一种炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体

摘要

本发明属于微生物基因工程技术领域。具体涉及一种炭疽芽孢杆菌保护性抗原的突变体及其编码蛋白。所述突变基因的序列及其编码的突变蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。经过生物学验证，该突变体蛋白完全丧失细胞毒性，且能够抑制野生型致死毒素的细胞毒性。

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种突变的炭疽芽胞杆菌保护性抗原的基因及其编码蛋白。

发明背景

炭疽病(anthrax)是由革兰氏阳性的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)引起的人，畜和野生动物共患的一种急性、热性、败血性传染病。因为可引起皮肤等组织发生黑炭状坏死，故称为“炭疽”。1849年德国著名学者考克首先发现了炭疽芽胞杆菌，其后炭疽曾在世界各处多次散发或暴发。炭疽病不仅给人类生命健康带来威胁，更为世界的畜牧业带来巨大的经济损失。

炭疽病的致病因子主要包括由内生质粒pOX-1编码的细菌荚膜和由质粒pOX-2编码的外毒素。前者的组成为带负电荷的多聚D谷氨酸，它能够抵御吞噬细胞的吞噬作用以及血清中的阳离子的降解，从而使菌体细胞能够在体内大量繁殖。后者是炭疽芽胞杆菌主要的致病因子，由保护性抗原(PA，83kDa)，致死因子(LF，90kDa)和水肿因子构成(EF，89kDa)组成。PA主要作用是与细胞表面特定的受体结合，并转运LF和EF进入细胞。LF是有776个氨基酸残基构成的锌离子依赖型的金属蛋白酶，能够特异性结合并且切割有丝分裂蛋白激激酶家族(MAPPK)的N端，如MEK1，MEK2，MKK3，MKK4，MKK6，和MKK7。MAPKK的切割进一步阻断了包括细胞外信号调节激酶(ERK)，p38和JNK等细胞信号转导途径，进而导致细胞裂解(Duesbery and Vande Woude1999；Vitale，Blanset et al.2006)。EF是由767个氨基酸组成的一种依赖与钙离子的腺苷酸环化酶，能够催化细胞内的ATP转化为cAMP(Collier and Young2003)，使得细胞内外水份失衡进而导致水肿。在致病时，炭疽毒素的单一成分不能发挥作用，水肿因子或致死因子必须与保护性抗原结合成水肿毒素(EF+PA，EdTx)或致死毒素(LF+PA，LeTx)才具有致病作用。炭疽毒素致病的过程为：保护性抗原与细胞表面的受体肿瘤内皮标志物8(TEM-8)或毛细管形态生成蛋白2(CMG-2)结合(Bradley，Mogridge et al.2001；Scobie，Rainey et al.2003)后，被细胞表面弗林类酶特异性地切割后释放出氨基端20kDa(PA20)的多肽片段，剩下的结合于受体的63kDa(PA63)形成一个七聚体，然后七聚体自发地结合LF或EF或同时结合LF和EF，形成一个多聚体复合物。该复合物在细胞表面辅助受体LPR6的协助下，内吞入胞内。内吞体在胞内酸性环境的诱导下，PA63发生构象重排，插入到内吞体膜中，形成一个通道。此时，结合于七聚体的EF或者LF在离子梯度和跨膜正电势差的作用下被拉入孔道，进入受体细胞，进而发挥致病作用(Young and Collier 2007)。

目前针对炭疽病治疗的药物主要是抗生素和保护性抗原特异性的抗血清。前者主要包括青霉素，四环素，链霉素，脱氧土霉素，乙酰红霉素，环丙沙星等，后者主要是来源于志愿者的血清。这些传统的药物和治疗手段存在诸多的缺陷：第一抗生素治疗只能杀掉体内感染的炭疽芽胞杆菌菌体，而对于存在巨大潜在危害的芽胞却无能力；第二，对于感染后期的人，因大量的外毒素已经分泌到血液中，抗生素并不能将其清除；第三，因为目前大量的抗生素的使用导致病原菌都出现了很强的耐药性，第四，对于治疗炭疽病，这些抗生素都需要很大的剂量，并不适用于那些对抗生素过敏的特殊人群。而抗血清治疗虽然能够清除分泌到血液中的炭疽外毒素，但也存在譬如血清来源有限，患者注射后出现过敏反应等诸多问题。因此开发新型高效安全的炭疽病治疗药物已成为全球面临的挑战和各个国家研究的热点(Baillie 2006)。

随着人们对炭疽芽胞杆菌致病分子机制的深入认识，很多治疗靶点已经被利用来开发新型的炭疽治疗药物，这些药物主要是通过干扰或者阻断外毒素的作用途径而发挥功能。目前已经开发的抗毒素药物有一下几种：第一，阻断保护性抗原与与受体结合，主要包括PA的单克隆抗体和可溶性的受体分子，它们通过与细胞表面的两类受体竞争结合PA而发挥作用；第二，阻断PA的激活类试剂，主要是人工合成的D型精氨酸六聚体，它能够抑制细胞表面弗林类酶的活性，从而阻断PA的激活；第三，干扰LF或EF结合PA63的七聚体，主要有LF或EF单克隆抗体，LF结合功能域(LFn)的多聚体，人工合成的寡肽等；第四，阻断毒素的转运，包括能够与野生型的PA结合并形成七聚体但能阻止H⁺诱导的跨膜通道的形成，以及一些能够堵塞七聚体形成的跨膜通道的小分子物质；第五，阻断致死因子和水肿因子的作用，包括这些酶作用的底物类似物和酶的小分子抑制剂。目前这些药物基本都处于细胞水平试验或小动物水平的研究(Raineyand Young 2004)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，通过体外诱变，结合高通量筛选，获得炭疽芽胞杆菌保护性抗原蛋白突变体。体外细胞毒性分析表明，该突变体细胞毒性丧失，但能够抑制野生型炭疽芽胞杆菌保护性抗原的细胞毒性。

本发明提供了一种新型的炭疽抗毒素蛋白。

具体地，申请人提供了一种炭疽芽胞杆菌保护性抗原的突变体基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所述，序列全长为2208bp，编码735个氨基酸。在该序列表的SEQ ID NO：1的1130bp处有1个T1310-A1310的碱基突变。

基于上述基因的序列，申请人明确了这种炭疽芽孢杆菌保护性抗原的突变体蛋白氨基酸序列，其具有如序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，在该氨基酸序列的第377位有1个氨基酸突变，即由缬氨酸突变为谷氨酸。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体基因和编码的蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列；

图1：是本发明实施例1中pGEX-PA质粒图谱；

图2：是本发明实施例4的突变体库的构建过程；

图3：是本发明实施例1纯化的炭疽芽胞杆菌保护性抗原(PA)SDS-PAGE分析；

图4：是本发明实施例6纯化的炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体(mPA)SDS-PAGE分析；

图5：是本发明实施例6炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体(mPA)细胞毒性分析；

图6：是本发明实施例6炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体(mPA)体外抗毒素分析；

图7：是本发明实施例1中载体pGEX-KG图谱；

具体实施

实施例1 炭疽芽胞杆菌保护性抗原基因的克隆与蛋白的制备

本发明中涉及炭疽芽胞杆菌保护性抗原基因Pag的克隆及其相关突变体的克隆，其主要操作包括：

(1)引物设计与合成

根据NCBI GENEBANK公布的pag基因核苷酸序列(登录号：YP_016495)设计合成如下引物对：正向引物(PA-F’)：5’-ATTGGATCC GAA GTT AAA CAG GAG AAC-3’，包含BamHI限制性酶切位点(下划线为酶切位点)；反向引物(PA-R’)：5’-ACCG CTCGAG TTA TCC TAT CTC ATA GCC-3’，包含XhoI限制性酶切位点(下划线为酶切位点)。上述引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

(2)模板制备

将兽用炭疽芽孢杆菌芽孢疫苗(该菌种购自于新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)用5mL的LB培养基(1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母粉，pH7.0)，培养过夜后，收集1.5mL的菌液，12000rpm离心1min收集菌体，然后用去离子水洗涤一次后再次离心收集，加入500L的去离子水重悬菌体后，置于100℃沸水浴，5分钟后离心取上清冻存于-20℃，作为扩增Pag的模板使用。

(3)PCR扩增

PCR体系如下：

10×PCR缓冲液(购自宝生物工程(大连)有限公司，即TAKARA公司，下同)

模板                                     5μL

dNTP(10mM)                               1μL

模板                                     1μL

正向引物PA-F’(10μM)                     1μL

反向引物PA-R’(10μM)                     1μL

Pfu DNA聚合酶(购自TAKARA公司)            1μL

加去离子水至50μL。

PCR条件：95℃预变性4min；95℃，40s；55℃，30s；72℃ 2s 30min，30个循环；72℃延伸10min，4℃ 5min。

(5)酶切PCR产物和表达载体pGEX-KG

PCR产物用限制性内切酶Bam HI-XhoI酶切，酶切反应体系为：酶解缓冲液，5μL；BamHI，，2μL；XhoI，2μL(上述试剂均购自TAKARA公司)；PCR产物，41μL。混匀后置于37℃保温6小时。表达载体pGEX-KG，图谱见图7(农业微生物学国家重点实验室动物细菌学实验室郭爱珍教授惠赠)酶解体系和条件同上一致。

(6)DNA凝胶回收

本发明中涉及到的DNA的纯化均使用试剂盒QIAquick GEL Extraction Kit(购自德国Qiagen公司)，操作参照产品说明书。具体过程是：在紫外灯下将目的条带切下来后至于1.5mL的离心管中，每100mg加入300μL的QG缓冲液(上述试剂盒自带)，加50℃水浴锅温浴8min，直到凝胶全部融化。将溶胶液加入到吸附管12000rpm，4℃离心1min，加入750μL PE缓冲液离心洗脱1min，加入50μL去离子水洗脱收集DNA。

(7)连接

连接体系：

10X连接酶缓冲液                      1μL

双酶切的PCR产物                      6μL

双酶切的载体                         2μL

T₄DNA连接酶(购自TAKARA公司)          1μL

混匀后，16℃保温过夜。

(8)转化

将连接混合物与100μL大肠杆菌感受态细胞coli DH5α混合，冰浴放置30分钟，再42℃处90秒，加800L LB培养基37℃保温45min，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素固体LB平皿，37℃培养14小时，挑取转化子并且抽提质粒。

(9)序列分析

以pGEX-KG载体的通用引物(5-GGCAAGCCACGTTTGGTG3)为测序引物，以步骤(8)中的质粒为模板进行测序(由上海生工生物工程技术有限公司完成)。构建好的表达载体图谱如图1所示，命名为pGEX-PA。

实施例2 炭疽芽孢杆菌保护性抗原蛋白的表达、纯化与分析

(1)重组蛋白的表达

将重组质粒pGEX-PA转化到宿主细胞大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(操作步骤参照实施例1中的转化部分)。将过夜活化的转化子以1％体积的接种量转接至1L含100μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃培养2-3hrs，使OD600达到0.6-0.7，加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mM，15℃ 200转/分钟培养8小时。离心收集菌体，然后用PBS缓冲液(140.0mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10.0mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸氢二钾，pH 7.4)洗涤一次，再用50mL PBS缓冲液悬浮，然后用高压细胞破碎仪(购自美国THERMO公司)破碎细胞。细胞破碎液于4℃、12000转/分钟离心30分钟，收集上清。

(2)蛋白的纯化

本发明利用还原性谷胱甘肽(GST)(Nilsson，Stahl et al.1997)亲和纯化重组蛋白PA以及突变体，具体操作步骤如下(所有操作均在4℃进行)：

1)装柱：取2mL亲和填料GSH Sepharose 4B(购自Amersham-Pharmacia公司)层析柱中，用50mL PBS缓冲液洗脱平衡；

2)结合：将细胞破碎液的上清以1.0mL/min的流速过柱；

3)流洗：用100mL PBS缓冲液洗脱没有结合的杂蛋白，流速控制在1.0mL/min以下；

4)酶解：取10μL浓度为10unit/μL的凝血酶(Thrombin)(购自Merck公司)与1mL的PBS缓冲液混匀，加入层析柱酶切混匀后4℃酶解16小时；

5)收集蛋白：收集步骤(4)中PBS缓冲液至1.5mL的离心管中，再加1mL PBS缓冲液第二次洗脱收集；

6)去除凝血酶：将步骤(5)中收集的蛋白经过苯甲脒琼脂糖凝胶(购自Amersham-harmacia公司)去除Thrombin；

(3)本发明中检测炭疽芽孢杆菌保护性敏感抗原及其突变体所用到的致死因子(LF)的制备方法参照文献4(Cao，Liu et al.2008)。

(4)纯化蛋白的检测和定量

本发明中涉及到蛋白的检测均使用12％的SDS-PAGE分析。配方如下：

浓缩胶浓度为5％：

ddH₂O                             1.4mL

30％ Acr-Bis(体积比29:1 )         0.33mL

1M Tris-HCL，pH8.8                0.25mL

10％十二烷基磺酸钠(SDS)           0.02mL

10％过硫酸铵                      0.02mL

四甲基二乙胺(TEMED)               0.002mL

分离胶浓度为12％：

ddH₂O                             1.6mL

30％ Acr-Bis(体积比29:1)          2mL

1M Tris-HCL，pH8.8                1.3mL

10％ SDS                          0.05mL

10％过硫酸铵                      0.05mL

四甲基二乙胺(TEMED)               0.002mL

检测方法：取10μL纯化的蛋白样品，加等体积的蛋白上样缓冲液(2×上样缓冲液配方：100mm/LTris-C1(pH6.8)，200mm/L二硫苏糖醇，4％ SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)，沸水浴5-10min，然后上样10μL，以低分子量的蛋白Marker作为对照(购自FERMENTAS公司)。纯化的PA SDS-PAGE结果见图3所示。

(5)蛋白浓度的测定

本发明中涉及到的蛋白质的定量均使用Bradford蛋白定量检测试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限责任公司)。具体步骤如下：

1)取4μL蛋白标准品(购自上海生工生物工程技术有限公司)加PBS缓冲液稀释至100μL，使终浓度为200μg/mL。

2)取稀释后的标准品按0，1，2，4，6，8，10，15μL分别加到96孔板中，加PBS缓冲液补足至20μL，每孔蛋白含量分别为0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2和3μg，每个梯度重复3次。

3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS缓冲液到20μL，重复3次。

4)各孔加入200μL Bradford Reagent，混匀，室温放置5min。

5)用预热的酶标仪(Thermo Scientific公司)测定A595值。

6)绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。

实施例3 细胞培养与细胞毒性检测

小鼠的单核细胞系RAW264.7(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)用含10％胎牛血清(购自杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM高糖培养基(购自美国Promega公司)在37°C，含5％CO₂，95％空气的培养箱(购自日本SANYO公司)中培养。细胞传代用胰酶二乙胺四乙酸(EDTA)消化液(购自碧云天生物技术研究所)消化细胞后接种于96孔培养板(购自CORNING公司)，待细胞生长至每孔1.5×10⁴个细胞时，吸弃培养液，再加入100μL含有待检测样品的DMEM高糖培养基，继续培养三小时，然后每孔加入荧光染料ALamarBLue^TM(购自英国AbD Serotec公司)10μL，将培养板用铝箔包裹后置于培养箱中继续培养4h。采用酶标仪(购自美国BioTek公司)读取每孔的荧光值。读数参数为：激发光530nm，发射光590nm。细胞相对活性按照如下公式计算：

说明：对照孔为致死毒素(PA和LF各1.0μg/mL)处理；活细胞孔为不加毒素。

实施例4 炭疽芽孢杆菌保护性抗原突变体库的构建

本发明采用易错PCR的方法构建PA的突变体库，具体操作如下：

(1)根据功能域二两端的序列设计合成如下引物(Petosa，Collier et al.1997)：

PAD II-F：AAGTGCATCGCGTCGTTCTTTGATATTG，

PAD II-R：TCTTGAATTTGCGGTACCACTTCACTCCAG

正向引物PAD II-F和反向引物PAD II-R分别含有Sph I和Kpn I酶切位点(以下划线表示)。

(2)以实施例1中构建的载体pGEX-PA作为模板，PAD II-F和PAD II-R为引物，采用低保真度的Taq DNA聚合酶(购自于Clontech公司)扩增功能域II。PCR体系如下：

10×PCR缓冲液(购自TAKARA公司)              5μL

dNTP(10mM)                                 1μL

模板pGEX-PA                                1μL

PAD II-F(10μM)                             1μL

PAD II-R(10μM)                             1μL

低保真度的Taq聚合酶                        1μL

加无离子水至                               50μL

PCR条件：95℃预变性4min；95℃ 40s；55℃，30s；72℃ 1min，20个循环；72℃延伸8分钟，4℃5分钟。

(3)双酶切：将步骤(3)中的PCR产物和模板pGEX-PA用Sph I和Kpn I进行双酶切，并回收酶切产物。酶切产物回收后用T4连接酶连接，并将连接产物转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)LB培养板。所有转化子即为PA突变体库。本实施例中的具体操作如同实施例2，实施过程见图1所示。

实施例5 PA突变体筛选

突变体的筛选方法如下：

(1)挑取实施例4中的转化子接种于含有1.0mL LB培养基中(附加100μg/mL Amp，0.2mM IPTG)，固定于16℃的摇床，200rpm培养12小时，诱导蛋白的表达；

(2)向步骤(1)诱导后的菌液中加入10μL的E.coliT7噬菌体(购自Novagen公司)，37℃，200rpm继续培养约三小时，直到菌体完全裂解而澄清，即为细胞裂解液；

(3)将步骤(2)中的细胞裂解液置于4℃的离心机，12000rpm离心10min后，取上清并冻存于-20℃；

(4)吸取10μL裂解液上清与90μL含有1.0μg/μL致死因子LF(来源见实施例1所述)的DMEM高糖培养基混匀后，加入到接种有小鼠单核细胞系RAW264.7的96孔培养板，分析突变体的细胞毒性。操作方法同

实施例3；

(5)将步骤(4)中检测到的无毒性的突变体的裂解液10μL与90μL含有1.0μg/mL PA和1.0μg/L LF的DMEM高糖培养基混匀后，加入到接种有小鼠单核细胞系RAW264.7的96孔培养板，分析无活性突变体对野生型炭疽毒素的抑制作用。操作方法同实施例3；

(6)对步骤(5)中筛选到得的突变体进行序列分析；

以pGEX-KG载体通用引物(5-GGCAAGCCACGTTTGGTG-3)为测序引物，以步骤(5)中筛选到得突变体的质粒为模板进行测序。

实施例6 炭疽芽孢杆菌保护性抗原突变体的活性分析与体外抗毒素活性分析

(1)表达，纯化实施例5中获得的炭疽芽孢杆菌保护性抗原突变体(以下缩写为mPA)，具体操作步骤参照实施例1。纯化得到的mPA的SDS-PAGE分析结果如图.4。

(2)分别将0.1μg/mL，0.5μg/mL，1.0μg/mL，3.0μg/mL，5.0μg/mL的mPA与含有1.0μg/mL LF的DMEM高糖培养基混匀后，加入到接种有小鼠单核细胞系RAW264.7的96孔培养板，分析突变体的活性，操作方法同实施例3，结果如图5。

(3)分别将0μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，0.75μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL mPA与含有致死毒素(1.0μg/mL PA+1.0μg/mL LF)的DMEM高糖培养基混匀后，即mPA与PA的比例分别为0，0.25，0.50，0.75，1.00，2.00，加入到接种有小鼠单核细胞系RAW264.7的96孔培养板。分析mPA对野生型PA的抑制作用，操作方法同实施例3，结果如图6。

参考文献

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<120> 一种炭疽芽胞杆菌保护性抗原突变体

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<211> 2208

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<213> 炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2208)

<223>

<220>

<221> mutation

<222> (1130)..(1130)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2208)

<223>

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act tcc gct gat aat cat gta aca atg tgg gta gat gac caa gaa gtg     288

Thr Ser Ala Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val

               85                90                95

att aat aaa gct tct aat tct aac aaa atc aga tta gaa aaa gga aga     336

Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg

           100               105               110

tta tat caa ata aaa att caa tat caa cga gaa aat cct act gaa aaa     384

Leu Tyr Gln Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys

       115               120               125

gga ttg gat ttc aag ttg tac tgg acc gat tct caa aat aaa aaa gaa     432

Gly Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu

   130                135               140

gtg att tct agt gat aac tta caa ttg cca gaa tta aaa caa aaa tct     480

Val Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser

145               150               155               160

tcg aac tca aga aaa aag cga agt aca agt gct gga cct acg gtt cca     528

Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro

               165               170               175

gac cgt gac aat gat gga atc cct gat tca tta gag gta gaa gga tat     576

Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr

           180               185               190

acg gtt gat gtc aaa aat aaa aga actttt ctt tca cca tgg att tct      624

Thr Val Asp Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser

       195               200                205

aat att cat gaa aag aaa gga tta acc aaa tat aaa tca tct cct gaa     672

Asn Ile His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu

    210               215               220

aaa tgg agc acg gct tct gat ccg tac agt gat ttc gaa aag gtt aca     720

Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr

225               230                235               240

gga cgg att gat aag aat gta tca cca gag gca aga cac ccc ctt gtg     768

Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val

              245                250               255

gca gct tat ccg att gta cat gta gat atg gag aat att att ctc tca     816

Ala Ala Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser

           260               265               270

aaa aat gag gat caa tcc aca cag aat act gat agt caa acg aga aca     864

Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr

        275               280               285

ata agt aaa aat act tct aca agt agg aca cat act agt gaa gta cat     912

Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His

    290               295                300

gga aat gca gaa gtg cat gcg tcg ttc ttt gat att ggt ggg agt gta     960

Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val

305               310                315               320

tct gca gga ttt agt aat tcg aat tca agt acg gtc gca att gat cat      1008

Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His

              325                330               335

tca cta tct cta gca ggg gaa aga act tgg gct gaa aca atg ggt tta      1056

Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu

           340               345               350

aat acc gct gat aca gca aga tta aat gcc aat att aga tat gta aat      1104

Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn

       355               360               365

acc ggg acg gct cca atc tac aac gag tta cca acg act tcg tta gtg      1152

Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Glu Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val

    370               375               380

tta gga aaa aat caa aca ctc gcg aca att aaa gct aag gaa aac caa      1200

Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln

385               390               395               400

tta agt caa ata ctt gca cct aat aat tat tat cct tct aaa aac ttg      1248

Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu

              405                410               415

gcg cca atc gca tta aat gca caa gac gat ttc agt tct act cca att      1296

Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile

           420              425                430

aca atg aat tac aat caa ttt ctt gag tta gaa aaa acg aaa caa tta      1344

Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu

       435                440               445

aga ttg gat acg gat caa gta tat ggg aat ata gca aca tac aat ttt      1392

Arg Leu Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe

    450               455               460

gaa aat gga aga gtg agg gtg gat aca ggc tcg aac tgg agt gaa gtg      1440

Glu Asn Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val

465               470               475               480

gta ccg caa att caa gag aca act gca cgt atc att ttt aat gga aaa      1488

Val Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys

               485               490               495

gat tta aat ctg gta gaa agg cgg ata gcg gcg gtt aat cct agt gat      1536

Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp

           500               505               510

ca tta gaa acg act aaa ccg gat atg aca tta aaa gaa gcc ctt aaa       1584

Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys

        515               520               525

ata gca ttt gga ttt aac gaa ccg aat gga aac tta caa tat caa ggg      1632

Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly

    530                535               540

aaa gac ata acc gaa ttt gat ttt aat ttc gat caa caa aca tct caa     1680

Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln

545               550                555               560

aat atc aag aat cag tta gcg gaa tta aac gca act aac ata tat act     1728

Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr

               565               570               575

gta tta gat aaa atc aaa tta aat gca aaa atg aat att tta ata aga     1776

Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg

            580               585               590

gat aaa cgt ttt cat tat gat aga aat aac ata gca gtt ggg gcg gat     1824

Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp

       595                600                605

gag tca gta gtt aag gag gct cat aga gaa gta att aat tcg tca aca     1872

Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr

    610              615               620

gag gga tta ttg tta aat att gat aag gat ata aga aaa ata tta tca     1920

Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser

625               630               635               640

ggt tat att gta gaa att gaa gat act gaa ggg ctt aaa gaa gtt ata     1968

Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile

              645               650              655

aat gac aga tat gat atg ttg aat att tct agt tta cgg caa gat gga     2016

Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly

           660                 665                670

aaa aca ttt ata gat ttt aaa aaa tat aat gat aaa tta ccg tta tat     2064

Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr

        675                680                685

ata agt aat ccc aat tat aag gta aat gta tat gct gtt act aaa gaa     2112

Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu

   690                695               700

aac act att att aat cct agt gag aat ggg gat act agt acc aac ggg     2160

Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly

705               710               715                720

atc aag aaa att tta atc ttt tct aaa aaa ggc tat gag ata gga taa     2208

Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

              725                730              735

<210> 2

<211> 735

<212> PRT

<213> 炭疽芽胞杆菌(Baci llus anthracis)

<400> 2

Glu Val Lys Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser

1             5                 10                15

Gln Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro

           20                25                 30

Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser

       35                 40                45

Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Ala Ile

    50                 55                 60

Trp Ser Gly Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala

65                 70                75                 80

Thr Ser Ala Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val

               85                90                95

Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg

           100                105                110

Leu Tyr Gln Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys

        115               120                125

Gly Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu

    130                135                140

Val Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser

145                150                155                160

Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro

               165               170               175

Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr

           180                185                190

Thr Val Asp Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser

       195                200                 205

Asn Ile His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu

    210                215                220

Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr

225                230                235                240

Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val

              245                250               255

Ala Ala Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser

           260                265                270

Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr

        275                280               285

Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His

    290                295                300

Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val

305                310                315               320

Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His

               325                330              335

Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu

           340                345               350

Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn

        355               360                365

Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Glu Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val

    370                375               380

Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln

385                390                395                400

Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu

               405                410                415

Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile

           420               425                 430

Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu

       435                440                445

Arg Leu Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe

    450                455                460

Glu Asn Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val

465               470               475               480

Val Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg IleIle Phe Asn Gly Lys

               485                490              495

Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp

           500                505               510

Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys

        515                520                525

Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly

   530                535                540

Lys AspIle Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln

545               550                555                560

Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr

               565                570                575

Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg

           580                585                590

Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp

        595                600               605

Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr

    610               615                620

Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser

625                630                635              640

Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile

               645                650               655

Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly

           660                665               670

Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr

        675                680                685

Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu

    690               695               700

Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly

705                710                715                720

Ile Lys Lys Ile Leu Ile he Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

               725               730                735