预防性治疗和减轻变态反应性疾病

摘要

本发明提供了至少一种选自姜科族植物的植物萃取物在制备适用于治疗或预防变态反应性疾病的药物中的应用。所述植物任选地选自非洲美花姜属、山柰姜属、赛考基姜属或赛考基拉姜属，以及安赛皮非洲美花姜种、纳丽塔非洲美花姜种、安赛皮山柰姜种、纳丽塔山柰姜种、意丝丽山柰姜种、安赛皮赛考基姜种或安赛皮赛考基拉姜种。所述变态反应性疾病选自哮喘和特应症。

说明书

技术领域

本发明涉及适用于预防性治疗和减轻变态反应性疾病的化合物。更具体说，本发明涉及适用于预防性治疗和减轻哮喘和/或特应性的化合物。

背景技术

糖皮质激素广泛应用于预防性治疗哮喘和其他变态反应性疾病。糖皮质激素结合糖皮质激素受体(GR)，从而激活GR。然后活化的GR结合糖皮质激素反应元件并上调抗炎蛋白如脂皮质蛋白的基因。诱生消炎蛋白脂皮质蛋白进而抑制磷脂酶A2，从而减少变态反应介质(如前列腺素和白三烯)的产生。《变态反应与变态反应性疾病：新机制及治疗》(Allergy and Allergic Diseasess：The new Mechanismand Therapeutics，J.A.Denburg编，Human Press Inc(人类印刷公司)，Totowa，NJ，Schleimer RP，糖皮质激素对炎症细胞的作用与其在哮喘中的治疗应用有关(Effects of Glucocorticosteroids on inflammatory cell relevant to their TherapeuticApplication in Asthma)，Am.Rev.Respir.Dis.，1990，141，S59-S69。

活化的GR的另一个主要作用是下调多种物质，包括细胞因子和趋化因子如白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)。已经证明，糖皮质激素抑制细胞因子(尤其是IL-5)产生的能力是其有效治疗变态反应性疾病，尤其是哮喘和特应症的主要原因。

而且，特别感兴趣的是磷酸二酯酶同工酶(PDE’s)，更具体是PDE4的抑制剂用作抗哮喘药，因为证据表明这些酶在动物和人体中均能起抗炎剂和支气管扩张剂的作用。Cortijo J，Beleta J，Cardelus I，Llenas E，Morcillo E.，磷酸二酯酶IV在支气管舒张中的作用的研究，包括人支气管的研究(Investigation into the role ofphosphodiesterase IV in bronchorelaxation，including studies with human bronchus)，Br.J.Pharmcol.，1993，108，562-568。

因为其显著的支气管收缩作用，白三烯在变态反应性疾病的研究中也非常感兴趣的。白三烯的支气管收缩作用比组胺和前列腺素高约1000-倍以上。白三烯位于肥大细胞细胞膜磷脂双层中的花生四烯酸的副产物。哮喘发作期间，花生四烯酸转化为五种白三烯。这种转化通过酶，即5-脂肪氧合酶(5-LO)介导，首先将花生四烯酸转化为5-羟基过氧二十碳四烯酸(5-HPETE)，然后再转化为白三烯A4(LTA4)，白三烯A4是其他四种白三烯的前体。在哮喘发作期间产生的五种白三烯中，半胱氨酰类白三烯(LTC4、LTD4和LTE4)是最强效的支气管收缩剂。WerzO，Steinhilber D，5-脂肪氧合酶抑制剂的治疗手段(Therapeutic options for 5-lipoxygenase inhibitors)，Pharmacology and Therapeutics，2006，112，701-718。

在该过程中，白三烯生物合成抑制剂起着重要的作用，因为它可抑制5-LO的作用，从而抑制支气管收缩性白三烯的最终合成。

因此，可通过给予需要的患者糖皮质激素受体(GR)结合化合物，PDE抑制剂和/或5-LO抑制剂来操控上述途径。近年来，大多数情况下这可通过给予患有变态反应性疾病或变态反应的患者(如哮喘或特应症患者)甾体化合物来实现。由于疾病治疗过程中与甾体化合物有关的许多有害的副作用的存在，因而需要具有甾体化合物和含甾体制剂相关有益性能的非甾体化合物。

在慢性炎症疾病，如哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病和牛皮癣中，一些细胞因子募集活化的免疫和炎症细胞到病损部位，从而扩大和保持炎性状态。这些活化细胞产生许多其他炎症介质。该恶性循环可通过糖皮质激素或免疫抑制疗法得到抑制，但对于慢性炎症疾病不是根治方法。转录因子在免疫和炎症反应中起着关键作用，一种普遍存在的尤其重要的转录因子是核因子-κB(NF-κB)。NF-κB是人免疫应答的中心介质，调节各种促炎和炎症介质如细胞因子白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-8(IL-8)和TNF-α、以及编码环氧合酶II、一氧化氮合酶、免疫受体、细胞粘附分子、或急性期蛋白质的基因转录。在变态反应性哮喘患者的临床研究中，患者白介素-8(IL-8)血浆水平升高。Blackwell TS，Christian JW，核因子-κB在细胞因子基因调节中的作用(The role of nuclear factor-κB in cytokinegene regulation.)Am.J.Respir.Cell Mol Biol 1997；17：3-9，Hashimoto，S.，Matsumoto，K.，Gon，Y.et al.2000.p38 MAP激酶调节人支气管上皮细胞产生TNFα-、IL-1α-和PAF-诱导的RANTES和GM-CSF产生(p38 MAP Kinase regulatesTNF alpha-，IL-1 alpha-and PAF-induced RANTES and GM-CSF production by humanbronchial epithelial cells).Clinical and Experimental Allergy.30：48-55.Herlaar，E.和Brown，Z.1999.炎症疾病中的p38 MAPK信号转导级联反应(p38 MAPKsignaling cascades in inflammatory disease).Molecular Medicine Today.5：439-447.Holden，N.S.，Catley，M.C.，Cambridge，L.M.，Barnes，P.J.和Newton，R.2004.A549细胞中ICAM-1表达是高度NF-κB依赖性的(ICAM-1 expression ishighly NF-kappaB-dependent in A549 cells).European Journal ofBiochemistry.271：785-791。因此，哮喘和炎症疾病的治疗中抑制NF-κB，导致趋化因子如IL-8下调是有益的。

发明内容

根据本发明的一方面，提供了适用于预防性治疗和减轻变态反应性疾病的姜科族(Zingiberaceae)植物的有机溶剂萃取物或精油。

姜科族植物包括非洲美花姜属(Siphonochilus)、山柰姜属(Kaempferia)、赛考基姜属(Cienkowskia)和/或赛考基拉姜属(Cienkowskiella)。

有机溶剂萃取物或精油可从选自下组的植物获得：安赛皮非洲美花姜种(Siphonochilus aethiopicus)，纳丽塔非洲美花姜种(Siphonochilus natalensis)，安赛皮山柰姜种(Kaempferia aethiopica)，纳丽塔山柰姜种(Kaempferia natalensis)，意丝丽山柰姜种(Kaempferia ethelae)，安赛皮赛考基姜种(Cienkowskia aethiopica)和安赛皮赛考基拉姜种(Cienkowskiella aethiopica)。

优选地，所述有机溶剂萃取物或精油包含式1的化合物作为活性成分：

(4a-S，5R，8a-R或4a-R，5S，8a-S)

式1化合物的化学名(IUPAC)是4，4a，5，9-四氢-3，5，8a-三甲基萘并[2，3-b]呋喃-8-酮。

式1化合物可采用其外消旋混合物形式或立体异构体之一的形式。

变态反应性疾病的例子是哮喘和特应症。

通常，有机溶剂萃取物或精油能够结合糖皮质激素受体(GR)，诱导脂皮质蛋白产生，和/或抑制磷脂酶A2，和/或减少前列腺素和/或白三烯的产生。

有机溶剂萃取物或精油具有抗-支气管收缩活性，还可下调细胞因子和趋化因子试剂如白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)。

有机溶剂萃取物或精油可抑制人免疫应答的NF-κB中心介质，下调各种促炎和炎症介质如细胞因子白介素-8(IL-8)的转录。

有机溶剂萃取物或精油可通过以下方法获得，该方法包括从姜科族植物的植物材料制备萃取物，和分离具有抗变态反应性疾病活性的馏份，所述萃取物包含的活性成分具有抗变态反应性疾病活性。

所述方法可包括以下步骤：对所述植物安赛皮非洲美花姜种的湿润根茎或根或研磨的(ground)植物样品进行萃取，或通过空气干燥或烘箱干燥来干燥植物的根茎和/或根，然后将所述根茎和/或根研磨成粉末。萃取物的制备过程包括用有机溶剂如二乙醚、二异丙基醚、叔丁基甲基醚、叔丁基乙基醚、乙酸乙酯或乙酸苄基酯进行萃取。活性成分可通过萃取技术进行萃取，所述萃取技术包括蒸汽蒸馏和/或用溶剂/溶剂分配和/或色谱分离技术来纯化萃取物。

根据本发明的另一方面，提供了适合在预防性治疗和减轻变态反应性疾病的方法中使用的物质或组合物，该物质或组合物包括上述萃取物作为活性成分，所述方法包括给予对象有效剂量的所述物质或组合物。

根据本发明的另一方面，提供了适合在预防性治疗和减轻变态反应性疾病的方法中使用的物质或组合物，该物质或组合物包括式1的化合物作为活性成分，所述方法包括给予对象有效剂量的所述物质或组合物。

根据本发明的又一方面，提供了适合在预防性治疗和减轻变态反应性疾病的方法中使用的式1的化合物。

根据本发明的另一方面，提供了上述有机溶剂萃取物或精油在制备具有抗变态反应性疾病活性的药物中的应用。

变态反应性疾病的例子是哮喘和特应症。

根据本发明的又一方面，提供了适用于预防性治疗和减轻变态反应性疾病的组合物，所述组合物包含有效量的所述萃取物、所述式1的化合物或所述精油中的一种。

所述萃取物和萃取物的组合物可以是适用于哺乳动物对象，尤其是人的形式。萃取物可以是有机溶剂萃取物和/或精油或其组合的形式。

本发明涉及上述有机溶剂萃取物、精油或式1的化合物在下调糖皮质激素受体，抑制磷脂酶A2，下调变态反应介质如前列腺素和白三烯，下调细胞因子如IL-4和IL-5，抑制磷酸二酯酶4，抑制5-脂肪氧合酶或白三烯生物合成，和抑制导致IL-8下调的NF-κB转录应答特异性活性中的应用。

更具体说，本发明提供了至少一种选自姜科族植物的植物萃取物在制备适用于治疗或预防变态反应性疾病的药物中的应用。

所述至少一种植物选自非洲美花姜属、山柰姜属、赛考基姜属和赛考基拉姜属以及安赛皮非洲美花姜种、纳丽塔非洲美花姜种、安赛皮山柰姜种、纳丽塔山柰姜种、意丝丽山柰姜种、安赛皮赛考基姜种和安赛皮赛考基拉姜种。

萃取物可包含选自具有式1结构的化合物、其立体异构体的化合物及其立体异构体的混合物作为活性成分：

(4a-S，5R，8a-R或4a-R，5S，8a-S)

变态反应性疾病选自哮喘和特应症。

萃取物可以是蒸汽蒸馏至少一种植物的植物材料获得的精油。可选地，萃取物也可以是通过用有机溶剂萃取至少一种植物的植物材料获得的有机溶剂萃取物。

有机溶剂可以是醚，选自二乙醚、二异丙醚、叔丁基甲基醚、叔戊基甲基醚和叔丁基乙基醚。可选地，有机溶剂也可以是酯，选自乙酸甲酯、乙酸乙酯和乙酸苄基酯。

植物材料可从植物根部或根茎获取。

本发明涉及适合在治疗或预防变态反应性疾病中使用的组合物，该组合物包含至少一种选自姜科族植物的萃取物。

所述至少一种植物如上所述。

萃取物如上所述。

变态反应性疾病可选自哮喘和特应症，植物材料可从植物的根或根茎获取。

本发明涉及至少一种选自姜科族植物的萃取物在制备适用于实现以下一种或多种作用的药物中的应用，所述作用包括下调糖皮质激素受体，抑制磷脂酶A2，下调变态反应介质，下调细胞因子，抑制磷酸二酯酶4，抑制5-脂肪氧合酶或白三烯生物合成，和抑制NF-κB转录应答特异性活性。

所述变态反应介质可选自前列腺素和白三烯。细胞因子可选自IL-4、IL-5和IL-8。

所述至少一种植物如上所述。

萃取物如上所述。

变态反应性疾病选自哮喘和特应症。

植物材料可从植物的根或根茎获取。

本发明还涉及选自式1化合物、其立体异构体的化合物及其立体异构体的混合物在制备适用于治疗或预防变态反应性疾病的药物中的应用：

(4a-S，5R，8a-R或4a-R，5S，8a-S)

所述变态反应性疾病选自哮喘和特应症。

本发明还涉及治疗变态反应性疾病的方法，该方法包括给予需要治疗的人或动物治疗有效量如上所述的萃取物、组合物或选自式1的化合物。

所述变态反应性疾病如上所述。

附图说明

现在将通过例子的方式，参考示意性图表来描述本发明。

图1显示了用于萃取式1化合物的方案的流程图。

图2显示了式1化合物对Con-A诱导的细胞毒性介质释放的抑制曲线。

图3显示了DMSO标准对照对Con-A诱导的细胞毒性介质释放的抑制曲线。

图4显示了式1化合物对NF-κB转录应答的抑制或浓度反应曲线，所述曲线经标准化。

图5显示了环孢菌素A阳性对照对NF-κB转录应答的抑制或浓度反应曲线。

图6显示了式1化合物和地塞米松标准对照品联用对IL-1介质释放的抑制曲线。

图7显示了式1化合物和地塞米松标准对照品联用对IL-5介质释放的抑制曲线，其中式1化合物的抑制曲线经标准化。

图8显示了包含式1化合物的二乙醚萃取物对NF-κB转录应答的抑制或浓度反应曲线，所述曲线经标准化。

图9显示了环孢菌素A阳性对照对NF-κB转录应答的抑制或浓度反应曲线。

具体实施方式

本发明的植物萃取物或馏份可通过从安赛皮非洲美花姜种湿润的根茎、根或研磨的植物样品萃取来制备，或者通过空气干燥或烘箱干燥植物的根茎和/或根，然后将所述根茎和/或根研磨成粉末来制备。其活性成分可通过萃取技术来萃取，该技术包括蒸汽蒸馏和溶剂萃取。化合物可通过利用溶剂/溶剂分配和/或色谱分离技术从萃取物或馏份中分离单独的化合物来进行进一步的精制。这些技术在下面所示实施例中更详细地描述。

实施例1：植物材料的水浸液与分馏

见图1所示，制备诸如叶、根茎或根的植物材料的浸液14。将1升去离子沸水(如2所示)加入22.08g经烘箱干燥(60℃)的研磨根茎中(如10所示)，偶尔搅拌静置1小时。将水过滤并去除固体11，水相用500ml二乙醚萃取4次(如16所示)。将每次萃取所得萃取物进行合并、干燥、过滤，并于25℃的温度下在水浴中通过旋转蒸发的方式去除溶剂(如18所示)，得到119mg含醚组分20(WG13A)，称为有机馏份。液-液分配期间形成固体22形式(WG13D)的中间层。获得约107mg固体22，保持分离。将水层冻干(如24所示)，得到2.52g固体材料26(WG13B)，称为水相馏份。式1的化合物存在于有机馏份中，可用薄层色谱法进行鉴别。然后用柱色谱法进一步纯化该化合物。

实施例2：植物材料的有机溶剂萃取

与实施例1的方法不同，同样参考图1，将1升二乙醚加入22.08g经烘箱干燥的(60℃)研磨根茎中，偶尔搅拌静置1小时。将醚组分过滤并在低真空下小心蒸发，产生约1.5g干燥的萃取物34(WG-I-101或WG-I-58A)。利用薄层色谱法进行鉴定，式1的化合物存在于有机溶剂萃取物中。

实施例3：有机溶剂萃取物的分馏

将上述水相萃取或有机溶剂萃取过程得到的二乙醚萃取物通过快速色谱法(硅胶)进行进一步的纯化，如30所示，采用乙酸乙酯-己烷(1:9，v/v)作为洗脱液，得到式1的倍半萜类物质WG13C或WG-I-94B，如32所示。

精油通过蒸汽蒸馏安赛皮非洲美花姜种植物的根茎和/或根来获取。精油主要成分的化学组成如下表1所示。主要成分的鉴别通过联用气相色谱-质谱法和Kovats指数技术来实现。式1的倍半萜类物质在蒸汽蒸馏过程期间所得精油与冷凝物的界面处形成结晶。随后使精油冷却至4℃以下，式1的化合物即从油中结晶出来。

表1：精油化学组成(表1所列化合物的IUPAC命名参见表20)

 

保留时间(分钟)保留指数化合物化合物在油中的百分比        7.45940α-蒎烯1.028.52976桧萜4.968.98992香叶烯1.619.571011δ-3-蒈烯1.479.971025α-萜品烯0.8510.121030B-水芹烯7.1310.341037顺-罗勒烯1.8610.661048反-β-罗勒烯10.8311.001059γ-萜品烯1.0813.101129别-新-罗勒烯8.9013.481142别-罗勒烯16.0020.851400β-榄香烯1.2323.281489大根香叶烯-D1.3924.521537野缬草烷(Kessane)13.2525.271567大根香叶烯-B9.8132.101856通式化合物9.32

实施例4：蒸汽蒸馏

将约600g新鲜根茎和/或根用水洗涤并空气干燥。从根茎分离新鲜的根。将根碾碎，并将根茎切成厚约2-3mm的切片。在蒸汽蒸馏装置中将根和切片的根茎进行蒸汽蒸馏3小时。在分液漏斗中收集1升冷凝物。用去离子水将冷凝器中形成的结晶冲下并通过垂熔玻璃漏斗过滤。该结晶包含式1的化合物。

将分液漏斗冷凝物中精油和水的混合物在室温下静置16小时。通过引流冷凝物和用垂熔玻璃漏斗过滤得到表面上的包含式1化合物的结晶。获得总共480mg式1的化合物。

式1化合物的结构鉴定基于该化合物高场¹H和¹³C核磁共振(NMR)频谱数据的详细研究。化合物表征过程的第一阶段是鉴别属于孤立自旋系统的¹H NMR信号。这可采用COSY-45序列，通过二维(2D)(¹H，¹H)相关光谱学方法来实现。从偶合的¹³CNMR频谱以及采用DEPT序列脉冲获得的质子解偶的CH、CH₂和CH₃亚-频谱推导出¹³C NMR频谱中包含多个不同共振。这种¹³C共振部分归因于2D(¹³C，¹H)化学位移实验中带质子碳原子与特定共振的相关性。

由2-D远程¹³C-{¹H}化学位移实验(HMBC)得出序列信息，以及四元碳原子的信号，如下表2、3和4所示：

表2：式1化合物在CD₂Cl₂中的¹H(500MHz)NMR数据

 

氢原子J(HH)/HzδH/p.p.m.2-7.02brs4轴向15.9，11.0，3.0，1.72.16dddd4平伏(equit)15.9，5.4，1.72.74ddd4a11.0，10.3，5.41.85ddd510.3，7.2，2.8，2.12.40dddd610.1，2.16.72dd710.1，2，85.91dd9^*轴向16.9，3.0，1.72.64brd9^*平伏16.9，1.72.71brd5-Me7.21.24d3-Me1.71.94d8a-Me-1.4s

^*可互换

表3：式1化合物在CD₂Cl₂中的¹³C(125，8MHz)NMR数据

 

碳原子δc/p.p.m2137.83D3119.73S3a115.37S422.89T4a45.42D534.71D6154.82D7126.76D8204.24S8a45.32S932.37T9a149.67S5-Me18.95Q3-Me8.19Q8a-Me16.95Q

参考表3：

1.式1化合物的质谱：

m/z230(M⁺)；215(M⁺-CH₃)；187(-CO)；83(基峰)。

2.旋光度[α]_D＝+108.8°(c＝1.0，CH₂Cl₂)

3.熔点89-90℃

表4：2D远程13C-{¹H}化学位移实验(HMBC)

由(1H，1H)偶合常数等级以及下表5所示同核1H-{1H}n.O.e实验的结果得到式1化合物的相关立体化学结构：

(4a-S，5R，8a-R或4a-R，5S，8a-S)

表5：由同核1H-{1H}n.O.e实验得到的结果

生物试验与抑制性研究：

本文提供的生物化学试验结果以化合物抑制特异性结合或活化的百分率表示。试验过程在Cidlowski，J.A.和Cidlowski，N.B.，糖皮质激素对培养的HeLa S3细胞中糖皮质激素受体的调节作用(Regulation of glucocorticoid receptors byglucocorticoids in cultured HeLa S3 cells).Endocrinology 109：1975-1982，1981中描述，将其内容纳入本文作为参考。该试验特异性测量活性糖皮质激素在糖皮质激素受体下调过程中的能力。因而认为应答性试验化合物具有类似于活性糖皮质激素的活性。

表6(下表)显示了筛检合并的有机醚馏份(图1中称为WG-I-13A)、水相馏份(图1中称为WG-I-13D)和不溶性馏份(图1中称为WG-I-13D)所得到的结果。合并馏份称为WG-I-5AB+WG-I-5C，见图1所示。

由表6可见，浓度100μg/ml的合并馏份(WG-I-5AB+WG-I-5C)在HeLa S₃(人上皮样宫颈癌)细胞的糖皮质激素受体(GR)结合试验中观察到显著活性(61％抑制)。该试验测量[³H]地塞米松与人糖皮质激素受体的结合。采用标准技术，将HeLa S3细胞悬浮在改良的HEPES缓冲液中，pH7.2。

表6：合并馏份WG-I-5AB+WG5C(不溶性馏份、二乙醚和水相萃取物的混合物)的生物试验

 

靶点物种n＝浓度抑制(％)磷酸二酯酶PDE4人2100μg/ml52磷脂酶PLA₂-1猪2100μg/ml12磷脂酶PLA₂-11ca2100μg/ml-26腺苷A₃大鼠2100μg/ml27肾上腺素能₂人2100μg/ml25糖皮质激素人2100μg/ml61组胺H₁外周血豚鼠2100μg/ml40白介素IL-1小鼠2100μg/ml1白三烯B₄人2100μg/ml20白三烯D₄豚鼠2100μg/ml12血小板活化因子(PAF)兔2100μg/ml-1类前列腺素EP₁人2100μg/ml33类前列腺素EP₄人2100μg/ml35

^*ca＝西方菱背响尾蛇(crotalus atrox)；；n＝试管数

25℃下，将细胞(1 x 10⁶)与6nM[³H]地塞米松一起孵育120分钟。在20μM地塞米松的存在下测定非特异结合。过滤膜并洗涤三次，对滤膜计数以确定[³H]地塞米松特异性结合。筛检10μM时各化合物的活性。

基于表6的结果，合并馏份(WG-I-5AB+WG-I-5C)能有效结合糖皮质激素受体(GR)位点。此外，在人U937细胞中进行的磷酸二酯酶PDE4酶试验观察到与该合并馏份有关的显著活性。抑制作用提示合并馏份(WG-I-5AB+WG-I-5C)具有支气管扩张作用。对于PDE4试验，采用从人U-937前单核细胞(pronocytic cell)部分纯化的PDE4。将试验化合物和/或运载体与0.2μg酶和含0.01μM[³H]cAMP的1μMcAMP在Tris缓冲液pH7.5中30℃下孵育20分钟。煮沸2分钟终止反应，加入10mg/ml蛇毒核苷酸酶并在30℃进一步孵育10分钟，所得AMP转化为腺苷。未水解的cAMP结合于AGI-X2树脂，闪烁计数法定量水相中存留的[³H]腺苷。100μM下筛检化合物。使用IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)作为标准参比试剂。

确定了所有合并馏份具有活性特异性之后，采用上述糖皮质激素受体(GR)结合试验和磷酸二酯酶PDE4酶试验，分别对有机醚馏份(WG-I-13A)、水相馏份(WG-I-13B)以及有机层和萃取层界面处的不溶性馏份(在图1中称为WG-I-13D)进行生物分析。

这些试验所得结果在下表7、8和9中显示。萃取物浓度100μg/ml时，采用糖皮质激素受体(GR)结合试验(77％抑制)，以及磷酸二酯酶PDE4酶抑制实验(57％抑制)观察到有机醚萃取物(WG-I-13A)的抑制活性增加。水相馏份(WG-I-13B)或不溶性界面馏份(WG13D)没有观察到显著活性。

表7：WG13B(水相萃取物)的抑制性生物试验

 

靶点物种n＝浓度抑制(％)磷酸二酯酶PDE4人2100μg/ml15糖皮质激素人2100μg/ml11

n＝试管数

表8：WG-I-13A(二乙醚萃取物)的抑制性生物试验

 

靶点物种n＝浓度抑制(％)磷酸二酯酶PDE4人2100μg/ml57糖皮质激素人2100μg/ml77

n＝试管数

表9：WG-I-13D(不溶性馏份)的抑制性生物试验

 

靶点物种n＝浓度抑制(％)磷酸二酯酶PDE4人2100μg/ml-9糖皮质激素人2100μg/ml5

n＝试管数

有机馏份20(WG-I-13A)采用LC-MS(联用液相色谱-质谱)得到的化学指纹图谱并没有提示存在甾体类化合物。有机馏份的分馏导致分离得到具有化学表征和鉴别为式1的倍半萜类化合物的主要化合物(图1中称为WG-I-13C)。筛检该倍半萜类化合物的活性，同样采用上述的糖皮质激素受体(GR)结合试验和磷酸二酯酶PDE4酶试验。这些试验的结果如下表10所示。

表10：WG-I-13C(化合物1)的抑制性生物试验

 

靶点物种n＝浓度抑制(％)磷酸二酯酶PDE4人2100μg/ml35糖皮质激素人2100μg/ml104

n＝试管数

纯化合物浓度100μg/ml下，磷酸二酯酶PDE4酶试验观察到较低的非显著性活性(35％抑制)，而糖皮质激素受体(GR)结合试验观察到104％活性。这提示倍半萜类化合物本身在支气管扩张中并不是起最重要的作用，在本发明的植物萃取物中，存在的其他化合物具有支气管扩张作用。

糖皮质激素结合试验中倍半萜类化合物的IC₅₀值测定为50.3μM，如下表11所示。

表11：测定倍半萜类化合物(1)的IC₅₀值

 

主要的生物化学试验          物种浓度抑制(％)IC₅₀K_in_H糖皮质激素人100μM7050.3μM22.8μM1.4

此外，纯化合物浓度100μg/ml时，5-脂肪氧合酶试验(5-LO)中观察到倍半萜类化合物的显著活性，即99％抑制。该试验的结果如下表12所示。对于5-LO试验，采用从大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-1)制备的5-脂肪氧合酶粗产物。Tris缓冲液pH7.2中，室温下，将试验化合物与酶预先孵育5分钟。加入15μM花生四烯酸作为底物启动反应，再过8分钟后加入70mM柠檬酸终止反应，放射免疫试验测定5-HETE的水平。筛检30μM的化合物。用NDGA(去甲二氢愈创木脂酸)作为标准参比试剂。

表12：倍半萜类5-脂肪氧合酶和磷酸二酯酶PDE4抑制生物试验

 

化合物代码物种n＝浓度抑制(％)脂肪氧合酶5-LOCIR-55精油人2100μg/ml99CIR-63醚萃取物人2100μg/ml101CIR-65倍半萜类人2100μg/ml99磷酸二酯酶PDE4CIR-55精油人2100μg/ml73

n＝试管数

白介素-5(IL-5)是变态反应性疾病中释放的一种主要介质，在细胞试验中测定式1的倍半萜类化合物对白介素-5(IL-5)释放的抑制作用，抑制曲线分别见图6和图7所示。这些生物试验所得结果如下表13所示。

对于人IL-5介质释放试验，在培养箱中将试验化合物与伴刀豆球蛋白A(ConA)(10μg/ml)-刺激的人外周血单核白细胞(PBMNL)在生长培养液RPMI-1640(pH7.4)中37℃孵育过夜。使用夹心法ELISA试剂盒定量测定条件培养液中IL-5细胞因子的产生水平。10、1、0.1、0.01和0.001μM下筛检化合物。将这些相同的浓度并行应用于独立的处理组细胞，并评价只观察到显著的释放抑制作用时可能的化合物诱导的细胞毒性。用地塞米松作为标准参比试剂。

此外，用式1的化合物进行Con-A细胞毒性试验，其抑制曲线见图2所示。

对于ConA-诱导的介质释放/细胞毒性试验，在伴刀豆球蛋白A(ConA，20μg/ml)的存在下，将试验化合物和/或运载体与人外周血单核白细胞的悬浮液(PBMNL，1 x 10⁵/孔)在RPMI缓冲液(pH7.4)中37℃下5％CO₂中孵育过夜。加入Alamar蓝反应试剂，37℃下孵育细胞16小时。活细胞能摄取Alamar蓝并发射荧光。采用SpectraFluor Plus平板读数仪测定荧光强度，530nm处激发，590nm处发射。与运载体处理的对照组相比，荧光强度降低50％或更多(50％)提示存在显著的细胞毒性。10、1、0.1、0.01和0.001μM下筛检化合物。用地塞米松作为标准参比试剂。

上述试验的对照分析(使用DMSO)的结果见图3所示。

表13：倍半萜类化合物(1)对介质释放的抑制

 

主要的细胞试验物种浓度标准ANT.EC₅₀介质释放，IL-5人100μg/ml±50％9316.1μM

ANT＝拮抗剂

白介素-5(IL-5)介质释放的抑制试验中，化合物的IC₅₀为16.1μM。各实验中使用100μM浓度的活性化合物，白介素-5(IL-5)介质释放抑制试验观察到93％的抑制。

进行上述生物试验时观察到活性化合物的细胞毒性有限，如表14所示，见IC₅₀与EC₅₀值。虽然介质释放试验期间观察到具有部分细胞毒作用，但纯的式1化合物的效力是因为其能有效结合糖皮质激素受体(GR)位点。

表14：倍半萜类(1)的细胞毒性概况

ANT＝拮抗剂；n＝试管数

如实施例2所述通过蒸汽蒸馏干燥的根茎获得精油，采用5-脂肪氧合酶(5-LO)试验和磷酸二酯酶PDE4试验进行筛检，以确定其抑制作用。5-LO试验观察到99％抑制，而磷酸二酯酶PDE4试验则观察到73％抑制，提示精油具有支气管扩张作用，可用于抑制5-脂肪氧合酶的作用。所得结果也可参见上述表12。

实施例5

以类似于实施例1的方式制备二乙醚萃取物。将植物安赛皮非洲美花姜种的根茎进行洗涤，切片，40℃烘箱干燥，然后研磨成粉。将1升去离子沸水加入25.0g烘箱干燥的研磨根茎中，偶尔搅拌静置1小时。将水过滤并用二乙醚(4 x 500ml)萃取。从水层分离醚层，合并，干燥(MgSO₄)，过滤，于25℃的温度下在水浴中通过旋转蒸发的方式除去溶剂。得到215mg有机萃取物。对该二乙醚萃取物进行测试。

采用LC-MS(联用液相色谱-质谱)，对从水相萃取物(参见上述实验过程)制备的二乙醚馏份作化学指纹测定表明存在主要化合物，即式1的倍半萜类。用乙酸乙酯-己烷(1:9，v/v)作为洗脱液，快速色谱法(硅胶)纯化二乙醚萃取物，得到式1的倍半萜类化合物。

实施例6：NF-κB转录生物学试验

进行试验并使用参比标准品作为各个试验的内标，以确保所得结果的有效性。试验过程在Lenardo MJ，Baltimaore D.Lenardo MJ，Baltimaore D，NF-κB：可诱导的多效介质和组织特异性基因控制(A pleiotropic mediator of inducible andtissue specific gene control).Cell.58：227-229，1989中的描述，将其内容纳入本文作为参考。

在NF-κB转录试验中评价从研磨植物直接制备的二乙醚萃取物(图1)(WG-I-94B)的抗炎特性(方案如下所述)。观察到显著的抑制活性，试验中浓度一直到100μg/mL，IC₅₀的估计值为14.3μg/mL(参见下表15)而没有细胞毒性。试验中用环孢菌素A作为参比化合物(IC₅₀为0.0608μM)(参见下表15)。抑制作用和细胞毒性结果如表16所示，浓度反应曲线见图8和9所示。基于这些结果，认为二乙醚萃取物能有效抑制NF-κB。

表15：醚萃取物(WG-I-58A)对NF-κB转录因子的抑制作用

 

化合物IC₅₀N_H二乙醚萃取物(WG-1-58A)  14.3μg/mL2.24环孢菌素A0.0608μM0.751

在NF-κB转录应答细胞试验中观察到显著的抑制活性而没有细胞毒性作用，而能抑制引起哮喘炎症途径的各种促炎和炎症介质的释放。

表16：二乙醚萃取物(WG-I-58A)对NF-κB转录因子的细胞毒性和抑制作用，剂量反应

ANT＝拮抗剂；n＝试管数

实施例7：化合物1对NF-κB转录因子的抑制作用

1.实验方法

将安赛皮非洲美花姜种植物的新鲜根茎和根(300g)用水洗涤并空气干燥。从根茎分离新鲜的根。将根碾碎并将根茎切成厚约2-3mm的切片。将根和根茎在蒸汽蒸馏装置中进行蒸汽蒸馏3小时。用去离子水冲洗冷凝器中形成的结晶并通过垂熔玻璃漏斗过滤。该结晶的结构见图1所示(样品编号：WG-I-94B)。

使分液漏斗冷凝物中精油和水的混合物在室温下静置18小时。通过引流冷凝物取下表面上得到的包含式1化合物的结晶并用垂熔玻璃漏斗过滤。总共获得240mg结晶。对结晶进行测定。

式1

WG-I-94B

2.生物学试验

在台湾MDS药物公司(MDS Pharma)进行试验，每次试验采用参比标准品作为内标以确保所得结果的有效性。

在NF-κB细胞转录应答试验以及相应的NF-κB细胞转录应答的细胞毒性试验中评价式1化合物的抗炎特性(参见附件I的方案)。NF-κB细胞转录应答试验中，100μM时化合物导致>100％抑制，同一浓度下没有明显的细胞毒性。表明该化合物对NF-κB细胞转录的抑制作用不是由于普遍的细胞毒性。该试验计算的IC₅₀为15.6μg/mL，用环孢菌素A作为参比化合物(IC₅₀为0.0608μM)。结果和浓度反应曲线如附件II所示。基于这些结果，认为式1的化合物能有效抑制NF-κB。

3.有益特性

在体外试验中评价从安赛皮非洲美花姜种分离的倍半萜类化合物在慢性炎症疾病如哮喘中所起的中心作用。在NF-κB细胞转录应答试验中观察到显著的抑制活性而没有细胞毒性作用。因此，可使用化合物(从新鲜制备的根和根茎蒸汽蒸馏分离的)来抑制NF-κB转录应答的特异性活性，从而抑制引起哮喘炎症途径的各种促炎和炎症介质的释放。NF-κB是炎症主要调节因子，因而在药物开发中是吸引人的靶标。

实施例8：转录应答，NF-κB(人)

试验数量：361000

介绍：

在静息细胞中，核转录因子NF-κB的胞质部位与抑制亚单元IκB结合；IκB的这种结合可有效掩蔽NF-κB的P50和P65亚基上存在的核位置序列，防止核易位。显然，一旦刺激细胞，可激活信号转导途径，导致IκB多肽中的关键丝氨酸残基磷酸化，于是NF-κB-IκB复合物解离，IκB快速降解，未掩蔽的核位置信号允许NF-KB易位到核内而激活特定基因的转录。已知NF-κB能调节活化白细胞产生的许多促炎和凝血酶原因子。NF-κB是炎症主要调节因子，因而在药物开发中是吸引人的靶标。

方案：

采用以反应元件-lacZ报告基因进行转染的人T淋巴细胞Jurkat细胞，其中β-半乳糖苷酶基因的转录由NF-κB转录因子的结合位点所介导。在0.5μM A23187和50ng/ml PMA(12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐)的存在下，将试验化合物和/或运载体与细胞(1.5 x 10⁶/ml)在RPMI-1640pH7.4中37℃下孵育4小时。通过FDG(荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷)向荧光素的转化来测定试验化合物-诱导的β-半乳糖苷酶活性。在SpectroFluorPlus平板读数仪上读取荧光强度。与10μM环孢菌素A相比，荧光强度降低50％或更多(≥50％)表明显著的抑制活性。在10、1、0.1、0.01和0.001μM下筛检化合物。以相同的浓度并行应用于不同的处理组细胞，只有当观察到显著的刺激或抑制作用时评价化合物可能诱导的细胞毒性(目录#361100)。

参比数据：抑制剂IC₅₀(nM)

^*表示所用的标准参比试剂。

表17：试验结果-化合物1(WG-I-94B)的细胞毒性和效力(转录应答)结果

*批次：表示在相同试验中并行测试的化合物部分可溶的体外测试溶剂

◆表示该项符合显著性标准

Ag＝激动剂；ant.＝拮抗剂；Resp.＝应答；ND＝未进行试验测定；R＝附注

实施例9：醚萃取物在哮喘大鼠体内模型中的作用

背景

存在的许多细胞因子已知是炎症介质，参与哮喘疾病过程。当吸入致病因子如变应原时，支气管上皮细胞被激活而产生某些促炎细胞因子(白介素，缩写为IL)，尤其是趋化因子IL-8。

从过去体外试验的结果，选择合适的动物模型来确定安赛皮非洲美花姜种植物的二乙醚萃取物(WG-I-101)的抗哮喘和抗过敏活性。

实验方法

将植物安赛皮非洲美花姜种的根茎进行洗涤，切片，40℃烘箱干燥，然后研磨成粉。将5升二乙醚加入110.40g烘箱干燥的研磨根茎中，偶尔搅拌静置1小时。将二乙醚过滤并用二乙醚(4 x 2L)萃取。合并醚层，干燥(MgSO₄)，过滤，并于25℃的温度下在水浴中通过旋转蒸发的方式除去溶剂。得到1.075g有机溶剂萃取物。对该二乙醚萃取物进行测试(样品编号：WG-I-101)。

生物学试验

在台湾MDS药物公司进行试验，每次试验采用参比标准品作为内标以确保所得结果的有效性。采用的生物学试验是肺部、抗原/脂肪氧合酶代谢产物试验，并用体内试验评价安赛皮非洲美花姜种植物二乙醚萃取物的可能活性。

(1)试验物质和给药模式

将WG-I-101悬浮在0.5％CMC/0.1％吐温80中。每天两次，连续3天口服给予剂量500mg/kg的试验物质，试验当天用卵白蛋白攻击前1小时加入额外的最终剂量。给药体积为10ml/kg。该制剂总结如下：

 

试验化合物      运载体溶解度(a)颜色    避光保护(b)   温度(c)       公式mg/mlWG-I-101        0.5％    CMC/0.1％吐温80   I 棕色    Y RT  50  

(a)此试验基于视觉观察

S：可溶；I：不溶  ppt：沉淀

(b)Y：将式I化合物置于棕色试管或小瓶中，或覆盖铝箔

(c)TR：室温；15℃～30℃下制备和储存

规定整个试验期间的温度，低于或高于室温。

(2)动物

使用由台湾国立大学医学院实验动物中心(National Taiwan University Collegeof Medicine)提供的雄性DH(Dunkin-Hartley)衍生豚鼠。动物的空间分配如下：3只豚鼠45 x 23 x 21cm。每个笼子经高压灭菌。使用之前，实验室将所有动物保持在受控的温度(22°-24℃)和湿度(60％-80％)环境中，12小时/白天黑夜循环持续至少一周。自由进食标准实验饲料(PMI营养国际有限公司(PMI Nutrition International，Inc.)，美国)和RO水。一般地根据实验动物护理和使用指南(Guide for the Care andUse of Laboratory Animals(国家学术出版社(National Academy Press)，华盛顿，D.C.，1996))进行包括饲养、实验、处理动物等的所有工作。

(3)方法

使用5只重400±50g(最后那天)的DH衍生雄性豚鼠。用戊巴比妥纳(50mg/kg IP，需要时再给予15mg/kg IP)麻醉动物。将通过水浴水流保持在37℃的铝板置于试验动物身体下面以维持体温。气管插管，采用啮齿动物通气机(哈佛，美国)进行人工通气(10ml/kg，50呼吸/分钟)。经插管侧臂，使用气动脉冲换能器(美国纳可生物系统公司(Narco Biosystem，USA))测量气管内压力(ITP)。颈动脉插管(PE50，美国克雷亚当斯公司(Clay Adams，USA))，用Stathem P23 x L换能器(美国VS公司(Viggo-Spectramed，USA))测量血压，由导线II ECG获得心率。在第1天和第8天IP注射卵白蛋白(0.5μg/0.5ml/动物)和Al(OH)₃(1mg/0.5ml/动物)来致敏豚鼠。然后，在第19和23天之间用15μg/kg of卵白蛋白(IV)攻击动物，将支气管肺阻塞记录为ITP的升高程度。

每天2次，连续3天，口服给予500mg/kg试验物质，试验当天给予额外的最终剂量，然后在最终剂量后一小时，用“混合”的吲哚美辛(10mg/kg)、美吡拉敏(2mg/kg)和普萘洛尔(100μg/kg)静脉内注射动物(1ml/kg)，5分钟后再用卵白蛋白攻击。在运载体处理的动物中，抗原攻击导致的支气管阻塞反应(ITP升高)，是完全气管阻塞测得最大可能支气管阻塞的45-85％。与运载体处理的对照动物相比，认为对卵白蛋白诱导的支气管阻塞的抑制率达到50％或更高(≥50％)具有显著性差异。用5ml磷酸缓冲盐水灌注2次之后，回收支气管肺泡灌洗液。卵白蛋白攻击后用ELISA测定支气管肺泡灌洗液(BALF)上清液中的TNF-α、IL-1β和IL-8。单向ANOVA分析后Dunnett’s检验，对运载体对照组和试验化合物处理组进行比较。认为P<0.05具有显著性。

(4)体内试验结果

该试验结果总结在表18中，显示与运载体处理的对照组相比，二乙醚萃取物(WG-I-101)对卵白蛋白诱导的急性气道阻塞具有适度抑制作用(19％)(表18)。(认为≥50％抑制具有显著性)

表18：豚鼠体内试验结果

试验#570000肺，抗原/脂肪氧合酶代谢产物，豚鼠

气管内压力(ITP)

用美吡拉敏2mg/kg，吲哚美辛10mg/kg和普萘洛尔0.1mg/kg预处理先前已致敏的麻醉和人工通气豚鼠5分钟；口服给药3天后记录动脉血压(BP，mm Hg)，心率(HR，搏/分钟)和气管压力(TP，cm H2O)。长期给药结束时，记录高于最初基线6cm H2O的抗原(卵白蛋白15μg/kg IV)-诱导的气管内压力(ITP)的升高，作为支气管阻塞的指标。根据公式[气管内压力升高(运载体处理组)]-[气管内压力升高(试验物质处理组)/[气管内压力升高(运载体处理组] x 100％，计算抑制百分率(％)。

1.ΔITP：超过对应的基线值的ITP变化；(-)卵白蛋白：在卵白蛋白攻击前对单独的运载体或试验物质的反应；(+)卵白蛋白：卵白蛋白攻击后反应的变化。

2.％对照：对试验物质的ITP反应，以运载体处理对照对卵白蛋白(15μg/kg IV)的ITP反应的百分比表示(100％)。

3.与运载体处理的对照相比，认为对卵白蛋白诱导的支气管阻塞的抑制作用为50％或更高(≥50％)是显著的。

制备WG-I-101-处理组的支气管肺泡灌洗液(BALF)样品，测定卵白蛋白攻击后的TNF-α、IL-1β和IL-8。单向ANOVA后作Dunnett’s检验，对运载体对照与试验化合物处理组进行比较。P<0.05认为具有显著性差异。WG-I-101导致豚鼠卵白蛋白攻击后IL-8产生相对于对照的显著抑制(P<0.05)，但对TNF-α和IL-1β分泌没有显著性作用。结果如表19所示。

表19：细胞因子表达结果

制备WG-1-101处理组的支气管肺泡灌洗液(BALF)样品，测定卵白蛋白攻击后的TNF-α、IL-1β和IL-8。分别用TNF-α、IL-1β和IL-8的ELISA试剂盒来测定每个样品的TNF-α、IL-1β和IL-8水平。单向ANOVA后作Dunnett′s检验，对运载体对照和试验化合物处理组之间进行比较。P<0.05认为具有显著性差异。

实施例10：肺，抗原/脂肪氧合酶代谢产物

试验数：570000

方法：

用戊巴比妥钠(50mg/kg i.p.，需要时再加15mg/kg i.p.)麻醉每组5只重250±50g的雄性DH豚鼠，然后给予氯化琥珀酰胆碱(2mg/动物i.p.)以防止自发呼吸。体温维持在37-38℃。

在封闭系统中进行气管插管并用哈佛啮齿动物呼吸机给豚鼠通气。通过连接于P23ID Statham换能器的插管侧臂记录气管内压力。呼吸速率设定为50次/分钟，每次体积(约1ml/100g)足以产生6cm H₂O的基线气管压力。从颈动脉插管监测平均动脉压，从导线II设置的胸电极获取心率。颈静脉插管，静脉内给予体积1ml/kg的运载体或药物。

通过抗原攻击预先致敏的动物激活脂肪氧合酶并产生白三烯。第1天注射卵白蛋白和Al(OH)₃(0.5μg和1mg，体积分别为0.5ml/动物i.p.)致敏豚鼠，第8天用同样剂量的卵白蛋白和Al(OH)₃加强，第19和23天之间用卵白蛋白(50μg/kgi.v.)攻击以实现诱导的最大气道阻塞，表现为气管压力升高(cm H₂O)。并且，气管压力升高可能与呼吸系统僵硬增加有关。口饲CSIR化合物预处理动物两天。试验当天，麻醉30分钟前给予动物CSIR化合物，手术持续15分钟。给予CSIR后60分钟给予卵白蛋白攻击。给予试验物质前5分钟，静脉内给予吲哚美辛(10mg/kg)、美吡拉敏(2mg/kg)和普萘洛尔(0.1mg/kg)预处理动物：这是一种＂混合＂制剂，能够抑制环氧合酶产物(血栓素等)的产生及拮抗组胺和β-肾上腺素能受体。在运载体处理的对照动物中，抗原攻击导致的气道收缩反应是气管阻塞时可能的最大气道收缩的45-85％。

在5只豚鼠中，卵白蛋白攻击前5分钟静脉内给予阳性标准品菲尼酮(30mg/kg)。认为与运载体处理的对照动物相比，诱导的气道阻塞抑制率为50％或更高(≥50)是显著的。

参考数据：   化合物             MED mg/kg i.v。

^*采用的标准参比试剂

LY-171883＝1[2-羟基-3-丙基-4-[4-(1H-四唑-5-基)丁氧基]苯基]乙酮；NDGA＝去甲二氢愈创木脂酸

注意：

试验物质在该模型系统中具有活性表明可能能够抑制体内脂肪氧合酶的活性和/或拮抗受体激活产生的白三烯。因此，希望将该模型系统的结果与获自以下结果进行比较：比较环氧合酶抑制以确定酶抑制的特异性；比较白三烯D₄拮抗作用以确定相对于脂肪氧合酶抑制，试验物质对酶终末产物受体激活的作用；以及比较抗胆碱能活性和/或抗组胺H₁和H₃活性以确定对受体拮抗作用和/或支气管扩张作用的选择性。

表20：上文表1所示化合物的IUPAC命名

 

普通名称IUPAC命名α-蒎烯2，6，6-三甲基双环(3.1.1)庚-3-烯桧萜4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)双环(3.1.0)己烷香叶烯7-甲基-3-亚甲基-1，6-辛二烯δ-3-蒈烯3，7，7-三甲基双环(4.1.0)庚-3-烯α-萜品烯1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1，3-环己二烯B-水芹烯3-甲基-6-(1-甲基乙基)环己烯顺-罗勒烯3，7-二甲基-(Z)-辛三烯(octatriene)反-β-罗勒烯3，7-(E)-二甲基辛三烯γ-萜品烯1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1，4-环己二烯别-新-罗勒烯2，6-二甲基-(E，E)-2，4，6-辛三烯别-罗勒烯2，6-二甲基-(E，Z)-2，4，6-辛三烯β-榄香烯1-乙烯基-1-甲基-2，4-bis(1-甲基乙烯基)-(1S-(1-α，2-β，4-β))-环己烷                                               大根香叶烯-D1-甲基-5亚甲基-8-(1-甲基乙基)-(S-(E，E))-1，6-环十碳二烯(cyclodecadiene)                                     野缬草烷八氢-1，3，3，6-四甲基-(1S-(1-α，4-α，5a-β，6-α，8a-α))-1，4-乙醇-1H-环戊(c)氧杂环庚三烯(oxepin)                     大根香叶烯-B1，5-二甲基-8-(1-甲基乙基idene)-(E，E)-1，5-环十碳二烯

本发明的萃取物是从天然形式分离的非甾体组分，具有与常用于预防性治疗变态反应性疾病如哮喘和特应症的甾体组分相同的作用模式。

此外，本发明式1的倍半萜类化合物具有白三烯调节剂活性，能抑制炎症介质和白三烯的作用。

以精油形式应用时，萃取物具有组合效果，通过支气管扩张，抑制白三烯生物合成以及下调糖皮质激素受体而减轻哮喘和变态反应炎症。

此外，包含本发明式1倍半萜类化合物的二乙醚萃取物在NF-κB转录应答细胞试验中具有显著的抑制活性而没有细胞毒作用。因此，二乙醚萃取物可用于抑制NF-κB转录应答的特异性活性，从而抑制引起哮喘炎症途径的各种促炎和炎症介质如细胞因子白介素-8(IL-8)的释放。

此外，包含本发明式1倍半萜类化合物的二乙醚萃取物对引起哮喘炎症途径的IL-8炎性细胞因子的产生具有显著的抑制作用。

本发明对总体预防性治疗和减轻变态反应性疾病如哮喘有效，增加了控制这些疾病的有用手段。

对于本说明书的目的减轻变态反应性疾病和哮喘具体限定为对象处在无需进行常规治疗的无症状阶段。此缓解阶段比采用常规治疗控制诸如哮喘等变态反应性疾病所获得的时间要长。

申请人还认为，有机溶剂萃取物、干燥根茎、精油或单一式1的化合物形式的本发明，可单独使用或联用，或作为组合物使用，提供了使用甾体抗炎药如糖皮质激素来长期预防性治疗和减轻变态反应性疾病，尤其是哮喘和特应症的替代方式。

申请人已知的作用于糖皮质激素受体水平的市售试剂通常是甾体类型，长期使用存在许多有害的副作用。本发明的化合物、衍生物、组合物和产物是非甾体类型，意外地发现也能有效作用于糖皮质激素受体(GR)水平。