到上文描绘了非常有优势的定量表面测量质谱法， 尤其是用于定量血液组分。本文所用术语和表述用作说明术语，并无 限制，无意使用这些术语和表述来排除任何所示和所述的要素或其部 分的等同物，但应该认识到，在本发明权利要求范围内的各种修改都 是可能的。