茯苓多糖PCP-I对炭疽保护性抗原的佐剂效应研究

摘要

疫苗是经济有效的预防传染病的手段，开发安全高效的新型疫苗是疫苗学研究的目标。亚单位疫苗和重组蛋白类疫苗的抗原是高纯度的蛋白质，疫苗的安全性得到了提高，但是存在免疫原性弱，激发的抗体反应不强，难以激发T细胞反应等不足。为了提高蛋白类疫苗的效力，研究者们一直在寻找高效的佐剂来增强抗原的免疫原性，诱导更强的免疫反应或改变免疫反应的类型。铝佐剂是使用最广泛、时间最长的人用疫苗佐剂。近年来，MF59、AS03、AS04和Virosomes等几种新佐剂逐渐获批人用。而植物多糖，因其较强的免疫调节功能，以及具有生物可降解和低毒性等优点，成为新型佐剂研究的一个热点。
　　茯苓多糖PCP-I是从中药茯苓中提取纯化得到的一种均一多糖，由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成。本研究以炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）为模式抗原，从体液免疫反应和细胞免疫反应两方面对PCP-I的佐剂效应进行了系统评价；观察了PCP-I与寡聚脱氧核苷酸 CpG构成复合佐剂的佐剂效应；分别使用炭疽致死毒素（LT）攻毒模型和芽孢攻毒模型，对PCP-I增强PA保护效力的能力进行了考察；从树突状细胞（DC）成熟、生发中心（GC）反应和外周血单核细胞（PBMC）基因表达差异三个角度，对PCP-I佐剂效应的机制进行了初步探讨。
　　首先对小鼠免疫实验中PCP-I的量效关系进行了考察。将0.5μg PA分别与50、200、500μg PCP-I混合，免疫BALB/c小鼠，免疫二次，间隔两周，在二免后两周取血检测anti-PA抗体和抗炭疽毒素中和抗体。结果表明，PCP-I为200μg时，小鼠血清中的anti-PA抗体（5.38×103）和中和抗体（8.7×101）显著高于50μg组（1.54×102，2.65×101），略高于500μg组（4.15×103，6.13×101）。据此，选择200μg PCP-I进行后续的实验。
　　为评价PCP-I对体液免疫的影响，以0.5μg PA分别混合PCP-I和铝佐剂（Al），免疫BALB/c小鼠，并设PA无佐剂组和PBS组分别作为阴性和空白对照，免疫三次，间隔两周，在三免后两周取血进行相关检测。PA+PCP-I组的anti-PA抗体滴度（1.81×104）和抗体亲和力（0.81）显著高于PA组（1.60×103，0.52），而与PA+Al组（2.35×104，0.83）相近。对anti-PA抗体亚类进行分析，发现PA+PCP-I组的IgG1显著高于IgG2a（5.12×104，2.93×103），提示PCP-I是Th2偏向型佐剂。毒素中和实验结果表明，PA+PCP-I组的中和抗体（2.55×103）显著高于PA组（1.32×102），与PA+Al组（1.76×103）无显著性差异。
　　为评价PCP-I对细胞免疫的影响，以5μg PA分别混合PCP-I和铝佐剂免疫小鼠，PA无佐剂组和PBS组作对照，在三免后两周取脾细胞进行细胞免疫相关检测。PA+PCP-I组小鼠脾脏中PA特异性记忆B细胞的频率（4.26％）显著高于PA组（0.87%），与PA+Al组（5.39%）无显著性差异，表明PCP-I能够增强B细胞记忆。使用CCK8检测脾细胞在体外接受PA刺激后的增殖情况，PA+PCP-I组小鼠脾细胞增殖指数（1.37）显著高于PA+Al组（1.05）和PA组（1.08），表明PCP-I能提高小鼠脾细胞再次接触抗原后的增殖能力。使用ELISPOT检测脾细胞中IL-4、IFN-γ分泌细胞的频率，PA+PCP-I组IL-4分泌细胞频率（92/106）高于PA+Al组（34/106），而IFN-γ分泌细胞的频率无明显差异。用细胞因子芯片对PA刺激培养的脾细胞上清中各细胞因子的含量进行检测，PA+PCP-I组IL-2、IL-4、IL-5的含量（63.5、23.0、1020.8pg/ml）显著高于PA+Al组（17.0、2.6、5.1pg/ml），表明 PCP-I增强了记忆T细胞再次接触抗原后分泌相应细胞因子的能力。使用炭疽致死毒素（LT）对免疫后小鼠进行攻毒，观察存活率。PA组和PBS组小鼠全部死亡，PA+PCP-I组小鼠存活率为75%。
　　为评价PCP-I与CpG构成的复合佐剂的佐剂效应，使用0.5μg PA混合不同的佐剂免疫 BALB/c小鼠，在三免后两周取血进行检测。PA+PCP-I+CpG组的 anti-PA抗体（1.02×105）显著高于PA+PCP-I组（1.81×104）和PA+CpG组（3.49×103）；抗体亲和力（0.73）显著高于PA+CpG组（0.52），略低于PA+PCP-I组（0.81）。抗体亚类分析表明，PA+PCP-I+CpG组的IgG1与PA+PCP-I组相当（7.90×104，5.12×104），而IgG2a显著高于后者（5.12×104，2.93×103），说明联合佐剂使得PA特异性体液免疫反应呈现Th1/Th2均衡。PA+PCP-I+CpG组的中和抗体（1.38×104）显著高于PA+PCP-I组（2.55×103）和PA+CpG组（1.62×103）。上述结果说明复合佐剂能够以Th1/Th2均衡的方式提高anti-PA抗体，血清中和毒素的能力也显著提高。使用LT对小鼠进行攻毒，观察存活率。PA+PCP-I+CpG组的存活率与PA+PCP-I组相同（75%），略高于PA+CpG组（50%）。
　　为更直接地对佐剂增强PA免疫保护的能力进行评价，用0.5μg PA混合不同的佐剂免疫对炭疽芽孢攻击敏感的 A/J小鼠，三免后两周取血检测，三免后四周使用炭疽杆菌A16R株芽孢进行攻毒。检测结果显示，PA+PCP-I组的anti-PA抗体和中和抗体（7.18×103，2.42×102）低于PA+Al组（3.23×104，3.49×103），而PA+PCP-I+CpG组的抗体和中和抗体（3.23×104，2.29×103）与PA+Al组相当。芽孢攻毒后，PA+PCP-I+CpG组和PA+Al组小鼠全部存活，PA+PCP-I组小鼠存活率为83%。PCP-I单独使用的佐剂效应在 A/J小鼠实验中不如BALB/c小鼠，由于A/J小鼠属于补体成分5（C5）缺陷型小鼠，推测PCP-I的佐剂效应可能与激活补体途径相关，而CpG的加入能够在一定程度上弥补 C5缺失对PCP-I佐剂效应的不利影响。
　　为探讨PCP-I的作用机制，从DC成熟、GC反应和PBMC基因表达差异三个角度进行了初步研究。分别使用PA+PCP-I、PA+Al、PA刺激培养骨髓来源的DC，之后用流式细胞仪检测DC表面CD80和MHC-II的表达。PA+PCP-I刺激组DC中CD80阳性细胞的比例（82.2%）显著高于PA组（51.7%），略高于PA+Al组（65.1%）；PA+PCP-I组DC中MHC-II阳性细胞的比例（74.9%）显著高于PA组（46.8%）和PA+Al组（56.1%）。说明PCP-I能够诱导DC上调CD80和MHC-II表达，促进DC成熟。使用5μg PA分别混合PCP-I和铝佐剂免疫BALB/c小鼠，免疫两次，间隔两周，在二免后7天取脾细胞利用流式细胞术检测GCB细胞和滤泡状辅助T细胞（Tfh）的频率。PA+PCP-I组小鼠脾脏中GCB细胞（7.73%）频率显著高于PA组（6.30%），Tfh细胞的频率略高于后者（4.97%vs4.20%），提示PCP-I能促进生发中心反应。使用转录组测序技术，观察PA+PCP-I、PA+Al和PA免疫3天后PBMC中基因表达的差异。通过数据分析，PA+PCP-I组和PA组之间比较筛选到66个差异基因，其中53个基因与PA+Al组和PA组间差异基因重叠，13个基因是PCP-I特异的差异基因。对这13个基因进行功能注释，发现Il1r2、Clec4e、Stab1和C5ar1与免疫反应相关，其中C5ar1编码C5aR，参与补体C5a对特异性免疫的调节，与PCP-I的佐剂效应与C5相关的假设相符。
　　综上所述，PCP-I作为一种植物多糖类疫苗佐剂，其增强体液免疫反应能力与铝佐剂相当，增强细胞免疫反应的能力强于铝佐剂；当PCP-I与CpG构成复合佐剂后，以Th1/Th2均衡的方式进一步增强了体液免疫反应；初步的机制分析发现，PCP-I可通过促进DC成熟和增强生发中心反应，来增强抗原特异性免疫反应，其作用机制还可能与补体C5和C5aR相关。

目录

声明

主要缩略词表

前言

第一部分 茯苓多糖PCP-I对炭疽保护性抗原的佐剂效应评价

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二部分 茯苓多糖PCP-I与CpG联合使用对炭疽保护性抗原的佐剂效应评价

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第三部分 茯苓多糖PCP-I对炭疽保护性抗原佐剂效应的机制研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

结论

参考文献

附录1 主要溶液配置

附录2 差异表达基因表

代表性论著

个人简历

致谢