乳源抗高血压7肽串联基因及其合成方法

摘要

本发明提供了一种适合在毕赤酵母中表达的乳源抗高血压7肽串联基因及其合成方法。串联基因的结构为：XhoI－信号切割序列－七肽氨基酸序列重复－终止密码子－NotI；目的基因序列为：CTC GAG AAAAGA GAG GCT GAA GCT GCT GTT CCA TAC CCA CAAAGA(GCT GTCCCA TAC CCA CAA AGA GCT GTT CCA TAC CCA CAA AGA)n TAA GCGGCCGC，其中n表示括号内的序列重复n次。合成方法为：1)适合在毕赤酵母中表达的乳源抗高血压7肽串联基因的设计；2)乳源抗高血压7肽串联基因的合成。该基因可在毕赤酵母中高水平表达，其表达产物经胰蛋白酶酶切后可形成单一的N端和C端都完整的乳源抗高血压7肽。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种基因工程技术，具体涉及的是采用基因工程手段设计、合成的乳源抗高血压7肽串联基因，该基因可在毕赤酵母中高水平表达，其表达产物经胰蛋白酶酶切后可形成单一的N端和C端都完整的乳源抗高血压7肽。

(二)背景技术

高血压是一种慢性的心脑血管疾病，是冠心病，脑卒中等心脑血管疾病的主要危险因素。据统计，全世界每年因高血压引起的心脑血管疾病的死亡人数超过1200万，高血压病己成为人类健康的第一杀手，成为全球性的重大的公共卫生问题。目前，世界卫生组织(WHO)批准用于治疗高血压病的一线药物主要有利尿剂、β受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、钙通道阻滞剂(CaA)、α受体阻断剂、血管紧张素(Ang)受体拮抗剂等六大类。

研究表明，肾素-血管紧张素系统(RAS)在机体的血压调节过程中起着十分重要的作用。在该系统中，ACE酶是血压调节过程中一个关键的酶，它可以将无活性的血管紧张素I(AngI)水解生成具有血管收缩作用的血管紧张素II(AngH)，从而导致血管收缩，机体的血压升高。ACEI可抑制ACE酶的活性，从而抑制了AngI向AngII的转化，使机体血压维持恒定。因此，ACEI在治疗高血压病中的应用也越来越广泛。但是使用药物治疗都有一定的副作用，所以，寻找安全的、天然的、食物来源的ACEI物质来治疗高血压引起了广大科学家们极大的关注。

有研究报道，在牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分离到了一些在体外具有ACE酶抑制活性、经动物实验(体内实验)证明具有降低血压作用的抗高血压生物活性肽。这一研究结果引起了科学家们的极大兴趣，极大地促进了乳源抗高血压小肽的研究。然而，到目前为止，所有的乳源抗高血压小肽都是通过蛋白酶对乳蛋白质的水解获得的，还没有通过基因工程技术来表达抗高血压小肽的研究报道。本发明依据毕赤酵母密码子用法和高表达优越密码子，设计的乳源抗高血压7肽串联基因，采用ABI3900高通量DNA合成仪合成若干寡核苷酸片段，通过重叠延伸PCR合成基因，将PCR产物克隆到质粒pMD18-T上。该基因可在毕赤酵母中高水平表达，其表达产物经胰蛋白酶酶切后可形成单一的N端和C端都完整的乳源抗高血压7肽。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种乳源抗高血压7肽串联基因及其合成方法。

本发明的目的是这样实现的：

1.适合在毕赤酵母中表达的乳源抗高血压7肽串联基因的设计

根据乳源抗高血压7肽AVPYPQR的氨基酸序列、毕赤酵母密码子用法和高表达优越密码子设计乳源抗高血压7肽串联基因，编码7肽的核苷酸序列间无间隔，以保证其表达产物经胰蛋白酶酶切后可形成单一的N端和C端都完整的乳源抗高血压7肽。为适合该基因在毕赤酵母中的分泌表达，在串联基因的5’端引入了酵母分泌信号肽切割位点。为了便于表达载体的构建，在基因的两端分别引入了XhoI、NotI酶切位点。即设计的串联基因的结构为：XhoI-信号切割序列-七肽氨基酸序列重复-终止密码子-NotI。目的基因序列为：ctc gag aaa agagag gct gaa gct gct gtt cca tac cca caa aga(gct gtc cca tac cca caa aga gct gtt cca tac cca caa aga)ntaa gcggccgc，其中()n表示括号内的序列重复n次。

2.基因的合成

根据目的基因序列，设计了以下4条寡核苷酸，用于基因合成。

AHP-1  5’-Ctc gag aaa aga gag gct g-3’19nt

AHP-2  5’-Ctc gag aaa aga gag gct gaa gct gct gtt cca tac cca caa ag-3’44nt

AHP-3  5’-ct ttg tgg gta tgg aac agc tct ttg tgg gta tgg gac agc tct ttg tgg gta tgg aac-3’59nt

AHP-4  5’-gcgg ccgc tta tct ttg tgg gta tgg aac ag-3’29nt

首先将AHP-2与AHP-3混合，进行重叠延伸PCR反应。

PCR反应体系：

去离子水                16.375μL

10×Pyrobest Buffer     2.5μL

Mg²⁺(25mM)              2.0μL

dNTP                    2.0μL

AHP-2(20μM)            0.5μL

AHP-3(20μM)            1.5μL

Pyrobest酶(5U/μL)      0.125μL

总体积                  25μL

PCR反应条件：

94℃预变性              1min

72℃延伸                30s

72℃延伸                10min

4℃终止反应

回收＞500bp的PCR产物作为模板，以AHP-1、AHP-4为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

去离子水                    16.375μL

10×Pyrobest Buffer         2.5μL

Mg²⁺(25mM)                  2.0μL

dNTP                        2.0μL

AHP-1(20μM)                0.5μL

AHP-4(20μM)                0.5μL

模板                        1.0μL

Pyrobest酶(5U/μL)          0.125μL

总体积                      25μL

PCR反应条件：

94℃预变性                  5min

72℃延伸                    1min

72℃延伸                    10min

4℃终止反应

反应产物加A后回收＞300bp的PCR产物，克隆至PMD18-T载体，送交上海生工测序，测序后序列分析。

测序结果：

ctcgagaaaa gagaggctga agctgctgtt ccatacccac aaagagctgt tccataccca    60

caaagagctg ttccataccc acaaagagct gttccatacc cacaaagagc tgtcccatac   120

ccacaaagag ctgttccata cccacaaaga gctgttccat acccacaaag agctgttcca   180

tacccacaaa gagctgttcc atacccacaa agagctgttc catacccaca aagagctgtt   240

ccatacccac aaagagctgt cccataccca caaagagctg ttccataccc acaaagataa   300

编码的成熟分泌蛋白的氨基酸序列：

AVPYPQR  AVPYPQR  AVPYPQR  AVPYPQR  AVPYPQR  AVPYPQR  AVPYPQR

AVPYPQR  AVPYPQR  AVPYPQR  AVPYPQR  AVPYPQR  AVPYPQR

本发明采用基因工程手段设计、合成的乳源抗高血压7肽串联基因，该基因可在毕赤酵母中高水平表达，其表达产物经胰蛋白酶酶切后可形成单一的N端和C端都完整的乳源抗高血压7肽AVPYPQR。毕赤酵母是一种代谢旺盛的真菌，将设计、合成的乳源抗高血压7肽串联基因转化到毕赤酵母上，制备出一株基因工程酵母，其代谢产物经胰蛋白酶酶切后，制备AVPYPQR，为食品级ACEI的生产提供了方便途径，同时大大降低了生产成本，提高了产品安全性，具有很大的开发潜力。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述：

实施例：

1).适合在毕赤酵母中表达的乳源抗高血压7肽串联基因的设计

根据乳源抗高血压7肽AVPYPQR的氨基酸序列、毕赤酵母密码子用法和高表达优越密码子设计乳源抗高血压7肽串联基因，编码7肽的核苷酸序列间无间隔，以保证其表达产物经胰蛋白酶酶切后可形成单一的N端和C端都完整的乳源抗高血压7肽。为适合该基因在毕赤酵母中的分泌表达，在串联基因的5’端引入了酵母分泌信号肽切割位点。为了便于表达载体的构建，在基因的两端分别引入了XhoI、NotI酶切位点。即设计的串联基因的结构为：XhoI-信号切割序列-七肽氨基酸序列重复-终止密码子-NotI。目的基因序列为：ctc gag aaa agagag gct gaa gct gct gtt cca tac cca caa aga(gct gtc cca tac cca caa aga gct gtt cca tac cca caa aga)ntaagcggccgc，其中()n表示括号内的序列重复n次。

2)基因的合成

根据目的基因序列，设计了以下4条寡核苷酸，用于基因合成。

AHP-1  5’-Ctc gag aaa aga gag gct g-3’19nt

AHP-2  5’-Ctc gag aaa aga gag gct gaa gct gct gtt cca tac cca caa ag-3’44nt

AHP-3  5’-ct ttg tgg gta tgg aac agc tct ttg tgg gta tgg gac agc tct ttg tgg gta tgg aac-3’59nt

AHP-4  5’-gcgg ccgc tta tct ttg tgg gta tgg aac ag-3’29nt

首先将AHP-2与AHP-3混合，进行重叠延伸PCR反应。

PCR反应体系：

去离子水                16.375μL

10×Pyrobest Buffer     2.5μL

Mg²⁺(25mM)              2.0μL

dNTP                    2.0μL

AHP-2(20μM)            0.5μL

AHP-3(20μM)            1.5μL

Pyrobest酶(5U/μL)      0.125μL

总体积                  25μL

PCR反应条件：

94℃预变性        1min

72℃延伸          30s

72℃延伸          10min

4℃终止反应

回收＞500bp的PCR产物作为模板，以AHP-1、AHP-4为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

去离子水               16.375μL

10×Pyrobest Buffer    2.5μL

Mg²⁺(25mM)             2.0μL

dNTP                   2.0μL

AHP-1(20μM)           0.5μL

AHP-4(20μM)           0.5μL

模板                   1.0μL

Pyrobest酶(5U/μL)     0.125μL

总体积                 25μL

PCR反应条件：

94℃预变性             5min

72℃延伸               1min

72℃延伸               10min

4℃终止反应

反应产物加A后回收＞300bp的PCR产物，克隆至PMD18-T载体，送交上海生工测序，测序后序列分析，测序结果见乳源抗高血压7肽串联基因序列表。

编码的成熟分泌蛋白的氨基酸序列见乳源抗高血压7肽串联基因编码的成熟分泌蛋白的氨基酸序列表。

该蛋白经胰蛋白酶酶切后可形成单一的N端和C端都完整的乳源抗高血压7肽AVPYPQR。

乳源抗高血压7肽串联基因序列表：

ctcgagaaaa gagaggctga agctgctgtt ccatacccac aaagagctgt tccataccca    60

caaagagctg ttccataccc acaaagagct gttccatacc cacaaagagc tgtcccatac   120

ccacaaagag ctgttccata cccacaaaga gctgttccat acccacaaag agctgttcca   180

tacccacaaa gagctgttcc atacccacaa agagctgttc catacccaca aagagctgtt   240

ccatacccac aaagagctgt cccataccca caaagagctg ttccataccc acaaagataa   300

乳源抗高血压7肽串联基因编码的成熟分泌蛋白的氨基酸序列表：

Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Ala

1                5                   10                  15

Val Pro Tyr Pro Gln Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Ala Val

                 20                  25                  30

Pro Tyr Pro Gln Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Ala Val Pro

                 35                  40                  45

Tyr Pro Gln Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Ala Val Pro Tyr

                 50                  55                  60

Pro Gln Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Ala Val Pro Tyr Pro

                 65                  70                  75

Gln Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gln

                 80                  85                  90

Arg