一种原发性肝癌血清标志物的检测试剂盒

摘要

本发明涉及生物医学诊断学技术领域，是一种用于检测原发性肝癌血清标志物的试剂盒。由抗原包被的酶标板、酶标抗体工作液、样本稀释液、洗涤液、阳性和阴性对照血清、显色液和终止液组成，其特征在于酶标板的包被抗原分别为与原发性肝癌5种血清标志抗体相对应的5组多肽抗原：L4－A和L4－B，L7－B，L11－1、L11－3和L11－4，L12－A和L12－B，Sui1－A和Sui1－B。除L7B单独包被外，其余都为同组多肽等比例混合包被。经试剂盒评价实验和临床试用，本试剂盒特异性和敏感性好，可用于原发性肝癌发生前或发生早期的预警提示或早期诊断，从而提高肝癌患者的生存率，并通过观察血清相关指标的动态变化，及时评估治疗效果和病情转归情况。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学诊断学技术领域，是一种用于检测原发性肝癌血清标志物的试剂盒。

背景技术

原发性肝癌(HCC)在恶性肿瘤的死亡排名中居前，严重威胁着人类的生命健康。我国每年因患肝癌而死亡的人数约占全世界肝癌死亡人数的40％。肝癌高发的主要原因是我国约10％的人口为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性，而HBsAg阳性或有慢性肝病病史者是肝癌的主要高危人群。目前，用于原发性肝癌诊断的血清学癌性标志物甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)，对于诊断原发性小肝癌的敏感度和阳性率较低，分别为33％～65％和9.1％～26％(AFP>20μg/L时)。而小肝癌的及早发现和确诊对于提高原发性肝癌患者的生存率至关重要。因此，需要建立高效、便捷的方法来用于原发性肝癌，特别是小肝癌的筛查和早期诊断。

近年研究工作发现，乙型肝炎病毒X抗原(HBx)可诱发5种蛋白URG4、URG7、URG11、S15a和Sui1的高表达，它们与原发性肝癌的发生、发展密切相关(参见H.L.Hann，J.M Lee，M.A.Feitelson，et al.Preneoplastic Markers ofHepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma Cancer Research.2004，64(15)，7329-35)。这5种高表达蛋白诱导产生的相应抗体的出现，往往比目前临床上用AFP和影像学核磁共振(MRI)等方法诊断出肝癌的时间要早几个月甚至一年以上。本发明人根据上述5种蛋白的氨基酸序列，筛选出10条多肽片段，以其蛋白来源分为5组，分别为L4-A和L4-B；L7-B；L11-1、L11-3和L11-4；L12-A和L12-B；Sui1-A和Sui1-B，以它们作为抗原，分别可与上述5种蛋白产生的相应抗体发生特异性反应，10条多肽的氨基酸序列如表1所示：

表1、10条多肽抗原的氨基酸序列。

初步的ELISA方法检测结果表明，这10条多肽抗原具有较好的特异性和敏感性，可以分别有效地检测出患者血清中5种高表达蛋白诱导出的相应抗体，因此，该抗体可作为原发性肝癌血清标志物。但至今未见用其作为原发性肝癌预警、早期诊断和疗效评估的检测指标。

发明内容

本发明的目的是提供一种检出率高、重复性好的原发性肝癌血清标志物检测试剂盒。

本发明试剂盒，根据乙型肝炎病毒X抗原HBx可诱发5种细胞蛋白URG4、URG7、URG11、S15a和Sui1的高表达以及这5种蛋白所诱导的抗体具有较好的特异性和敏感性的特点，将上述5种蛋白所诱导的抗体作为原发性肝癌血清标志物，利用上述10条多肽作为抗原检测相应的抗体，以便在原发性肝癌发生前或发生早期发出预警提示或做出早期诊断，从而提高小肝癌的早期诊断率和肝癌患者的生存率，并通过观察这些指标在肝癌患者血清中的动态变化，及时评估治疗效果和病情转归情况。

本发明试剂盒组成如下：

1、抗原包被的酶标板

2、酶标抗体工作液：1瓶

3、样本稀释液：1瓶

4、洗涤液A：1瓶

5、洗涤液B：1管

6、阳性对照血清：1管

7、阴性对照血清：1管

8、显色液A：1瓶

9、显色液B：1瓶

10、终止液：1瓶

所说抗原包被的酶标板，其包被抗原分别为上述5组多肽抗原，L4-A和L4-B；L7-B；L11-1、L11-3和L11-4；L12-A和L12-B；以及Sui1-A和Sui1-B，除L7B单独包被外，其余都为同组多肽等比例混合包被，它们的氨基酸序列如表1所示；所说的酶标抗体工作液为HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗人二抗；样本稀释液为含有2.5％(W/V)BSA的Tris-HCl缓冲液；洗涤液A为0.2M的PBS(磷酸盐缓冲液)；洗涤液B为Tween-20；阳性对照血清为取自肝癌患者且上述5种指标抗体均为阳性的血清；阴性对照血清为上述5种指标抗体均为阴性的正常献血员的血清；显色液A为含有0.03％(V/V)H₂O₂(双氧水)的磷酸盐柠檬酸缓冲液；显色液B为含有1.5mM TMB(四甲基联苯胺)的柠檬酸缓冲液；终止液为2M的H₂SO₄溶液。

本发明试剂盒的10种多肽抗原可自己合成，也可委托相关单位合成，纯度大于95％。

本发明试剂盒使用方法如下：

1、制备洗涤液：洗涤液A用去离子水按体积比1：20的比例稀释，混匀后再按体积比加入0.1％的洗涤液B，充分混匀。此为洗涤液。

2、血清样本孵育：(1)将阳性血清对照、阴性血清对照和待测患者血清样本分别用样本稀释液作4倍稀释，分别加入到5组多肽抗原包被的酶标板的孔中，加盖，37℃孵育45分钟；(2)按常规用洗涤液洗涤，吸干洗涤液。

3、酶标二抗孵育：(1)在酶标板的各孔中加入酶标抗体工作液，加盖，37℃孵育45分钟；(2)同上用洗涤液洗涤，吸干洗涤液。

4、底物显色：按照体积比1：1的比例在各孔中依次加入显色液A和显色液B，室温避光显色5-10分钟，滴加终止液终止反应。

5、读数：用酶标仪双波长450/630nm读取酶标板上各孔的吸收值(A值)。

6、结果判定：待检患者血清样本的A值与阴性对照血清的A值的比值用P/N值表示，P/N值大于或等于2.5为阳性；小于或等于2为阴性；介于2和2.5之间为疑似样品，需重新检测，第二次检测时，P/N值大于或等于2.2为阳性，小于或等于2.2为阴性。若阳性对照血清的A值小于或等于0.6，或阴性对照血清的A值大于或等于0.06，说明试剂盒失效或操作不当，应重新检测。

7、结果评价：在5种抗体的检测指标中，若1种指标阳性，用“1+”表示，判定为肝癌疑似待查；2种指标阳性，用“2+”表示，判定为肝癌相关，应随访；3种或3种以上指标阳性，用“≥3+”表示，判定为肝癌密切相关。

经试剂盒评价实验和临床试用，本试剂盒特异性和敏感性好，可用于原发性肝癌发生前或发生早期的预警提示或早期诊断，从而提高肝癌患者的生存率，并通过观察血清相关指标的动态变化，及时评估治疗效果和病情转归情况。

附图说明

图1为本发明试剂盒酶标板示意图。

图2为本发明试剂盒用于200份临床血清样本阳性检出率图。

具体实施方式

现结合附图和实施例，对本发明作详细描述。

一、试剂和材料

1、多肽抗原：10条多肽L4-A、L4-B、L7-B、L11-1、L11-3、L11-4、L12-A、L12-B、Sui1-A和Sui1-B，委托上海吉尔公司合成，纯度>95％。

2、酶标抗体工作液：HRP标记的羊抗人二抗，为KPL公司产品。

3、TMB、Tween20为上海博采生物技术有限公司产品。

4、其他试剂均为国药集团化学品有限公司产品。

5、酶标微孔条：8×12低吸附酶标板为Greiner公司产品。

二、试剂盒的制备

1、制备抗原包被的酶标板

1)制备包被液：取碳酸氢钠(NaHCO₃)2.9g，碳酸钠(Na₂CO₃)1.6g，叠氮钠(NaN₃)0.2g，溶于去离子水400ml，调pH值至9.6后定容至500ml，4℃备用。此为0.05M碳酸盐缓冲液。

2)制备多肽抗原溶液：将纯度大于95％的10种多肽分别溶解于包被液，充分混匀，浓度为10μg/ml。

3)包被酶标板：除L7B为单独抗原溶液外，其余4组抗原溶液各等比例混合后按各组的标记分别加入到酶标板相应的微孔中，100μl/孔，加盖，37℃放置2小时，而后置于4℃过夜。

4)封闭：从各孔中吸出多肽抗原溶液，再分别加入封闭液，所说的封闭液为含有5％(W/V)BSA的0.02M Tris-HCl缓冲液，加盖，37℃孵育2小时，吸出封闭液，密封冻干后置于4℃保存备用，即为抗原包被的酶标板。

2、酶标抗体工作液：HRP标记的羊抗人二抗，使用前按照1：1000的比例用上述封闭液稀释而成。

3、样本稀释液：取Tris 0.6g，溶于去离子水400ml，用浓盐酸调pH值至7.4，加入12.5g的BSA，充分混匀后定容至500ml，4℃备用。此为含有2.5％(W/V)BSA的0.01M Tris-HCl缓冲液。

4、洗涤液A：取NaCl 16.0g，KCl　0.4g，Na₂HPO₄.12H₂O 6.96g，KH₂PO₄0.48g，溶于去离子水90ml中，调pH值至7.4，定容至100ml，4℃备用。此为0.2M的PBS。

5、洗涤液B：Tween-20。

6、阳性对照血清：经检测5个指标抗体均为阳性的肝癌患者血清。

7、阴性对照血清：经检测5个指标抗体均为阴性的正常献血员血清。

8、显色液A：取Na₂HPO₄ 0.73g，柠檬酸0.46g，30％H₂O₂ 1ml，加去离子水定容至1000ml，4℃备用。此为含有0.03％(V/V)H₂O₂的磷酸盐柠檬酸缓冲液。

9、显色液B：取TMB 39mg，柠檬酸0.11g，EDTA(乙二胺四乙酸)18.6mg，甘油20ml，DMSO(二甲基亚砜)3ml，加热溶解后加蒸馏水至100ml，4℃备用。此为含有1.5mM TMB的柠檬酸缓冲液。

10、终止液：为2M的H₂SO₄溶液。

实施例1：一种原发性肝癌血清标志物的检测试剂盒

本发明试剂盒的组成如下：

1.抗原包被的酶标板1块，该酶标板由10条1×8孔的酶标条组成，每2条为1组，共分为5组，分别标记为URG4、URG7、URG11、S15a和Sui1，以对应于包被的相应抗原，参见图1。如标记为URG4的酶标条，包被的是L4A和L4B；标记为URG7的，包被的是L7-B；标记为URG11的，包被的是L11-1、L11-2和L11-3；标记为S15a的，包被的是L12-A和L12-B；标记为Sui1的，包被的是Sui1-A和Sui1-B。

2、酶标抗体工作液 1瓶，含酶标抗体工作液20ml。

3、样本稀释液 1瓶，含样本稀释液20ml。

4、洗涤液A 1瓶，含洗涤液A 50ml。

5、洗涤液B 1管，含洗涤液B 1ml。

6、阳性对照血清 1管，含血清500μl。

7、阴性对照血清 1管，含血清500μl。

8、显色液A 1瓶，含显色液A 10ml。

9、显色液B1瓶，含显色液B 10ml。

10、终止液 1瓶，含终止液10ml。

本试剂盒可同时检测14人份血清样本。

本发明试剂盒可根据需要，可配置不同规格、型号和数量的酶标板，以及各试剂相应的试剂量。

实施例2：用本发明实施例1的试剂盒检测待检患者血清样本

1、将抗原包被的酶标板顺序标号URG4、URG7、URG11、S15a和Sui1，用胶带固定。

2、取阴性对照血清、阳性对照血清各1份，待检患者血清样本14份，共16份血清，酶标板每孔内先加入样本稀释液75μl，再按组分别从16份血清中各取25μl加入孔内，混匀，加盖，置于37℃孵育45min。

3、将洗涤剂A50ml用去离子水稀释至900ml，加入洗涤剂B1ml，充分混合后定容至1000ml，分别洗涤各孔5次，每次3分钟，拍干。

4、每孔内加入酶标抗体工作液100μl，加盖，置于37℃孵育45min，取出后洗涤各孔5次，每次3分钟，拍干。

5、每孔内依次加入显色液A和显色液B各50μl，室温避光显色10分钟。

6、每孔内加入终止液50μl。

7、用酶标仪以波长450nm/630nm测定各孔A值，结果如表2所示。

表2、样本检测A值。

9、结果判定及评价：根据判定和评价标准(参见本发明试剂盒使用方法第5、6条)，阳性对照的5个检测指标的A值均大于0.6，且阴性对照的5个检测指标的A值均小于0.06，本次检测数据有效；分别计算14个待检血清样本5个检测指标的P/N值，如表3所示；表3中有7个P/N值介于2和2.5之间，重新检测，测得A值后再计算P/N值，如表4所示，有2个P/N值大于2.2，判定为阳性；根据表3、表4判定及评价结果如表5所示。

表3、样本的P/N值。

表4、部分样本第二次检测的P/N值。

表5、样本判定和评价结果。

三、试剂盒评价

1、特异性实验

选取原发性肝癌、肝硬化患者和乙肝、丙肝、胃癌、直肠癌、肺癌、胆管癌患者血清样本各8份，进行ELISA检测，检测方法同实施例2，结果见表6。

表6、本发明试剂盒特异性实验结果。

由表6可见，原发性肝癌患者血清2个指标以上阳性率为100％(8/8)；肝硬化患者血清2个指标以上阳性率为87.5％(7/8)；乙肝和胆管癌患者血清2个指标以上阳性率分别为37.5％(3/8)和12.5％(1/8)。说明本发明试剂盒具有较好的敏感性和特异性。

2、精密性实验

(1)批内A值变异系数精密性实验：用同一批次制备的多肽抗原L4A和L4B包被的酶标板，取3份待检测血清进行检测，每份样品设10个复孔，A值检测方法同实施例2，根据各孔A值计算批内变异系数，结果见表7。

表7、本发明试剂盒批内A值变异系数精密性实验结果

由表7可见，批内A值变异系数均值为4.6％。按同法检测，其他4组多肽抗原包被的酶标板的批内A值变异系数均值都不超过5.5％。

(2)批间A值变异系数精密性实验：用10个不同批次制备的多肽抗原L4A和L4B包被的酶标板，取3份待检测血清进行检测，每份样品设10个复孔，A值检测方法同实施例2，根据各孔A值计算批内变异系数，结果见表8。

表8、本发明试剂盒批间A值变异系数精密性实验结果

由表8可见，批间A值变异系数均值为9.3％。按同法检测，其他4组多肽抗原包被的酶标板的批间A值变异系数均值都不超过10％。

以上实验表明，批内和批间变异系数均小于10％，说明本发明试剂盒具有较好的精密性。

四、本发明试剂盒的临床试用

由上海长征医院感染科提供血清样本200人份，其中肝癌患者血清60份、肝硬化患者血清52份、乙型肝炎患者血清49份、正常献血员血清39份，用本发明检测试剂盒进行检测，阳性检出率结果见图2。由图2可见：肝癌患者、肝硬化患者和乙型肝炎患者血清中，检出1种指标以上阳性率依次为90.4％、92.6％和61.7％，检出2种指标以上阳性率分别为78.6％、70.6％和48.3％。而在39份正常献血员血清中，1种指标以上阳性率仅为12.2％，2种指标以上阳性率仅为6.3％。上述结果表明，本发明试剂盒具有较好的敏感性和特异性。