表达抗传染性法氏囊病病毒微小RNA重组禽腺联病毒的制备方法

摘要

本发明建立的表达抗传染性法氏囊病病毒miRNA的重组禽腺联病毒制备方法属于基因工程和生物制品研究领域，包括siRNA的选择、双链短发夹寡核苷酸的合成与克隆、含miRNA表达盒禽腺联病毒转移载体的构建、重组禽腺联病毒的产生与鉴定、重组病毒表达的miRNA对传染性法氏囊病病毒复制和基因表达抑制作用的检测。与现有的其他技术相比，该系统不仅能在禽源细胞中有效、持久地表达miRNA，对传染性法氏囊病病毒复制和基因表达具有特异、持久的抑制作用，而且对家禽无任何致病作用，不仅可用于体外实验，而且可作为抗禽病毒感染的新型生物制剂进行开发。

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程和生物制品研究领域。具体涉及一种表达抗传染性法氏囊病病毒微小RNA重组禽腺联病毒的制备方法。

背景技术：

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来快速发展的一种序列特异性转录后基因沉默技术，在功能基因组研究、新药开发、癌症治疗和抗病毒感染等方面具有广泛的应用。在抗病毒感染方面，现有的研究资料显示，RNAi几乎能不同程度地抑制所有病毒(包括DNA和RNA病毒)的复制。

具有RNAi作用的干扰RNA包括短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。目前获得siRNA或miRNA的方法主要有化学合成法、体外转录法和载体表达法。其中，人工合成的siRNA能获得满意的基因沉默效果，但其合成成本昂贵且作用时间短暂；质粒载体表达siRNA或miRNA的时间相对较长，表达载体易于大规模制备且费用较低，是目前最常用的方法，但表达的siRNA或miRNA的抑制作用受细胞转染效率的限制。

腺联病毒(AAV)是一类复制缺陷型DNA病毒，需在腺病毒等辅助病毒存在下才能复制和增殖。作为基因转移载体，AAV具有无致病性、免疫原性低、细胞感染谱广和外源基因表达稳定等优点，是很有应用前景的基因转移载体。哺乳动物的AAV已被用做siRNA或miRNA的传递载体，表达时间及基因沉默作用能维持数月之久，有的已进入人体临床试验。禽腺联病毒(AAAV)具有与哺乳动物AAV类似的潜伏感染特性和基因组结构，已被证明能在禽源细胞中稳定表达外源基因，但尚无用AAAV传递抗禽病毒siRNA或miRNA的报道。

发明内容：

本发明的目的在于建立能用于鸡体内外试验、通用表达抗禽病毒miRNA重组AAAV的制备和使用方法。

发明的技术方案包括siRNA的选择、短发夹双链寡核苷酸的合成与克隆、含RNAi表达盒AAAV转移载体的构建、表达miRNA重组AAAV的制备以及抑制病毒复制效果的检测：

a、siRNA的选择：用GenScrript Corporation(http://www.genscript.com)的siRNA分析软件siRNA Target Finder分析鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)序列，获得针对不同毒株VP1或VP2基因保守区的候选siRNA；

b、短发夹寡核苷酸的合成与克隆：根据禽源细胞RNAi专用载体pRFPRNAiC说明书，用通用引物和DNA多聚酶链式反应(PCR)合成短发夹寡核苷酸，将PCR产物定向克隆入pRFPRNAiC载体；

c、含RNAi表达盒AAAV转移载体的构建：用限制酶PmlI和BsmBI消化含AAAV全基因组的pCR-AAAV载体，电泳分离后回收包括两端ITR的4.1kb载体片段，用Klenow酶补平；用限制酶SalI和BamHI双酶切含RNAi表达盒的pRFPRNAiC载体，电泳分离后回收RNAi表达盒，经Klenow酶补平后与AAAV转移载体片段连接，获得含RNAi表达盒的重组AAAV转移载体；

d、表达miRNA重组AAAV的制备：将含RNAi表达盒的重组AAAV转移载体、AAAV辅助载体pcDNA-ARC和腺病毒辅助载体pHelper组成三质粒系统，用磷酸钙沉淀法转染AAV-293细胞，转染后72h收获细胞，-20℃/37℃冻融4次后，用氯仿抽提和聚乙二醇沉淀重组病毒。

在上述步骤d中，利用重组AAAV转移载体、AAAV辅助载体pcDNA-ARC和腺病毒辅助载体pHelper共转染AAV-293细胞，产生的纯化重组AAAV的感染性滴度大于5×10⁸病毒颗粒/毫升。

抑制病毒复制效果的检测：以10病毒颗粒/细胞的剂量，用重组AAAV转导鸡DF-1细胞系，转导后48h用IBDV感染，感染后24h用半定量RT-PCR、50％组织细胞感染剂量(TCID₅₀)测定法检测细胞培养中的IBDV滴度。利用重组病毒转导鸡细胞，对IBDV基因表达的抑制效率大于90％，能使IBDV的TCID₅₀降低7lg以上；在体外培养的细胞中，这种抑制作用至少维持96h，具有严格的序列特异性；不仅可用于抗IBDV miRNA的表达，也可以用于抗其它禽病毒miRNA的表达；不仅可用于体外试验，还可作为抗禽病毒感染的新型生物制剂进行开发。

本发明中，用GenScrript Corporation的siRNA Target Finder软件分析IBDV序列，是因为该公司是提供RNAi产品和技术服务的专业公司，用其软件预测siRNA的可靠性已被我们和其他人的实验证实；用pRFPRNAiC作为mIRNA的表达载体，是因为该载体专为禽源细胞RNAi试验设计，可同时表达针对相同或不同病毒(基因)的两个miRNA，而目前常用的含人或鼠H1或U6启动子的其它RNAi载体不能在禽源细胞有效表达siRNA或miRNA；将mIRNA表达盒插在AAAV转移载体的ITR之间，构建的重组转移载体可作为单独或同时表达不同miRNA的通用载体；用含miRNA表达盒的AAAV转移载体、AAAV辅助载体pcDNA-ARC和腺病毒辅助载体pHelper组成的三质粒系统转染法，可在禽源细胞中有效产生重组AAAV；产生的重组AAAV能在禽源细胞中有效表达miRNA，表达的miRNA能特异、持久地抑制IBDV复制和基因表达。

与现有的其他技术相比，以AAAV作为miRNA传送载体不仅能在禽源细胞中有效、持久地表达miRNA，而且对家禽无任何致病作用，不仅可用于体外实验，而且可作为抗禽病毒感染的新型生物制剂进行开发。

附图说明：

图1为miRNA表达重组载体的结构示意图。

Amp代表氨卞青霉素抗性基因；P_ACTIN代表鸡肌动蛋白基因启动子；RFP代表红色荧光蛋白基因；polyA代表转录终止信号；U6为鸡U6启动子；27ntU6 leader为U6前导序列；miRNA flank为miRNA30样侧翼序列；pol III terminator为miRNA转录终止序列。

图2为miRNA表达AAAV转移载体的结构示意图。

pAITR-RFP-miRNA分别代表pAITR-RFP-miVP1、pAITR-RFP-miVP2E和pAITR-RFP-miVP2con Amp代表氨卞青霉素抗性基因；ITR代表AAAV末端反转重复序列；RFP代表红色荧光蛋白基因表达盒；RNAi代表miVP1、miVP2E和miVP2con表达盒。

图3为重组AAAV的电镜照片。

图4为重组AAAV感染DF-1细胞的荧光显微镜照片。

图5为重组AAAV中miRNA表达盒的PCR检测结果。

M代表DNA分子量标准；1为pRFPRNAiC载体作为阴性对照；2为pRFPRNAiVP2E载体阳性对照；3为AAAV-RFP-miVP2E；4为AAAV-RFP-miVP1；5为AAAV-RFP-miVP2con；6为AAAV-RFP。

图6为miRNA抑制IBDV基因表达的流式细胞术检测结果。

图7为miRNA抑制同源株IBDV复制的TCID₅₀检测结果。

图8为miRNA抑制同源株IBDV复制的RT-PCR检测结果。

图9为miRNA抑制异源株IBDV复制的TCID₅₀检测结果。

具体实施方式：

载体来源：

pRFPRNAiC载体：从英国ARK-GENOMICS公司引进。(文献：Das，R.Met al.Developmental Biology，2006，294：554-563)

pCR-AAAV载体：扬州大学孙怀昌实验室构建和保存。(文献：王建业等.扬州大学学报(农业与生命科学版)，2005，26：1-4)

pcDNA-ARC：扬州大学孙怀昌实验室构建和保存。(Wang，A.P.et al.Chinese Journal of Virology，2007，23：292-297)

pEGFP-N1：从美国BD Biosciences Clontech公司引进。(GenBankAccession#U55762；Catalog #6085-1；PT3027-5)

pHelper：从美国Stratagene公司引进。(文献：Matsushita，T.，et al.GeneTherapy，1998，5：938-945)

具体操作步骤如下：

一、siRNA的选择：

用GenScript Corporation(http://www.genscript.com)的siRNA TargetFinder软件及使用方法分析IBDV VP1基因序列(GenBank登录号：AY918947)，选择其中1个(命名为miVP1)进行本试验，其序列(5′-GTACCCAGAAGTCAAGAAC-3′)与已报道的能有效抑制IBDV复制的抗VP1干扰RNA相同(参考文献1：以DNA载体为基础的有效抑制传染性法氏囊病病毒的体外复制.抗病毒研究，2008，79(2)，87-94.Effectiveinhibition of infectious bursal disease virus replication in vitro by DNAvector-based RNA interference.Antiviral Research，2008，79(2)，87-94.)。

用同样方法分析IBDV VP2基因序列(GenBank登录号：AY918948)，获得10个候选siRNA。选择其中1个siRNA(命名miVP2E)和1个对照siRNA(miVP2con)进行本实验，序列分别为：

miVP2E：5′-ACAGCCAATCACATCCATCAAA-3′；

miVP2con：5′-ACGTCTACCCTATAGGCTATGA-3′。

二、短发夹寡核苷酸的合成与克隆：

根据禽源细胞RNAi载体pRFPRNAiC(ARK-GENOMICS，UK)说明书，设计针对miVP1、miVP2E和miVP2con的双链寡核苷酸，序列如下：

  miRNA  序列  miVP1  GAGAGGTGCTGCTGAGCGATACCCAGAAGTCAAGAACTAGTGAAGCCACAGATGT  ATTCACCACCACTAGGCAGTACCCAGAAGTCAAGAACTACATCTGTGGCTTCACT  miVP2E  GAGAGGTGCTGCTGAGCGACAGCCAATCACATCCATCAAATAGTGAAGCCACAGATGTA  ATTCACCACCACTAGGCACCAGCCAATCACATCCATCAAATACATCTGTGGCTTCACT  miVP2con  GAGAGGTGCTGCTGAGCGACGTCTACCCTATAGGCTATGATAGTGAAGCCACAGATGTA  ATTCACCACCACTAGGCACCGTCTACCCTATAGGCTATGATACATCTGTGGCTTCACT

分别取每对寡核苷酸各3μg溶于48μl退火缓冲液(10mM Tris.HCI，100mM NaCl，pH7.4)中，经90℃/4min→70℃/10min→37℃/15min退火后，自然冷却至室温获得双链shRNA。将短发夹双链寡核苷酸定向克隆入pRFPRNAiC载体的Bgl II和Hind III位点，获得的重组载体分别命名为pRFPRNAmiVP1、pRFPRNAmiVP2E和pRFPRNAmiVP2con(图1)。

三、含RNAi表达盒AAAV转移载体的构建：

先后用限制酶Pml I和Bsm BI消化含AAAV全基因组的pCR-AAAV载体(参考文献2：禽腺联病毒的分离及基因组鉴定.扬州大学学报，2005，26(2)：1-4。)，经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA凝胶回收试剂盒(Promega，USA)回收含AAAV左右ITR的4.1kb载体片段(命名为pAITR)，用常规的Klenow酶将两端补平；用限制酶Sal I和Bam HI将miRNA表达盒与RFP表达盒一起从pRFPRNAmiVP1、pRFPRNAmiVP2E和pRFPRNAmiVP2con载体上切下，经Klenow酶补平后，与AAAV载体片段连接，连接产物用常规方法转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，获得的重组转移载体分别命名为pAITR-RFP-miVP2E、pAITR-RFP-miVP2con和pAITR-RFP-miVP1(图2)。用限制酶Sal I和Dra I消化pRFPRNAiC载体，切下的RFP表达盒经电泳分离、凝胶回收和末端补平后，与AAAV转移载体pAITR连接，获得的对照转移载体命名为pAITR-RFP(图2)。

四、表达miRNA重组AAAV的制备：

分别将重组载体pAITR-RFP-miVP1、pAITR-RFPmiVP2E、pAITR-RFP-miVP2con和pAITR-RFP与AAAV辅助载体pcDNA-ARC(表达绿色荧光蛋白报告基因重组禽腺联病毒的构建与鉴定.病毒学报，2007，23(4)：292-297)和腺病毒辅助载体pHelper(Stratagene)组成三质粒转染系统(参考文献3：不需辅助病毒的腺联病毒载体有效制备方法.基因疗法，1998，5：938-945.Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced withouthelper virus.Gene Ther，1998，5：938-945)，用常规的磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞(Stratagene)，转染后72h收获细胞，于-20℃乙醇浴/37℃水浴反复冻融4次，10000rpm离心10min，收集的上清液即为重组AAAV病毒液。用氯仿抽提和聚乙二醇沉淀法获得1000倍浓缩的纯化重组病毒。(参考文献4：一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法.科学通报，2000，45：2071-2075)

五、重组AAAV的鉴定：

将50μl初步纯化的重组AAAV滴在支持膜的铜网上，10min后用滤纸吸去多余液体，滴加3％磷钨酸溶液(pH6.0)染色2-3min，立即进行透射电镜观察，观察到的重组AAAV形态如图3所示。

将DF-1细胞接种24孔培养板，1×10⁵细胞/孔，以含10％犊牛血清(FCS)的DMEM为培养液，在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；次日吸弃培养液，每孔细胞接种200μl未纯化的重组AAAV，37℃、5％CO2孵育2h后，每孔补加300μl含10％FCS的DMEM和终浓度为10mmol/L的丁酸钠，37℃、5％CO2孵育48h后，直接在荧光显微镜下观察，观察到的RFP阳性细胞如图4所示，说明重组AAAV对禽细胞具有感染性。

将DF-1细胞按1×10⁴细胞/孔的密度接种96孔培养板，以含10％FCS的DMEM为培养液，37℃、5％CO2培养过夜后，用含2％FCS的DMEM将纯化的重组AAAV做连续倍比稀释，每孔细胞接种50μl，37℃孵育2h，每孔补加50μl含10％FCS的DMEM，继续孵育48h，在荧光显微镜下计数各孔红色荧光阳性细胞数，计算重组AAAV的感染性滴度为每毫升5×10⁸个病毒颗粒。

按照(参考文献5：重组AAAV载体的制备.人类遗传学最新分析程序，1996.Production of recombinant adeno-associated viral vectors.In：Dracopoli N，ed.Current Protocols in Human Genetics.New York：John Wiley，1996)提取重组AAAV的病毒核酸，根据miRNA表达盒上、下游序列设计一对引物，正、反向序列分别为：正向引物：TCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAGCCC；反向引物：CCGATTCATTAATGCAGCGGATCCATCGATAAAAAAGCTTACCGT。

扩增miRNA表达盒的50μl PCR体系为：5μl 10×缓冲液，2μl病毒核酸，15pmol正、反向引物，5U DNA Polymerase；30次循环PCR程序为：94℃/45s(第一循环为4min)，69℃/45s，72℃/1min(最后一次循环为10min)。扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图5，说明重组AAAV基因组含有miRNA表达盒。

六、miRNA抑制IBDV基因表达的流式细胞术检测

根据IBDV VP2基因序列(GenBank登录号：AY918948)设计一对PCR引物，其序列分别为5′-CGAAGCTTATGACAAACCTGACAGATCAAAC-3′和5′-GCGTCGACCTCCTTATGGCCCGGATTATG-3′。以从IBDV感染DF-1细胞提取的RNA为模板，根据MMLV Reverse Transcriptase Kit(Bio Basic Inc，USA)说明书扩增VP2 cDNA。20μl反转录体系组成为：4μg RNA，10pmol反向引物，40 U RNasin，10mmol dNTP和200U反转录酶。50μl PCR反应体系为：4μl反转录产物，10pmol正反向引物，10mmol dNTP，1.5mMMgCl₂和3 U Taq DNA聚合酶。30个循环的PCR程序为：94℃热变性45s(第一循环为4min，58℃退火90s，72℃延伸45s(最后1个循环为10min)。将PCR产物克隆入表达载体pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech，USA)的Hind III/Sal I位点，使其与载体中绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的5′端融合，获得的报告载体命名为pVP2-EGFP。

将DF-1细胞接种24孔培养板，1×10⁵细胞/孔，以含10％FCS的DMEM为培养液，在37℃、5％CO2培养至细胞密度约为80％；弃去培养液，按照10个病毒颗粒/细胞剂量，用重组AAAV转导细胞，500μl/孔；在感染后48h，按0.4μg/孔剂量用报告载体pVP2-EGFP转染；在转染后24、48、72、96h，按照常规胰酶消化法分散细胞，200g离心5min，收集的细胞用PBS离心洗涤3次(1000g离心5min)，最终用400μl PBS将细胞稀释至10⁶个细胞/ml，按照流式细胞仪(BD Biosciences Clontech，USA)说明书检测每孔3×10⁴个细胞的荧光强度。与对照病毒AAAV-RFP-miVP2con或AAAV-RFP相比，AAAV-RFP-miVP2E转导细胞的VP2基因表达抑制率为90.2％，而AAAV-RFP-miVP1转导细胞的VP2基因表达未受抑制(图6)，说明重组病毒AAAV-RFP-miVP2E表达的miVP2E对VP2基因表达的抑制作用强且具有序列特异性。

七、miRNA抑制同源株IBDV复制的TCID₅₀检测

将DF-1细胞接种24孔培养板，1×10⁵细胞/孔，以含10％FCS的DMEM为培养液，在37℃、5％CO2培养至细胞密度约为80％；弃去培养液，按照10个病毒颗粒/细胞的剂量，用重组AAAV转导细胞(500μl/孔，37℃吸附2h)；在转导后48h，每孔细胞以400 TCID₅₀剂量，用同源Lukert株IBDV感染(n＝3)；在感染后24、48、72、96h，分别取100μl细胞上清液，按照(参考文献6：传染性法氏囊病病毒：抗原制备与免疫.兽医研究杂志，1975，36：539-540.Infectious bursal disease virus：antigen production and immunity.J VetRes，36，539-540)进行病毒TCID₅₀测定，以AAAV-RFP转导组为对照，计算重组IBDV复制抑制率。结果与AAAV-RFP转导细胞相比，从感染后24h起，AAAV-RFP-miVP1和AAAV-RFP-miVP2E转导细胞的IBDV滴度分别下降7lg，这种抑制作用至少持续96h，而AAAV-RFP-miVP2con转导细胞的IBDV滴度无明显下降(图7)。

八、miRNA抑制同源株IBDV复制的半定量RT-PCR检测

将DF-1细胞接种24孔培养板，1×10⁵细胞/孔，以含10％FCS的DMEM为培养液，在37℃、5％CO2培养至细胞密度约为80％；弃去培养液，按照10个病毒颗粒/细胞的剂量，用重组AAAV转导细胞(500μl/孔，37℃吸附2h)；在转导后48h，每孔细胞以400 TCID₅₀剂量，用同源Lukert株IBDV感染(n＝3)；在感染96h，收集各孔细胞，按照MMLV Reverse Transcriptase Kit(Bio BasicInc，USA)说明书提取总RNA，以Oligo(dT)18为引物进行反转录反应；然后以β-actin基因为内参，用半定量RT-PCR检测IBDV VP2基因表达。扩增VP2转录产物的PCR引物序列为：

正向引物：5-ATGACAAACCTGACAGATCAAAC-3；

反向引物：5-CTCCTTATGGCCCGGATTATG-3。

50μl PCR反应体系组成为：4μl反转录产物，10pmol正、反向引物，10mmol dNTP混合物，1.5mM MgCl2，3 U Taq DNA聚合酶。

扩增VP2转录产物的30次循环的PCR程序为：94℃，45s(第一循环为4min)；58℃，90s；72℃，45s(最后1循环为10min)。

扩增β-actin转录产物的PCR引物序列为：

正向引物：5-TTCTACAATGAGCTGAGAGTA-3；

反向引物：5-GAGGTAGTCCGTCAGGTCACG-3。

扩增β-actin转录产物的23次循环的PCR程序为：94℃，45s(第一循环为4min)；52℃，40s；72℃，40s(最后1循环为10min).

反应结束后，各取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，经在溴乙锭染色后，用凝胶图像分析系统对目的条带进行灰度扫描，以β-actin条带为参考，根据从重组AAAV转导细胞扩增的VP2条带的灰度变化判断miRNA对IBDV基因表达的抑制作用。结果与AAAV-RFP转导细胞相比，AAAV-RFP-miVP1和AAAV-RFP-miVP2E转导细胞中IBDV VP2基因表达的抑制率分别为89.6％和85.2％，这种抑制作用至少持续96h，而AAAV-RFP-miVP2con转导对IBDV VP2基因表达无抑制作用(图8)。

九、miRNA抑制异源株IBDV复制的TCID₅₀检测

将DF-1细胞接种24孔培养板，1×10⁵细胞/孔，以含10％FCS的DMEM为培养液，在37℃、5％CO2培养至细胞密度约为80％；弃去培养液，按照10个病毒颗粒/细胞的剂量，用重组AAAV转导细胞(500μl/孔，37℃吸附2h)；在转导后48h，每孔细胞以400 TCID₅₀剂量，用异源YEZ株或LYG株IBDV感染(n＝3)；在感染后24、48、72、96h，分别取100μl细胞上清液，按照文献6进行病毒TCID₅₀测定，以AAAV-RFP转导组为对照，计算重组IBDV复制抑制率。结果与AAAV-RFP转导细胞相比，AAAV-RFP-miVP1转导细胞中的YEZ和LYG株IBDV的TCID₅₀分别下降7.0和6.5lg，AAAV-RFP-miVP2E转导细胞的两株IBDV的TCID₅₀分别下降7.0和2.5lg，这种抑制作用至少持续96h，而AAAV-RFP-miVP2con转导细胞的两株IBDV滴度无明显下降(图9)。