ShRNA在制备延长异体器官移植存活率的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种ShRNA在制备延长异体器官移植存活率的药物中的应用。该小分子干扰RNA能特异性抑制Core1β1，3半乳糖糖基转移酶，其是Core1O－聚糖合成过程中的关键酶。本发明的小分子干扰RNA能在体内抑制CD8+T细胞活化，而对CD4+T细胞和其他免疫细胞没有影响，能够通过诱导CD3

说明书

技术领域

本发明属于分子免疫领域。具体涉及一种小分子干扰RNA在制备延长异体器官移植存活率的药物中的应用。

背景技术

免疫抑制剂在器官移植中用于防治排斥反应，即干扰受体对外来抗原的识别和对非自身细胞的清除。常用的免疫抑制剂有环孢素、肾上腺皮质激素、烷化剂和抗代谢药。这些药物的特点是选择性差，对正常和异常的免疫反应均有抑制作用。[1]CsA及其类似物(CsG、SDZIMM125)和Tacrolimus(FK506)为细胞因子合成抑制剂，抑制T细胞的细胞因子基因转录，阻断T细胞产生IL-2，干扰T细胞活化(夏国伟，张元芳；免疫抑制剂的临床应用现状；复旦学报(医学科学版)；2001 Mar，28(2))。它们在G0/G1期交界处阻断T细胞激活，主要特异性地作用于T细胞或经T细胞受体复合物启动的T细胞依赖性功能，属T细胞早期激活的抑制剂[2，3](Keown PA.Therapeutic strategies for optimal use of novel，immuno-suppressants.Transplant Proc，1999，31：1790，Mayer AD，Miller J，DeierhoiMH，etal.Multicenter randomized trial comparing tacrolimus(FK506)andcyclosporine in the prevention of renal allograf trejection：a report of the Europeantacrolimus multicentre renal studygroup.Transplantation，1997，64(3)：436)。由于这一作用是干扰钙依赖性信号传导途径，因此它们也抑制其他钙依赖性信号转导途径引导的生理过程，如脱粒作用。它们主要的副作用是具有肾毒性。

蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种重要的加工过程。在肽链生物合成的同时或合成后在酶的催化下糖链被连接到肽链的特定糖基化位点。根据其肽链的糖基化位点不同分为N-糖基化和O-糖基化。通过连接GalNAc残基而对蛋白质上的丝氨酸和苏氨酸进行的修饰产生了O-聚糖(O-glycan)^[4](Schachter H.，Brockhausen I.The biosynthesis of serine(threonine)-N-acetylgalactosamine-linkedcarbohydrate moieties，in：H.J.Allen，E.C.Kisailus(Eds.)，Glycoconjugates.Composition，Structure and Function，Marcel Dekker，New York，NY，1992，pp.263-332)。在多肽GalNAcT作用下产生的O-聚糖有4种共同的核心(core)亚型，即core1，core2，core3，core4[5](Schachter H.，Brockhausen I.The biosynthesis ofserine(threonine)-N-acetylgalactosamine-linked carbohydrate moieties，in：H.J.Allen，E.C.Kisailus(Eds.)，Glycoconjugates.Composition，Structure and Function，MarcelDekker，New York，NY，1992，pp.263-332.)。目前的研究表明O-聚糖的表达与免疫系统密切相关，直接影响到T细胞的发育，免疫应答的发生以及某些疾病的发生等^[3](Keown PA.Therapeutic strategies for optimal use of novel，immuno-suppressants.Transplant Proc，1999，31：1790，Mayer AD，MillerJ，DeierhoiMH，et al.Multicenter randomized trial comparing tacrolimus(FK506)andcyclosporine in the prevention of renal allograft rejection：a report of the Europeantacrolimus multicentre renal study group.Transplantation，1997，64(3)：436)，Core1O-聚糖表达于大量组织细胞表面，改变组织细胞表面的糖后减弱了对T细胞的活化。

Core1β1，3半乳糖糖基转移酶(core1 β1-3 galactosyltransferase，C1GalT)是Core1O-聚糖合成过程中的关键酶^[6](Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.Asystem for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science.2002，296(5567)：550-553.)。本研究首次构建并筛选到针对小鼠C1GalT的特异性shRNA，运用siRNA真核表达载体shRNA分子的优点在于能够稳定地抑制目的基因表达，引起基因沉默。

通过RT-PCR及流式细胞术分析显示shRNAe能明显抑制C1GalT表达。伤寒感染小鼠模型试验结果表明有效干扰RNAshRNA(small hairpin RNA)使小鼠抗胞内菌伤寒杆菌感染能力明显下降，明显降低IFN-γ表达，但增强IL-10和IL-4的表达，IL-2水平各组无明显变化。流式细胞仪检测表明注射了有效干扰RNA的小鼠脾脏T细胞活化表面标记分子CD25、CD69和CD45表达降低，T细胞活化减弱，CD8+T细胞比例下降，而CD4/CD8比值增加，但是脾脏B细胞和巨噬细胞的比例没有发生改变。针对伤寒杆菌的特异性CTL释放颗粒酶水平降低。并且shRNA组CD3⁺CD8⁺T细胞凋亡水平明显高于其他组，而CD3⁺CD4⁺T细胞凋亡水平无明显变化。小鼠异体皮肤移植模型实验结果显示空白对照组移植皮片平均存活时间为(11.33±0.57)天，无效shRNA组移植皮片平均存活时间为(11.66±0.57)天，而有效shRNAe组移植皮片的存活时间明显延长，移植皮片平均存活时间为(19.00±1.00)天。体外实验结果表明转染有效shRNA的CT26细胞能诱导CD3⁺CD8⁺T细胞凋亡，对CD3⁺CD4⁺T细胞无影响。单向混合淋巴细胞反应结果显示转染有效shRNA的CT26细胞能抑制CD3⁺CD8⁺T细胞增殖，CD3⁺CD8⁺T细胞增殖水平不变。结论：本研究首次报道C1GalT及O-聚糖的改变在机体的细胞免疫功能上发挥重要作用，C1GalT特异性干扰RNA能在体内抑制T细胞活化和细胞免疫功能，能够通过诱导CD3⁺CD8⁺T细胞凋亡和增强免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌从而延长异体移植皮片的存活时间。本研究为core1β1，3N-乙酰基半乳糖糖基转移酶的特异小分子干扰RNA应用于治疗器官移植排斥反应奠定了实验基础。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种小分子干扰RNA在制备延长异体器官移植存活率的药物中的应用。该小分子干扰RNA(small interference RNA，SiRNA)表达载体能特异性抑制core1β1，3N-乙酰基半乳糖糖基转移酶的表达，具有高效性、高稳定性、高特异性的优点。此质粒能抑制T细胞的活化，抑制细胞免疫功能，提供了一种能应用于移植排斥反应的控制及某些自身免疫性疾病的治疗的新型免疫制剂。本发明的C1GalT特异性干扰RNA毒副作用小，成本低，稳定，抑制器官移植排斥反应能力强，能在体内抑制CD8+T细胞活化，而对CD4+T细胞和其他免疫细胞没有影响，能够通过诱导CD3⁺CD8⁺T细胞凋亡和增强免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌从而延长异体移植皮片的存活时间，具有高效性、高稳定性、高特异性的优点。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

RNA干扰(RNA interference，RNA i)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing，PTGS)。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA(small in-terfering RNA，siRNA)的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-inducedsilencing comlex，RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。RNAi具有特异性，稳定性和高效性。并具有能同时抑制多个基因表达和可遗传性等优点，这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并已在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。，本发明的SiRNA能特异性抑制Core1β1，3半乳糖糖基转移酶(core1 β1-3 galactosyltransferase，C1GalT)，其是Core1O-聚糖合成过程中的关键酶，目前的研究表明O-聚糖的表达与免疫系统密切相关，直接影响到T细胞的发育，免疫应答的发生以及某些疾病的发生等。本发明的C1GalT特异性干扰RNA能在体内抑制CD8+T细胞活化，而对CD4+T细胞和其他免疫细胞没有影响，能够通过诱导CD3⁺CD8⁺T细胞凋亡和增强免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌从而延长异体移植皮片的存活时间，抑制移植排斥反应。

目前临床上常用的免疫抑制剂有环孢素CsA及其类似物(CsG、SDZIMM125)和Tacrolimus(FK506)等。它们的肾副毒性作用强。本发明提供了一种能应用于移植排斥反应的控制及某些自身免疫性疾病的治疗的新型免疫制剂，即抑制移植排斥反应并延长器官移植存活率的小分子干扰RNA，其优点是，其毒副作用小，只改变糖的合成，仅抑制蛋白质翻译加工中的糖基化，不影响细胞的蛋白质和核酸的合成。并且成本低，稳定，抑制器官移植排斥反应能力强。具有高效性、高稳定性、高特异性的优点。

一种能特异抑制CD8+T细胞活化的小分子干扰RNA药物，其步骤是：

(一)能有效抑制小鼠C1GalT基因表达的shRNA真核表达载体pu6-shRNAe的构建。

1 靶序列的选择：根据GeneBank提供的Core1 beta 1，3-galactosyltransferase(AF157962)基因序列，选取5’-GCGAAGATTTAAGCCCTATGT-3’(一种抑制core1 β1-3半乳糖基转移酶的shRNA表达载体的构建方法及应用。于2006年武汉大学申请中国发明专利，申请专利号200610019901.0，发明人为章晓联，周霞)作为靶序列

2 设计并合成引物：设计并合成4条引物Oligo1.5’GCGAAGATTTAAGCCCTATGTTTCA 3’；Oligo2.5’AGCTTGAAACATAGGGCTTAAATCTTCGCGGCC 3’；Oligo3.5’AGCTTACATAGGGCTTAAATCTTCGCTTTT 3’；Oligo4.5’AATTAAAAGCGAAGATTTAAGCCCTATGTA 3’。(引物由上海生工生物工程技术公司合成)

3 shRNAe真核表达载体的构建及功能鉴定：通过引物退火，连接至载体pSilencer1.0-U6(购置Ambion公司)上。挑取连接产物转化后生成的单个克隆，经EcoR I和HindIII酶切鉴定，选择正确克隆，经测序鉴定，得到重组质粒pu6-shRNAe。将pu6-shRNAe转染到CT26细胞(小鼠结肠癌细胞系)后，pu6-shRNAe在细胞内表达出大量针对C1GalT的特异性有效干扰RNA，通过RNAi作用，降解C1GalT的mRNA，使C1GalT表达减少，减少蛋白质表面core1O-聚糖的生成。通过RT-PCR检测Core1β1，3半乳糖糖基转移酶mRNA表达水平，以及通过流式细胞术检测CT26细

胞表面core1O-聚糖的表达来检测shRNAe对细胞C1GalT基因表达的抑制。

(二)一种小分子干扰RNA(small interference RNA，SiRNA)在制备延长异体器官移植存活率的药物中的应用。(一种小分子干扰RNA在制备延长异体移植皮片存活率的药物中的应用。)

1、体外检测转染了shRNAe的肿瘤细胞对刺激T细胞增殖和诱导T细胞凋亡水平的影响：转染了shRNAe的CT26肿瘤细胞表面core1 O-聚糖的表达下降，抗原性减弱，细胞表面蛋白分子构象发生变化，蛋白功能改变最终导致其刺激T细胞增殖的能力降低，诱导T细胞凋亡能力升高。

2、通过肌肉注射pu6-shRNAe质粒，构建C1GalT基因knockdown动物模型，同时进行异体皮肤移植，观察异体移植皮片存活时间的改变：将pu6-shRNAe质粒通过肌肉注射到BALB/c小鼠体内后，以BALB/c小鼠为受体，以C57BL/6小鼠为供体进行同种异体皮肤移植。通过HE染色对移植皮片进行组织病理学观察，通过移植皮片排斥情况观察移植皮片存活时间。通过ELISA法检测小鼠脾脏及血清中IL-2和IL-10的变化。

发明的优点与效果：

本发明与现有的细胞免疫抑制剂相比，具有以下优点：能特异性抑制T细胞的活化，诱导T细胞的凋亡，而不改变T细胞本身的功能，能针对性地改变移植宿主对移植器官的识别及排斥反应。其毒副作用小，只改变糖的合成，仅抑制蛋白质翻译加工中的糖基化，不影响细胞的蛋白质和核酸的合成。并且成本低，稳定，抑制器官移植排斥反应能力强。具有高效性、高稳定性、高特异性的优点。显著延长异体移植物的存活时间。

附图说明

图1.ShRNAe能明显抑制小鼠结肠癌CT-26细胞中C1GalT的表达。将空载质粒，无效干扰RNA(shRNAn)，有效干扰RNA(shRNAe)瞬时转染CT-26细胞后，48h后收获细胞进行RT-PCR分析C1GalT的表達，凝胶电泳，进行条带灰度分析及与内参比较图。

图2MTT检测shRNA对CT-26细胞增殖无毒副作用影响。

图3ShRNAe增强Th2型细胞因子分泌水平。

图4ShRNAe降低特异性CTL释放颗粒酶水平。

图5转染有效shRNAe的CT26细胞能抑制CD3⁺CD8⁺T细胞增殖，CD3⁺CD4⁺T细胞增殖水平不变。

图6转染有效shRNA的CT26细胞能诱导CD3⁺CD8⁺T细胞凋亡，对CD3⁺CD4⁺T细胞无影响。

图7ShRNAe显著延长异体皮肤移植片存活时间。

图8三组小鼠移植皮片外观比较。异体移植皮片局部外观及组织病理学观察外观，术后7天，无效shRNAn组和生理盐水组小鼠移植皮肤开始出现大片坏死，颜色加深，变黑，质地变硬，逐渐到十天左右完全脱落，而有效的shRNAe组小鼠移植皮肤色泽红润，柔软，18天左右才逐渐变黑脱落。

图9三组小鼠术后7天移植皮片组织学观察，(HE×100)。组织病理学观察术后7天无效ShRNA组及生理盐水组真皮及皮下组织内出现大量炎性细胞浸润，以单核细胞，淋巴细胞为主，可见毛细血管淤血，间质出血等现象。而有效的ShRNA组皮片皮下组织有少量炎性细胞浸润，真皮层无此现象图。

图10小鼠皮肤移植7、12、20天后血清、脾脏细胞因子IL-2水平无明显变化。

图11小鼠皮肤移植7、12、20天后血清、脾脏细胞因子血清及脾脏IL-10水平增加。

具体实施方式

小分子干扰RNA在制备延长异体器官移植存活率的药物中的应用，其步骤是：

1.靶序列的选择：根据GeneBank提供的Core1 beta 1，3-galactosyltransferase(AF157962)基因序列，经BLAST和RNA structure 3.5分别对其进行同源性和RNA二级结构分析，选取一段21nt的核苷酸序列5’-GCGAAGATTTAAGCCCTATGT-3’作为靶序列(一种抑制core1 β1-3半乳糖基转移酶的shRNA表达载体的构建方法及应用。于2006年武汉大学申请中国发明专利，申请专利号200610019901.0，发明人为章晓联，周霞)。

2.设计并合成引物。引物序列为：Oligo1.5’GCGAAGATTTAAGCCCTATGTTTCA 3’；Oligo2.5’AGCTTGAAACATAGGGCTTAAATCTTCGCGGCC 3’；Oligo3.5’AGCTTACATAGGGCTTAAATCTTCGCTTTT 3’；Oligo4.5’AATTAAAAGCGAAGATTTAAGCCCTATGTA3’。(引物由上海生工生物工程技术公司合成)

3.pu6-shRNAe的构建及功能鉴定

3.1 pu6-shRNAe的构建：将Oligo1和Oligo2稀释至10pmol·ml-1，各取2μl混合，加水稀释至20μl，95℃5min，55℃10min，然后冷却至室温(20-25℃以下相同)，Oligo1和Oligo2退火形成双链，再与经Apa I和HindIII双酶切回收后的质粒pSilencer1.0-U6连接，转化至感受态大肠杆菌DH5α(向田，马运峰，章晓联；L-ficollin保护小鼠抵御伤寒杆菌感染作用的研究；细胞与分子免疫学杂志；2007，23(2))，挑取单个菌落，经Apa I和HindIII酶切鉴定，选择正确克隆，标记为pU6-galt12。pU6-galt12经Apa I和HindIII双酶切，回收后与Oligo3和Oligo4的退火产物(将Oligo3和Oligo4稀释至10pmol·ml-1，各取2μl混合，加水稀释至20μl，95℃ 5min，55℃1 0min，然后冷却至室温)连接，转化至感受态DH5α，挑取单个菌落，经EcoR I和HindIII酶切鉴定，选择正确克隆，经测序鉴定，得到重组质粒pu6-shRNAe。pu6-shRNAe在真核细胞内能表达出针对core1 β1，3N-乙酰基半乳糖糖基转移酶的特异性有效干扰RNA。

3.2 特异性shRNAe转染CT-26细胞：提取pu6-shRNAe质粒，测定DNA浓度，根据DNA浓度计算DNA含量，将4μg DNA加入250μl无血清RPMI 1640培养基中，另取240μl无血清RPMI 1640培养基，其中加入10μl Lipofectamine2000脂质体(购置Invitrogen公司)，5分钟内混合含DNA和脂质体的无血清RPMI 1640培养基，30分钟后将上述混合物加入CT-26细胞中(转染24小时前接种CT-26细胞，细胞数量为2×10⁵/孔。待CT-26细胞生长至90％铺满培养板底部进行转染)。

3.3 RT-PCR检测目的基因的表达：转染48h后收获上述转染的细胞，按照说明书提取细胞的总RNA，进行RT-PCR。其中引物序列为G3DPH为内参，其上游引物为：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游引物为：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′；RT-PCR中针对core1 β1-3半乳糖基转移酶基因的引物序列为：上游引物为：5′CAGTCACCTCAAAGGACAGA 3′，下游引物为：5′GGAATCTCCAGCTTCTACAT 3′。(引物由上海生工生物工程技术公司合成)PCR反应体系为

10×Taq DNA Polymerase buffer   5μl

25mM MgSO4                      3μl

10mM dNTP                       1μl

上游引物(20μM)                  1μl

下游引物(20μM)                  1μl

模板                            1μl

Taq DNA Polymerase              1μl

灭菌双蒸水                      37μl

总体积                          50μl

反应条件：95℃，5min；95℃，36sec；60℃，36sec；72℃，84sec；共28个循环；72℃，5min。将RT-PCR产物进行凝胶电泳并测定灰度，将目的基因与内参G3PDH的比值进行比较判断目的基因表达的改变(图1A，图1B)。

3.4.流式细胞仪检测细胞表面core1O-聚糖的表达：利用流式细胞仪分析分别转染空载质粒，无效干扰RNA(shRNAn)，有效干扰RNA(shRNAe)的CT-26细胞表面core1 O-聚糖的表达，转染72h后收获上述转染的细胞，用PBS洗涤细胞一次后，用PBS将细胞定容到100μl，加入1μl FITC-PNA(购置vector公司)，室温下蔽光孵育20min，上机检测。流式检测结果显示转染有效干扰RNA(shRNAe)的CT-26细胞表面core1 O-聚糖的表达明显下降。检测结果显示转染空载的CT26细胞表面core1O-聚糖的表达为76％，而转染pu6-siRNAe的细胞表面core1O-聚糖的表达明显下降，仅为53％(图1C)。

3.5 MTT检测pu6-shRNAe对CT-26细胞增殖的影响：将构建好的SiRNA真核表达载体质粒瞬时转染CT-26细胞，48小时后进行MTT检测。结果显示小分子干扰RNA对细胞增殖没有影响，没有观察到毒副作用。(图2)。

4.shRNAe能降低机体的Th1型细胞免疫功能，一种小分子干扰RNA在制备延长异体移植皮片存活率的药物中的应用。(一种小分子干扰RNA在制备延长异体脾脏移植存活率的药物中的应用。)

4.1 脾脏IFN-γ、IL-4细胞因子分泌水平测定：从-80℃冰箱中取出组织匀浆液，融化后，用ELISA法检测细胞因子含量。每个样品设两个复孔。结果显示注射了shRNAe质粒组的小鼠脾脏细胞产生的Th1型细胞因子IFN-γ分泌水平降低，而Th2型细胞因子IL-4分泌水平增高(图3)。

4.2 免疫细胞表面分子表达的检测：处死小鼠，取出脾脏，置于装有PBS无血清RPMI1640培养液的小皿中，钢网研磨成细胞悬液，经200目尼龙网过滤。滤液1500rpm离心10分钟，室温，弃上清。沉淀加入pH7.2的Tris·NH₄Cl 5ml，毛细吸管吹打混匀，37℃，水浴8分钟，以破除红细胞。室温下，1500rpm，离心10分钟，用无菌PBS洗涤一次。细胞沉淀用PBS悬浮，定容计数之后，调细胞浓度至1×10⁷/ml。取100μl细胞悬液于流式管，加入流式抗体，室温下避光孵育20分钟，上机检测。其中每组小鼠检测三只，取平均值。其中抗体分组分别为：Tri-color-anti-CD3+PE-anti-CD8+FITC-anti-CD25；Tri-color-anti-CD3+PE-anti-CD8+FITC-anti-CD69；Tri-color-anti-CD3+FITC-anti-CD45；FITC-anti-CD19；PE-anti-CD14。其中流式结果显示，相对于其他感染组，注射了有效干扰RNA的小鼠脾脏T细胞活化表面标记分子CD25，CD69，CD45表达明显降低，T细胞活化减弱，CD8+T细胞比例下降，而CD4/CD8比值增加。但是脾脏B细胞和巨噬细胞的比例没有发生改变。

4.3 针对伤寒杆菌的特异性CTL释放颗粒酶水平检测：实验分五组：正常小鼠组，免疫小鼠组，shRNAe组，shRNAn组以及空载质粒组。每组3只小鼠；在第0天调整人减毒伤寒杆菌J341(何攀文，章晓联，汪付兵等；新发现的伤寒杆菌IVB型菌毛致病性研究；武汉大学学报(医学版)；2004Jul 25(4))浓度为1×10⁹CFU/ml，除正常组小鼠外，每只小鼠经鼻腔滴注J341菌液10ul；感染伤寒当天，shRNAe组，shRNAn组以及空载质粒组小鼠分别在股四头肌处分别注射质粒pu6-shRNAe，pu6-shRNAn(一种抑制core1 β1-3半乳糖基转移酶的shRNA表达载体的构建方法及应用。于2006年武汉大学申请中国发明专利，申请专利号200610019901.0，发明人为章晓联，周霞)，pSilencer1.0-U6：调整质粒浓度为200mg/ml，取质粒50ul加上20ul的0.75％利多卡因，再加上30ulPBS使总体积达到100ul，股四头肌肌注，同时用活体基因导入仪刺激注射部位；第6天眼球放血处死全部小鼠，每只小鼠无菌取脾，置于装有PBS无血清RPMI1640培养液的小皿中，钢网研磨成细胞悬液，经200目尼龙网过滤。滤液1000rpm离心10分钟，室温，弃上清。沉淀加入pH7.2的Tris·NH4Cl 5ml，毛细吸管吹打混匀，37℃，水浴8分钟，以破除红细胞。室温下，1000rpm，离心10分钟，用无菌PBS洗涤一次。细胞沉淀用含10％FBS的RPMI1640培养液悬浮，定容计数之后，调细胞浓度至3×10⁶/ml。将细胞转移到六孔板中，每孔1ml.再加入含10％FBS的RPMI1640培养液1ml。100℃ 12分钟水浴灭活人减毒伤寒杆菌J341，除正常组外，每孔加入1×10⁹CFU/ml的伤寒杆菌30ul混匀，置细胞培养箱中37℃，5％CO2培养44小时；培养44小时后，每孔细胞加入2ul1000×的莫能菌素，混匀，继续培养4小时；4小时后，将各组的3孔细胞混合，1000rpm10分钟收集细胞，无菌PBS洗涤一次；采用BD公司的CD8+T细胞磁珠分选试剂盒分选各组细胞；分选出来的各组细胞加入Fixtion buffer(购置ebioscience公司)100ul，旋转离心管，室温避光20分钟后加入1ml破膜剂，室温避光20分钟；1600rpm，10分钟收集细胞，弃上清，加入100ul破膜剂，同时加入PE标记的抗颗粒酶(Granzyme)b的抗体0.5ul，室温避光30分钟；加入2ml无菌PBS重悬细胞，1600rpm，8分钟离心后弃上清收获细胞；加入500ul无菌PBS重悬细胞后，FCM检测各组细胞Granzyme b的表达。结果表明shRNAe质粒注射后小鼠针对伤寒杆菌的特异性CTL释放颗粒酶水平降低(图4)。

5.shRNAe对T细胞增殖能力的影响：单向混合淋巴细胞反应检测转染了shRNAe的CT26细胞(一种小鼠结肠癌细胞，MHC型别与BALB/C小鼠匹配)对T细胞增殖能力的影响。CT26细胞铺96孔板后分别转染psilence1.0U6，pu6-shRNAn，pu6-shRNAe，每孔200ng/ul。设空白组。每组6孔。72h后加入mit-C 37℃ 1h灭活CT26，PBS洗2-3次。再分别加入磁珠分选的小鼠脾脏CD4+T或CD8+T细胞，每孔加入CD3单抗至终浓度为1ug/ml。48h后，每孔加入1mci/ml的³H-TdR10ul。第2天将细胞抽滤至滤纸上，液闪测定cpm。结果表明转染有效shRNA的CT26细胞能抑制CD3+CD8+T细胞增殖，但CD3+CD4+T细胞增殖水平不变(图5)。

6.流式细胞术检测转染了shRNAe的CT26细胞诱导T细胞凋亡水平的改变：CT26细胞铺96孔板后分别转染pSilencer1.0-U6，pu6-shRNAn，pu6-shRNAe，每孔200ng/ul。设空白组。每组6孔。72h后加入mit-C37℃ 1h灭活CT26，PBS洗2-3次。再分别加入磁珠分选的小鼠脾脏CD4+T或CD8+T细胞，每孔加入CD3单抗至终浓度为1ug/ml。48h后，按照凋亡检测试剂盒说明书检测T细胞凋亡水平。流式细胞术检测结果表明转染有效shRNA的CT26细胞能诱导CD3+CD8+T细胞凋亡，对CD3+CD4+T细胞无影响(图6)。

7.shRNAe延长异体皮肤移植片存活时间的研究：(一种小分子干扰RNA在制备延长异体移植皮片存活率的药物中的应用。)供体：C57BL/6小鼠，受体：BALB/c小鼠。将24只BALB/c小鼠随机分为有效干扰RNA：shRNAe组、无效干扰RNA：shRNAn组和生理盐水组，每组8只。shRNAe组小鼠经股四头肌部位注射20mg/ml普鲁卡因和质粒pu6-shRNAe混合物(1:4)125μl，pu6-shRNAn组小鼠经股四头肌部位注射20mg/ml普鲁卡因和质粒pu6-shRNAn混合物(1:4)125μl，生理盐水组小鼠经股四头肌部位注射20mg/ml普鲁卡因和生理盐水混合物(1:4)125μl，同时用活体基因导入仪刺激注射部位。第二天进行异基因皮肤移植。将受体小鼠BALB/C按0.2ml/10g体重腹腔注射4％戊巴比妥钠，待麻醉后将其固定在手术板上，选择小鼠躯体中的背部稍偏向右侧为手术区，以移植床为中心广泛去毛，以3％碘伏和70％的酒精棉球消毒，剪去部分皮肤全层形成一直径为14mm的植床.创缘安装自制的C形阻隔圈。以眼科剪剪下C57BL/6小鼠背部直径15mm的全层皮肤，剪除皮片的肉膜层，以生理盐水冲洗后作为同种异体皮肤移植备用。将已制备的异体皮肤植入受体小鼠BALB/c创面，以5-0丝线采用横褥式缝合创缘皮肤，阻隔圈及移植皮肤，留长线打包固定包扎。分笼喂养。术后五天拆包，开始观察并记录移植皮片成活时间，将坏死总面积≥90％定义为排斥。结果表明注射了pu6-siRNAe的小鼠移植皮片存活时间显著延长(图7)。

异体移植皮片局部外观及组织病理学观察：(1)、外观，术后7天，无效shRNAn组和生理盐水组小鼠移植皮肤开始出现大片坏死，颜色加深，变黑，质地变硬，逐渐到十天左右完全脱落，而有效的shRNAe组小鼠移植皮肤色泽红润，柔软，18天左右才逐渐变黑脱落(图8)；(2)、组织病理学观察，术后7天无效ShRNA组及生理盐水组真皮及皮下组织内出现大量炎性细胞浸润，以单核细胞，淋巴细胞为主，可见毛细血管淤血，间质出血等现象。而有效的ShRNA组皮片皮下组织有少量炎性细胞浸润，真皮层无此现象图(图9)。

小鼠异体皮肤移植后第7，12，20天，各组血清及脾脏内细胞因子IL-2含量无明显变化(图10)。小鼠血清及脾脏IL-10水平ELISA结果显示：皮肤移植后第7天，shRNAe组小鼠脾脏内IL-10(pg/ml)水平(414.0±1.0)显著高于生理盐水对照组(248.7±19.6)和无效shRNAn组(262.0±37.0)(p<0.05)；移植后第12天，有效shRNAe组小鼠脾脏内IL-10(pg/ml)水平(273.3±23.0)显著高于无效shRNAn组(217.3±15.0)。移植后血清中细胞因子IL-10水平各组无明显变化(图11)。