利用米根霉发酵马铃薯淀粉制备L－乳酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用米根霉发酵马铃薯淀粉制备L－乳酸的方法，包括以下步骤：(1)制备米根霉孢子；(2)将米根霉孢子制备成米根霉孢子乳悬液；(3)将米根霉孢子乳悬液固定到固定化载体上得到固定化米根霉种子；(4)将固定化米根霉种子接种到发酵培养基中进行固定化发酵。本发明方法培育出了高产的米根霉菌株并将其固定到棉布载体上得到固定化米根霉种子，通过所摸索的最适宜的发酵条件进行固定化发酵，马铃薯淀粉转化率高，发酵产物的生物量高，L－乳酸收率高，本发明方法除具有L－乳酸收率高等优点外，还具有成本低廉、步骤简捷、容易掌控等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种有机酸的制备方法，尤其涉及一种利用米根霉发酵马铃薯淀粉制备L-乳酸的方法，属于有机酸的生产领域。

背景技术

乳酸是一种多用途的精细化学品，乳酸、乳酸盐及其衍生物，广泛地应用于食品、医药、化工等领域。由于人体内只具有代谢L-乳酸的酶，D-乳酸不能被人体吸收，并且过量使用对人体有毒。因此，世界卫生组织提倡使用L-乳酸作为食品添加剂和内服药品，取代目前普遍使用的DL-乳酸。聚乳酸(PLA)塑料制品的出现，更是使L-乳酸的发展显示出巨大的市场潜力。

我国乳酸生产与国外先进水平仍有较大差距，乳酸生产规模较小，发酵罐仅30-60吨/台，产酸率较低；产品品种仍以DL-乳酸为主，占80％，产品色度质量不高；另外在后提取方面更有较大差距，总体上生产成本较高。

目前，L-乳酸的生产基本采用微生物发酵法，即根霉法和细菌法。乳酸发酵于本世纪50至60年代在生物化学方面取得了较大的进展，现在正开始着手从遗传工程方面改良乳酸生产菌。根霉属中产L-乳酸的菌种很多，常用的菌种有米根霉、黑根霉、华根霉、行走根霉、小麦曲根霉和美丽根霉。

其中米根霉发酵生产L-乳酸的能力最强，但在实际生产中也受到了发酵周期长、糖转化率低、副产物乙醇及富马酸含量较多等缺点的限制。因此，国内外众多学者对米根霉在发酵工艺的改进、代谢机理的研究及代谢通量分析、高产菌株的选育等方面做了大量的研究。

固定化细胞培养(cell immobilization culture)是指利用物理或化学手段将游离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并可反复使用的一种技术。与传统分批游离发酵相比，利用固定微生物技术具有细胞负荷高、生物催化高效、细胞可反复使用等优点，并可得到高的目标产量和原料转化率，易于实现细胞与产物分离，有利于实现工艺过程的自动化、连续化，降低生产成本，具体表现在：(1)生物反应器中可以获得极高的菌体浓度，因而发酵速率可以大大提高，反应器设备的生产强度得以强化；(2)产物分离纯化过程中菌体从发酵液中分离十分容易；(3)固定化细胞可以重复或长期使用，这样既能够简化游离细胞的过程需要不断培养菌体的操作，又减少了营养物质的浪费，提高了生产率。

尽管固定化技术有一定的优点，能使细胞高度密集，加快反应速度，缩短工作周期，提高工作效率。但目前也还存在一些缺点：如固定化细胞的成本还比较高，固定化过程中及固定化细胞使用时的污染控制比较困难等。另外，由于细胞固定于载体中，从而增加了营养物质、氧、和产物的穿质阻力，特别是好氧发酵时的氧传递问题比较难以解决，所以固定化技术大多只用于细胞分泌型产物的发酵。因此，选择什么样低廉的固定化载体材料、如何优化固定化工艺需要进一步的研究。

米根霉深层发酵生产L-乳酸过程中，菌体形态复杂，多以丝状、片状、球体、团状、絮状、结块等形态生长。米根霉菌体形态强烈的影响着发酵过程中传质、溶氧等性能，对其有效的控制是发酵成功的关键因素之一。迄今为止，尚未见到利用米根霉固态发酵马铃薯淀粉生产L-乳酸的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用米根霉发酵马铃薯淀粉制备L-乳酸的方法，该方法采用固定化发酵方法并摸索出最适宜的发酵条件，具有马铃薯淀粉转化率高、L-乳酸收率高，成本低廉、步骤简捷等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种利用米根霉(Rhizopus oryzae)发酵马铃薯淀粉制备L-乳酸的方法，包括以下步骤：

(1)制备米根霉孢子；(2)将米根霉孢子制备成米根霉孢子乳悬液；(3)将米根霉孢子乳悬液固定到固定化载体上得到固定化米根霉种子；(4)将固定化米根霉种子接种到发酵培养基中进行固定化发酵。

优选的，所述的米根霉孢子的制备方法包括：将米根霉As3.3462划线接种于马铃薯葡萄糖(PDA)斜面培养基，第一天在温度为32℃、相对培养湿度为70％的条件下进行培养；第二天在温度为34℃、相对培养湿度为30％的条件下进行培养；按上述方法接种3-4代活化菌种，待孢子完全覆盖白色菌丝，即得。本发明基于微生物的代谢控制发酵及代谢控制育种理论，以米根霉碳代谢关键酶乳酸脱氢酶(LDH)与乙醇脱氢酶(ADH)为对象，系统地研究LDH及ADH的分离纯化与催化特性，Mn²⁺和Zn²⁺离子及不同通气条件下的米根霉发酵调控模式，优化出了米根霉孢子的最佳的培养条件，从而得到了高产L-乳酸的米根霉菌株；

所述的米根霉孢子乳悬液可参考以下方法制备得到：用无菌水将所制备的米根霉孢子洗脱下来，将洗脱液接种到种子培养基中培养至浓度达10⁶个/ml，即得米根霉孢子乳悬液；其中，所述的种子培养基的组成为：葡萄糖60g/L，尿素2.0g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.08g/L；

步骤(3)中所述的固定化载体优选是棉布；其中，棉布大小优选为1cm×1cm，载体用量选择15mL/50mL培养基；

所述的固定方法可参考以下方法进行：将棉布剪成小块，放入装有种子培养基的瓶中，高温高压灭菌冷却后接种孢子悬液，30℃培养24小时后，菌丝体即固定在棉布载体上；其中，所述的种子培养基的组成为：葡萄糖60g/L，尿素2.0g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.08g/L。

所述的接种量优选为5wt％(即：按重量计，固定化米根霉种子:发酵培养基＝5:95)；

所述的固定化发酵的发酵条件优选为：在发酵罐中进行发酵，每50L发酵罐装25L发酵培养基，发酵的pH值为5.0-5.5(可以采用间歇添加碳酸钙的方式控制pH值)，发酵温度为32-34℃，发酵周期为60小时；

所述的发酵培养基的组成为：马铃薯120g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.08g/L，尿素2g/L，CaCO₃60g/L。

发明人通过进一步的试验发现，在发酵过程中将通气流速和转速按照以下条件进行控制，可以显著的改善发酵效果，提高L-乳酸的产量：自发酵开始至第20小时，将通气流速控制为0.3L/L·min，转速控制为50-80rpm；自发酵第20小时至第40小时，将通气流速控制为0.6L/L·min，转速控制为450rpm；自发酵第40小时至第60小时，将通气流速控制为0.6L/L·min，转速控制为50rpm；

本发明选择磷酸三丁脂为消泡剂，发明人通过进一步的试验发现，消泡剂添加量和添加时间对于发酵的效果也有一定的影响，最终，发明人发现：消泡剂在发酵初期的添加量为0.01wt％，从发酵的第30h开始逐步添加至0.1wt％；采用上述技术手段可有效改善发酵效果，提高生物量。

本发明方法培育出了高产的米根霉菌株并将其固定到棉布载体上得到固定化米根霉种子，通过所摸索的最适宜的发酵条件进行固定化发酵，马铃薯淀粉转化率高，发酵产物生物量高，L-乳酸收率高；本发明方法除具有L-乳酸收率高等优点外，还具有成本低廉、步骤简捷、容易掌控等优点。

附图说明

图1米根霉发酵马铃薯淀粉制备L-乳酸的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料

一、培养基

(1)PDA斜面培养基(g/L)

马铃薯200，葡萄糖20，琼脂粉18。

(2)种子培养基(g/L)

葡萄糖60，尿素2.0，KH₂PO₄ 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.25，ZnSO₄·7H₂O 0.08。

(3)发酵培养基(g/L)

马铃薯120，KH₂PO₄ 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.25，ZnSO₄·7H₂O 0.08，尿素2，CaCO₃60。

二、菌株：米根霉(Rhizopus oryzae)As3.3462，购自北京中科院微生物研究所。

实施例1

以50L发酵罐发酵为例，米根霉固态发酵马铃薯淀粉生产L-乳酸工艺如下：

1.米根霉孢子的准备

将米根霉菌株米根霉真菌划线接种于马铃薯葡萄糖(PDA)斜面培养基，第一天设置培养温度32℃，相对培养湿度为70％，利于菌丝生长；第二天设置培养温度34℃，相对培养湿度为30％，利于孢子生成，由此方法接种3代活化菌种，待黑色浓密孢子完全覆盖白色菌丝后即可准备收集。

2.米根霉孢子乳悬液的制备

用无菌水冲洗长满菌丝的表面，接种于5L发酵罐中，以种子培养基培养至浓度达10⁶个/ml，即可得米根霉孢子乳悬液。

3.固定化种子制备

将棉布剪成约1cm×1cm的小块，放入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，于121℃蒸汽灭菌20分钟，冷却后接种孢子悬液，30℃培养24h后，菌丝体吸附在载体上，弃去原种子培养液，用无菌水反复冲洗三次，得到固定化菌丝球即固定化米根霉种子。

4.发酵罐固定化发酵

5wt％的接种量接种固定化米根霉种子，25L发酵液/50L发酵罐；采用间歇添加碳酸钙的方式将发酵液的pH值控制5.0-5.5，发酵温度为32-34℃，发酵周期为60小时；自发酵开始至第20小时，将通气流速控制为0.3L/L·min，转速控制为50-80rpm；自发酵第20小时至第40小时，将通气流速控制为0.6L/L·min，转速控制为450rpm；自发酵第40小时至第60小时，将通气流速控制为0.6L/L·min，转速控制为500rpm；消泡剂磷酸三丁脂的添加在发酵初期为0.01wt％，从第30h开始逐步添加至0.1wt％。

发酵60小时检测发酵产物，其中L-乳酸累积浓度可达88.90g/L发酵产物，对原淀粉的转化率达66.74％，生物量达7.2g/L。

实施例2

以50L发酵罐发酵为例，米根霉固态发酵马铃薯淀粉生产L-乳酸工艺如下：

1.米根霉孢子的准备

将米根霉菌株米根霉真菌划线接种于马铃薯葡萄糖(PDA)斜面培养基，第一天设置培养温度32℃，相对培养湿度为70％，利于菌丝生长；第二天设置培养温度34℃，相对培养湿度为30％，利于孢子生成，由此方法接种3-4代活化菌种，待黑色浓密孢子完全覆盖白色菌丝后即可准备收集。

2.米根霉孢子乳悬液的制备

用无菌水冲洗长满菌丝的表面，接种于5L发酵罐中，以种子培养基培养至浓度达106个/ml，即可得米根霉孢子乳悬液。

3.固定化种子制备

将棉布剪成约1cm×1cm的小块，放入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，于121℃蒸汽灭菌20分钟，冷却后接种孢子悬液，30℃培养24h后，菌丝体吸附在载体上，弃去原种子培养液，用无菌水反复冲洗三次，得到固定化菌丝球即固定化米根霉种子。

4.发酵罐固定化发酵

采用调节通气流量，搅拌转速等参数，5wt％的接种量接种固定化米根霉种子，25L发酵液/50L发酵罐；采用间歇添加碳酸钙的方式将发酵液的pH值控制5.0-5.5，发酵温度为32-34℃，发酵周期为60小时，将通气流速控制为0.3L/L·min，转速控制为50rpm；

发酵60小时检测发酵产物，其中L-乳酸累积浓度可达84.69g/L发酵产物，对原淀粉的转化率达62.63％，生物量达6.7g/L。

实施例3

以50L发酵罐发酵为例，米根霉固态发酵马铃薯淀粉生产L-乳酸工艺如下：

1.米根霉孢子的准备

将米根霉菌株米根霉真菌划线接种于马铃薯葡萄糖(PDA)斜面培养基，第一天设置培养温度32℃，相对培养湿度为70％，利于菌丝生长；第二天设置培养温度34℃，相对培养湿度为30％，利于孢子生成，由此方法接种3-4代活化菌种，待黑色浓密孢子完全覆盖白色菌丝后即可准备收集。

2.米根霉孢子乳悬液的制备

用无菌水冲洗长满菌丝的表面，接种于5L发酵罐中，以种子培养基培养至浓度达10⁶个/ml，即可得米根霉孢子乳悬液。

3.固定化种子制备

将棉布剪成约1cm×1cm的小块，放入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，于121℃蒸汽灭菌20分钟，冷却后接种孢子悬液，30℃培养24h后，菌丝体吸附在载体上，弃去原种子培养液，用无菌水反复冲洗三次，得到固定化菌丝球即固定化米根霉种子。

4.发酵罐固定化发酵

采用调节通气流量，搅拌转速等参数，5wt％的接种量接种固定化米根霉种子，25L发酵液/50L发酵罐；采用间歇添加碳酸钙的方式将发酵液的pH值控制5.0-5.5，发酵温度为32-34℃，发酵周期为60小时，将通气流速控制为0.6L/L·min，转速控制为500rpm；

发酵60小时检测发酵产物，其中L-乳酸累积浓度达81.76g/L发酵产物，对原淀粉的转化率为61.98％，生物量为6.69g/L。