以蛋白中色氨酸残基为Forster共振能量转移供体的均相亲和分析方法

摘要

本发明以蛋白质中色氨酸残基为内在Forster共振能量转移供体并设计特异性分析探针为Forster共振能量转移接受体，从而建立均相荧光亲和分析方法；所用分析探针带萘胺类荧光团，可检测探针与蛋白复合物中色氨酸残基在340nm附近荧光经共振能量转移被猝灭下降或探针经共振能量转移激发而使探针特有荧光升高；测定经过共振能量转移激发产生的探针特有荧光可高灵敏度非竞争性测定蛋白含量；通过候选配体竞争结合，测定共振能量转移产生的探针特有荧光或蛋白自身340nm荧光的变化，可测定非荧光候选配体竞争结合的半有效浓度，考虑分析探针与靶蛋白浓度相当的情况可推算候选配体的解离常数；当分析探针的亲和力比待测配体的亲和力低得多时，通过竞争结合还可以测定高亲和力配体的含量；此技术可用于实验诊断和配体类药物筛选。

说明书

发明的技术领域

本发明利用在小分子荧光标记配体(或半抗原)作为分析探针与蛋白结合形成的复合物 中，蛋白色氨酸残基与探针之间发生Forster共振能量转移(Forster-resonance-energy-transfer， FRET)，导致蛋白质的色氨酸荧光被猝灭而下降并伴随产生探针的特征性荧光发射而升高， 据此建立不需分离结合和游离探针的均相荧光亲和分析方法；此均相荧光亲和分析方法可用 于测定混合物中的蛋白含量、配体与蛋白的亲和力、高亲和力配体的含量等，在实验诊断、 配体类药物筛选等领域具有重要应用。

发明的技术背景

在生物医药领域选择性测定混合物中的特定蛋白、蛋白与配体的亲和力、特定配体或半 抗原的含量是重要的基础工作；这些测定通常依赖于蛋白同特殊配体、半抗原或抗原的高选 择性结合生成复合物，称为亲和分析。目前，亲和分析选择性测定混合物中的特定蛋白主要 用单抗作为探针测定蛋白抗原含量，如酶联免疫测定、放射免疫测定等；但这两类技术都需 分离结合的抗体探针与游离的抗体探针，操作繁琐而效率低，且使用同位素的危害大。亲和 分析测定蛋白与配体的亲和力可采用放射性同位素标记配体结合法、荧光极化法、Forster共 振能量转移(FRET)法等。其中，使用同位素标记配体为探针的方法也需分离结合与游离的探 针、操作效率低且危害大，而荧光极化法和FRET法都不需分离结合与游离的标记配体探针， 属于均相亲和分析；但荧光极化法灵敏度低，FRET需用特殊荧光基团分别修饰相应蛋白和参 考配体构成对应的FRET供体(donor)和接受体(acceptor)，显然对蛋白进行修饰容易改变蛋白 的功能且需要成本。因此，现有均相荧光亲和分析方法仍然有不足之处。

FRET法用于均相亲和分析灵敏度通常较高。因此，如果不需用特殊的荧光团标记蛋白质 就能以FRET为基础进行均相亲和分析测定对应蛋白含量、配体亲和力和配体当量，则无疑 是一种更理想的均相荧光亲和分析方法。

发明内容概述

本发明旨在利用天然蛋白质中色氨酸残基为其内在FRET供体从而避免对蛋白的修饰需 求，同时设计对此蛋白有高特异性结合能力且带有特殊荧光团的配体作为相应的FRET接受 体(此后称为天然蛋白的FRET探针)，使得在此FRET探针同该蛋白的复合物中，由于色氨酸 残基与探针中荧光团的距离比在溶液中游离状态时显著缩短，从而可有效发生FRET，使被选 择性激发的色氨酸残基可将能量转移到荧光配体上的荧光团，造成色氨酸残基的荧光被猝灭 而下降，同时探针荧光团发射特有的荧光信号，建立起对应的均相荧光亲和分析体系。

发生FRET要求供体的荧光发射光谱与接受体的荧光激发光谱有效重叠，供体相对于接 受体有所需相对取向，供体荧光团相对于接受体荧光团的距离需要足够近。蛋白分子足够大 时通常含有一定数量色氨酸残基，并在280nm附近激发时产生发射峰位于340nm附近的特 殊荧光，故蛋白质中的色氨酸残基可作为内在的FRET供体。如果FRET探针与蛋白之间没 有特异性相互作用，则探针与任何蛋白分子溶液中均匀分布；FRET探针与蛋白浓度处在微摩 尔每升水平时，探针与蛋白任何氨基酸残基之间的稳态距离都在100nm左右。发生FRET 通常要求相应供体与接受体之间的距离在7.0nm以内；一般蛋白的形状为球状且直径小于7.0 nm，通常蛋白中色氨酸残基含量可达到2％左右，而且接近均匀分布在整个构象空间。因此， 以色氨酸残基为内在FRET供体而分析探针为FRET接受体，如蛋白与FRET探针之间没有 相互作用则FRET探针与蛋白色氨酸残基之间不能发生有效的FRET；当FRET探针与蛋白发 生特异相互作用生成复合物后，复合物内探针荧光团与蛋白色氨酸残基之间的距离就可远小 于7.0nm，从而可发生有效的FRET。因此，只要获得满足要求的荧光标记配体作为天然蛋白 的FRET探针，就可建立起以天然蛋白中色氨酸残基为内在FRET供体，以探针FRET荧光 升高或蛋白色氨酸残基荧光猝灭为检测信号且对含有色氨酸残基蛋白通用的均相荧光亲和分 析系统，其不需对蛋白进行任何修饰，测定蛋白含量时不需要竞争结合，具有明显优势。

为增强蛋白与FRET探针形成复合物前后均相反应体系的荧光信号变化，需选择性激发 均相亲和反应体系中蛋白质色氨酸残基而避免直接激发FRET探针，且所用探针可有效通过 FRET猝灭色氨酸残基的荧光，故所用天然蛋白的FRET探针在色氨酸残基的有效激发波长下 应为激发谷，而在蛋白质色氨酸残基发射峰附近为激发峰；如FRET探针与蛋白结合后其荧 光量子产率更高或发射光谱显著不同，则此系统的灵敏度越高；天然蛋白中FRET探针结合 位点附近的色氨酸残基越多，则其灵敏度也可更好。相应地，满足上述要求的荧光标记基团 主要是萘胺和香豆素衍生物，而考虑其稳定性则萘胺衍生物更好，可用衍生物结构如图1。

另一方面，天然蛋白的FRET探针用于均相荧光亲和分析，其与目标蛋白结合的特异性 越高越好；FRET探针同寡聚体蛋白的结合尽量不出现变构效应。同时，用于测定蛋白含量的 FRET探针与目标蛋白亲和力越高越好；用于测定配体亲和力的FRET探针与靶蛋白的亲和力 应较高，但最好低于待测配体亲和力；用于测定配体含量的FRET探针与蛋白的亲和力应较 高，但是必须显著低于待测配体的亲和力，且比待测配体越低越好。显然，设计低亲和力FRET 探针容易，而设计高亲和力FRET探针的较难。

对于配体结合域与溶剂相通的蛋白，其FRET探针设计较为容易，可为识别基团与满足 要求荧光团的加合物，例如链亲和素和亲和素等蛋白。对于配体结合域深入到蛋白构象内部 造成被结合的配体包埋在内部的蛋白，需据配体结合域的构象特点设计所需FRET探针。萘 胺荧光团体积较小，对包埋在内部的FRET探针也可用。更重要的是，通常配体结合域包埋 了配体时此结合域就越接近于蛋白三维构象空间的中部，这样结合的配体与色氨酸残基之间 的距离就较近，有利于发生更强的FRET；同时，这种情况下疏水相互作用对配体的结合贡献 大，对应的结合域中容易出现色氨酸残基，这也使得FRET效应容易增强。因此，利用蛋白 的三维结构数据，计算机辅助设计所需要的FRET探针是有效策略。

用FRET探针通过竞争结合测定候选配体亲和力时需避免候选配体散射信号干扰。用280 nm附近紫外光激发时有对称结构的配体在450nm附件会产生散射信号，水在310nm附件也 会产生散射信号。但散射信号通常比相同浓度下的荧光信号低得多；当所用候选配体浓度接 近于FRET探针浓度时其散射信号一般很弱。只要所用FRET探针亲和力比较低，则通过竞 争结合可测定高亲和力配体的亲和力。同时，所用FRET探针的荧光量子产率越高则荧光信 号比散射信号越强，则体系的抗干扰能力越强。另外，通常在280nm激发时，候选配体的散 射信号峰在400nm以上，且对测定340m荧光的干扰相对较小。所以，只要用适当高的靶 蛋白浓度产生足够的340nm荧光信号，且所设计的FRET探针能猝灭绝大部分的340nm荧光， 则检测候选配体与探针竞争结合过程中的蛋白荧光猝灭，仍可测定候选配体的亲和力。

为便于合成所需FRET探针，将萘胺荧光团活化成特定形式，以便与常见的蛋白结合基 团连接成所需要的探针，包括将萘胺对应羧酸衍生物生成N-羟基琥珀酰亚胺酯、生成萘胺的 伯氨或伯醇衍生物；在萘胺N的对位还可用所需要的取代基团以调节与蛋白结合的亲和力。 通过计算机辅助设计，可以获得所需要的FRET探针，从而以与天然蛋白的色氨酸残基之间 发生FRET为基础建立起均相荧光亲和分析系统。

应用实施例

实施例1：用FRET探针测定链亲和素含量

1.设计和合成链亲和素的FRET探针

(1)α-萘替乙二胺与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，产物用乙醚沉淀和洗涤后，过 硅胶柱，用含7％甲醇的氯仿洗脱；产物用高分辨质谱和NMR鉴定确认，产物简称 为BNEDA；结构如图2所示。

(2)用丹磺酰氯和30倍乙二胺在二氯甲烷中反应，产物用水洗涤，干燥后过硅胶柱，用 含7％甲醇的氯仿洗脱；产物用高分辨质谱确认，以下称为DEDA；再用生物素的N- 羟基琥珀酰亚胺酯与DEDA反应，纯化，高分辨质谱和NMR确认，结构如图2。

2.建立基于检测FRET探针BNEDA特有荧光为基础的均相荧光亲和分析系统

(1)反应体系为0.10mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，用0.5μm微孔滤膜过滤。

(2)控制反应体系蛋白总浓度为2.0mg/L，BNEDA的总浓度为32nmol/L。

(3)扫描发现BNEDA在280nm为激发谷而在245nm和325nm为激发峰，其发射峰在 450nm附近，荧光量子产率接近0.3，且其在325nm的激发峰远高于280nm激发的 荧光信号。链亲和素在280nm为激发峰并在340nm出现发射峰。BNEDA同链亲和 素的复合物在280nm出现比325nm更高的激发峰且有典型的430nm荧光发射，并 伴随340nm发射下降；当用生物素竞争结合置换BNEDA则伴随340nm荧光升高和 430nm荧光显著下降((图3a(激发光谱)和图3b(发射光谱))。可见，在链亲和素和 BNEDA其复合物中发生了FRET，藉此可建立均相荧光亲和分析体系(图4)。

(4)用BNEDA检测在280nm激发下在430nm的FRET荧光，用BNEDA滴定链亲和素 的结合位点浓度(每个亚基一个结合位点)，结果证实按照链亲和素亚基分子量为 13500计算，则滴定时的结合比例为1:0.98(附图5)；标定后的链亲和素用含20％ 甘油的缓冲液加叠氮钠抑制细菌保存作为标准品，可重复使用。

(5)在有2.0mg/L总蛋白(细菌裂解液或者牛血清白蛋白)时，检测来自BNEDA的稳态 FRET荧光(430nm)，其荧光同反应体系的链亲和素含量成正比；在普通荧光分光 光度计上用5nm激发狭缝和10nm发射狭缝，线性范围可从0.50nmol/L到30.0 nmol/L(附图6)；检测限可达到0.15nmol/L，即链亲和素四聚体浓度为40pmol/L。

(6)在相条件下，以单独BNEDA的信号和加入BNEDA前的信号之和减去缓冲液的信号 为本底，则430nm荧光对链亲和素含量的响应曲线基本通过原点，这说明430nm荧 光为BNEDA和BNEDA与链亲和素复合物的加和，符合预期的化学计量学原则。

(7)扣除本底后，在固定BNEDA浓度时，均相反应体系的430nm荧光信号对反应体系 的表面活性剂、有机溶剂、金属离子、常用络合剂等都有抗性。

(8)所合成的BDEDA在其与链亲和素的复合物内也能产生FRET现象，其FRET发射峰 在525nm(图7)。但其所含荧光团在缓冲液中的荧光量子产率很低，所产生FRET荧 光信号很弱；相反，BDEDA猝灭链亲和素在340nm荧光的能力与BNEDA相当。

实施例2：用FRET探针和竞争结合测定生物素衍生物的亲和力

(1)如果选用BDEDA为FRET探针时测定链亲和素在280nm激发下产生的340nm荧光 信号灵敏度更高；如用BNEDA为FRET探针，其FRET荧光信号更高，可用于亲和 力高且散射信号弱的候选配体；需考察在280nm附近激发下，候选配体的散射信号 强弱决定选用那种FRET探针和检测蛋白荧光猝灭还是探针的FRET荧光发射。

(2)生物素对链亲和素在340nm荧光猝灭能力很弱且在430nm附近的散射信号也很弱。 以BNEDA为FRET探针检测430nm荧光，测定竞争结合时BNEDA结合率随生物 素浓度的变化，将浓度换算成对数后作图，选取线性部分做回归分析确定半有效浓度 (EC₅₀，图8)；对BDEDA检测525nm的FRET荧光发射确定生物素的EC₅₀(图9)。

考虑到结合反应体系蛋白结合位点浓度和FRET探针浓度相当，故需特殊公式，利用 生物素与链亲和素公认的解离常数(为40fmol/L)，将EC₅₀换算成FRET探针的解 离常数(Linden，J.J.Cycl Nucl.Res.1982，8，163-172)。

(3)对400nm以上没有明显散射信号的非荧光候选配体，如生物素化乙醇胺、生物素化 丁胺等，以BNEDA为FRET探针检测430nm的荧光信号确定BNEDA结合率，对 数浓度作图确定各自的EC₅₀，按照前述文献公式计算各自的解离常数。

(4)对在400nm以上有明显散射信号的非荧光候选配体，包括生物素化乙二胺、生物素 化环己胺等，用BDEDA为参考配体进行竞争结合并检测340nm荧光变化，以候选配 体绝对过量时的荧光减去没有候选配体时的荧光为最大变化值，不同候选配体浓度下 的340nm荧光与候选配体绝对过量时的荧光之差的绝对值除以最大变化值为结合率， 对数浓度作图确定各自的EC₅₀，按照前述文献公式计算各自的解离常数。

说明书附图说明

图1.可用的荧光标记基团

图2.BNEDA和BDEDA结构示意图

图3.BNEDA、链亲和素相互作用体系的荧光激发和发射光谱

图4.BNEDA同链亲和素亚基结合后发生共振能量转移示意图

链亲和素亚基显示绿色，其中红色细线标示为色氨酸残基。粗树枝状 的结构为BNEDA，萘胺环与色氨酸环之间发生共振能量转移。

图5.用BNEDA滴定44nmol/L链亲和素亚基的过程。

F430为BNEDA的FRET荧光，横轴为BNEDA终浓度。

图6.在430nm的荧光对BNEDA浓度、链亲和素(STR)亚基浓度的响应曲线。

图7.BDEDA和链亲和素体系在290nm激发的发射光谱

图8.监测430nm的FRET荧光时，生物素(Biotin)与BNEDA竞争结合过程中 结合率随生物素浓度对数的变化。所用链亲和素浓度为120nmol/L， BNEDA浓度为160nmol/L.

图9.监测525nm的FRET荧光时，生物素(Biotin)与BDEDA竞争结合过程中 结合率随生物素浓度对数的变化。所用链亲和素浓度为50nmol/L，BDEDA 浓度为80nmol/L.