抗日本血吸虫单抗NP11－4嵌合Fab抗体及其制备方法、应用

摘要

本发明抗日本血吸虫单抗NP11－4嵌合Fab抗体及其制备方法、应用涉及基因工程技术及制备血吸虫病治疗药物领域。应用定位于日本血吸虫成虫表膜、尾蚴膜、童虫膜、虫卵卵壳及卵内毛蚴膜的单抗NP11－4，利用基因工程技术提取杂交瘤细胞株总RNA，RT－PCR方法扩增V

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种抗日本血吸虫单抗NP11-4嵌合Fab抗体及其制备方法、应用，是利用基因工程技术，制备抗日本血吸虫嵌合Fab抗体。嵌合Fab可变区基因片段来自定位于日本血吸虫成虫表膜、尾蚴膜、童虫膜、虫卵卵壳及卵内毛蚴膜的单克隆抗体NP11-4，利用基因工程技术扩增轻链、重链可变区基因，再分别将重链可变区基因V_H与人IgG₁的C_H1、轻链可变区基因V_L与人IgG₁的C_L通过PCR扩增Fd及全长L，再将Fd及全长L通过重叠延伸PCR扩增出嵌合Fab基因片段，嵌合Fab基因与载体pComb3XSS连接，构建出嵌合Fab的原核表达载体，在大肠杆菌Top10F’中表达嵌合Fab抗体，用于制备日本血吸虫病的治疗药物或制备抗日本血吸虫免疫毒素。本发明涉及抗体工程技术和血吸虫病的治疗药物领域。

背景技术

危害人体的血吸虫主要有日本血吸虫、埃及血吸虫和曼氏血吸虫三种，主要分别分布于亚洲(东部和南部)、非洲和南美洲广大地区，患病人数约2亿左右。在我国流行的是日本血吸虫病，分布在长江流域及其以南的十二个省、市、自治区。解放时全国约有一千余万患者，一亿人口受到本病威胁，有螺面积143亿平方米，是危害农民健康最严重的寄生虫病。我国血吸虫病防治工作取得了很大成绩。但目前长江中下游江湖洲滩地区及大山区的防治任务仍很艰巨，少部分地区血吸虫病疫情有回升、扩展趋势，所以血吸虫病被列为我国“十一五”期间重点防治的重大传染病。目前受血吸虫感染威胁人口约1亿，有现症病人84万，作为重要传染源的牛、羊、猪也有数千万头，所以血吸虫病的防治任务非常艰巨。

日本血吸虫尾蚴、童虫、成虫和虫卵等阶段均可对人体产生不同程度的损伤和复杂的免疫病理反应。一般来说，尾蚴、童虫、成虫所致的损伤，多为一过性或较轻微，而虫卵沉积于肝、肠等组织内诱发的虫卵肉芽肿及随之发生纤维化是血吸虫病的主要的病理基础。血吸虫抗原成分，如肠相关抗原、膜相关抗原和可溶性虫卵抗原以及虫体代谢或死亡产物，都可引起机体变态反应性损伤。

目前血吸虫病的治疗以吡喹酮化疗为主，虽然吡喹酮的治疗可取得可靠疗效，但急性血吸虫感染的死亡时有发生，慢性血吸虫病肝脏纤维化尚无有效的治疗方法，可引起显著的门脉高压，由此导致的上消化道出血、脾肿大、腹水，是引起患者死亡、丧失劳动力的主要原因。另外，单一化疗药物的长期使用可能出现耐药性问题，长期应用还有可能诱发抗药虫株。因此，血吸虫病的治疗仍然存在很多问题，直接影响国家的投资环境，影响和谐社会和小康社会的建设。所以，探索新的高效低毒的血吸虫病治疗药物就显得尤为重要。

发明内容

本发明目的是针对上述不足之处提供一种抗日本血吸虫单抗NP11-4嵌合Fab抗体及其制备方法、应用，是利用基因工程技术提取抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4杂交瘤细胞总RNA，RT-PCR方法扩增V_H、V_L基因，利用PCR分别将重链可变区基因V_H与人IgG₁的C_H1、轻链可变区基因V_L与人IgG₁的C_L扩增Fd及全长L，再将Fd及全长L通过重叠延伸PCR扩增出嵌合Fab基因片段，将嵌合Fab基因与载体pComb3XSS连接，克隆至大肠杆菌Top10F’，诱导目的蛋白可溶性表达。该蛋白应用于制备日本血吸虫病的治疗药物领域。

本发明抗日本血吸虫单抗NP11-4嵌合Fab抗体及其制备方法、应用，制备了定位于日本血吸虫成虫表膜、尾蚴膜、童虫膜、虫卵卵壳及卵内毛蚴膜的单克隆抗体NP11-4，NP11-4为鼠源性单抗，作为异种蛋白用于人体可引起免疫反应，产生人抗小鼠抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)，诱发过敏反应。现通过对鼠单抗NP11-4进行基因工程抗体改造，构建的嵌合Fab既具有抗原结合特异性，又降低了鼠单克隆抗体的异源性，可应用于日本血吸虫病的治疗领域。

抗日本血吸虫单抗NP11-4嵌合Fab抗体及其制备方法、应用是采取以下方案实现：

一种抗日本血吸虫单抗NP11-4嵌合Fab抗体，即抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4嵌合Fab抗体N端从第1个氨基酸到第215个氨基酸为嵌合Fab抗体的全长L链，从第216个氨基酸到第488个氨基酸为嵌合Fab抗体的Fd段，两者之间由二硫键连接，全长488个氨基酸，其氨基酸序列为：

Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys ArgSer Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln LysPro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Lys Val SerAsn Arg Phe Ser Gly Val ProAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val GluAla Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe GlyGly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProSer Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe TyrPro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser GlnGlu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu ThrLeu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln GlyLeu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Lys Tyr Leu Leu Pro ThrAla Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Leu Glu Val GlnLeu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys LysAla Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp Leu Gly Trp Val Lys GlnArgPro Gly HisGly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Val Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu LysPhe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln LeuSer Ser Leu Thr Ser Glu Asp Val Phe Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly Tyr Asp GlySer Ser Gln Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser ThrLys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Lys Thr Ser Gly Gly Thr AlaAla Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn SerGly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu TyrSer Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile CysAsn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser CysAsp Lys Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro TyrAsp Val Pro Asp Tyr Ala Ser。

抗日本血吸虫单抗NP11-4嵌合Fab抗体的制备方法，具体方法如下：

抗日本血吸虫单抗NP11-4杂交瘤细胞总RNA的提取

复苏抗日本血吸虫单抗NP11-4杂交瘤细胞，应用Trizol试剂，，提取杂交瘤细胞总RNA，(5～10)×10⁶杂交瘤细胞加1毫升的Trizol溶液，充分混匀后，倒入1.5毫升离心管中，室温静置5分钟，再加入200微升的氯仿，用力摇晃离心管15秒，充分混匀，4℃静置5分钟，后12000rmp 4℃离心15分钟，将约500微升的上层水相转入新的1.5毫升离心管中，加入0.5毫升异丙醇，混匀后4℃静置5分钟，后12000rmp4℃离心10分钟，小心倒掉上清，留取沉淀，加预冷的1毫升现配75％的乙醇振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp 4℃离心5分钟，小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干，在管中加20微升的DEPC水溶解RNA，提取的RNA通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，在反转录酶作用下逆转录获得cDNA；

单抗NP11-4可变区基因片段的克隆

分别设计19条V_H上游引物和17条V_K上游引物，4条V_H下游引物和3条V_K下游引物引物：

V_K5’上游引物：

V_K-1

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C-3’

V_K-2

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C-3’

V_K-3

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C-3’

V_K-4

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGY TRACAC AGT C-3’

V_K-5

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C-3’

V_K-6

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTM AGA TRA MCC AGT C-3’

V_K-7

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C-3’

V_K-8

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C-3’

V_K-9

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C-3’

V_K-10

5’-GGG CCC AGG CGG CCGAGC TCG AYATTG WGC TSA CCC AAT C-3’

V_K-11

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTS TRA TGA CCC ART C-3’

V_K-12

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTK TGA TGA CCC ARA C-3’

V_K-13

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C-3’

V_K-14

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A-3’

V_K-15

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T-3’

V_K-16

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C-3’

V_K-17

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C-3’

V_K3’下游引物

V_KR1

5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT KAT TTC CAG YTT GGT CCC-3’

V_KR2

5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC-3’

V_KR3

5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’

V_H 5’上游引物

V_H1

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR MAG CTT CAG GAG TC-3’

V_H 2

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC-3’

V_H 3

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG CTG AAG SAS TC-3’

V_H 4

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3’

V_H 5

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAG CTB CAG CAR TC-3’

V_H 6

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAR CTG CAG CAG TC-3’

V_H 7

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAC GTG AAG CAG TC-3’

V_H 8

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAS STG GTG GAA TC-3’

V_H 9

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AWG YTG GTG GAG TC-3’

V_H 10

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG SKG GTG GAG TC-3’

V_H 11

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAM CTG GTG GAG TC-3’

V_H 12

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC-3’

V_H 13

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAR CTT GTT GAG TC-3’

V_H 14

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC-3’

V_H 15

5’-GCT GCC CAACCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAR STT GAG GAG TC-3’

V_H 16

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTT ACT CTR AAA GWG TST G-3’

V_H 17

5’-GCT GCC CAA CCA GCCATG GCC CTC GAG GTC CAA CTV CAG CAR CC-3’

V_H 18

5’-GCT GCC CAACCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAC TTG GAA GTG TC-3’

V_H 19

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG GTC ATC GAG TC-3’

V_H 3’下游引物

V_H R1

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT-3’

V_H R2

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT-3’

V_H R3

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT-3’

V_H R4

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT-3’

将V_K5’上游引物、V_K3’下游引物、V_H5’上游引物，V_H3’下游引物各溶为终浓度100pmol/ul，然后均以1：1体积比例混匀，分别扩增V_H、V_L基因，扩增条件为95℃ 4分钟，95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；最后72℃延伸10分钟，电泳回收、纯化扩增的基因片段，连至pMD-18T载体，转化大肠杆菌XL1-blue，测序后获得轻链、重链可变区序列，序列如下：

V_L  342bp

GAG CTC GAT ATT TTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGAGAT CAA GTC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGAAAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CCC CTGATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGTGGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTGGGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACC TTC GGA GGG GGGACC AAA CTG GAA ATC AAA

V_H  366bp

CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCAGTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGTTGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT TAC CCTGGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACTGCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAGGAC GTT TTT GTT TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCTCTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA

嵌合Fab基因的克隆：

根据上述序列分别设计扩增构建嵌合Fab基因的Fd上游引物：

5-G C T G C C C A A C C A G C C AT G G C C-3，下游引物：5-A G A A G C G T A G T C C G G A A C G T C-3，L上游引物：5-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGCTC-3，下游引物：5-GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3，嵌合Fab的上游引物：5-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGCTC-3，下游引物：5-GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3，扩增嵌合Fab基因的上下游引物均引入SfiI的酶切位点，将纯化后的重链可变区基因V_H与人IgG₁的C_H1、轻链可变区基因V_L与人IgG₁的C_L通过PCR扩增Fd及全长L，扩增条件为95℃ 4分钟，95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环，最后72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳分别回收、纯化扩增的Fd、L基因片段，再采用重叠延伸PCR将Fd、L基因连接成嵌合Fab基因，扩增条件为将Fd及全长L混匀，在无外加引物的情况下，互为引物和模板，PCR反应94℃5分钟，94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 60秒，扩增6个循环后，在反应体系中加入嵌合Fab的上游引物和下游引物，PCR反应94℃ 30秒，60℃ 50秒，72℃ 50秒，扩增20个循环，最后72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳回收、纯化嵌合Fab基因片段，连接至pMD-18T，转化感受态大肠杆菌Top10F’，测序验证得到正确的嵌合Fab基因片段，序列如下：

ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GTCTCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGAAAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCAAAG CCC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCAGAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAGATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TATTAC TGC TTTCAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTGGAA ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCGCCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGCCTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAGGTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACAGAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTGACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGCGAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TTG CCC GTC ACA AAG AGC TTCAAC AGG GGA GAG TGT TAG TTC TAG ATA ATT AAT TAG GAG GAA TTTAAA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTACTC GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAGTCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCA GTG AAG ATA TCCTGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGT TGGGTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATTTAC CCT GGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGCAAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATGCAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC GTT TTT GTT TAT TTT TGTGCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCT CTT GCT TAC TGGGGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GCC TCC ACC AAG GGCCCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGGGGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAACCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTGCAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTCAGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACCTAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GACAAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT AGT GGC CAG GCCGGC CAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGC GCA TAC CCG TAC GAC GTTCCG GAC TAC GCT TCT

嵌合Fab重组质粒的构建

提取质粒pComb3XSS，用SfiI单酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的质粒大片段，溶于灭菌去离子水中，同样用SfiI对测序正确的嵌合Fab基因片段酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化后溶于灭菌去离子水中，取等摩尔浓度的酶切嵌合Fab基因片段和酶切pComb3XSS，在同一进口200μl离心管内用T4 DNA连接酶连接，使嵌合Fab基因片段插入到pComb3XSS表达载体中，构建出表达NP11-4嵌合Fab抗体的原核表达载体。

嵌合Fab重组质粒的筛选及鉴定

将嵌合Fab重组质粒转化感受态大肠杆菌Top10F’，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素LB平板，置37℃过夜，次日随机挑取转化菌落和转化质粒pComb3XSS的对照菌行菌液PCR鉴定。菌液PCR扩增结果显示重组质粒含有嵌合Fab基因片段，而pComb3XSS质粒没有此片段。将菌液PCR为阳性的菌液抽提质粒，SfiI酶切鉴定，可见在约3500bp和1500bp处各有基因片段出现，说明嵌合Fab重组质粒构建成功。

表达嵌合Fab抗体工程菌的筛选鉴定：

将转化子接种至2ml含有氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基内，37℃振荡培养3小时，至菌液OD值至0.8-1.0时，加终浓度为1mmol/L的异丙基—β—D—硫代半乳糖苷(异丙基—B—D—硫代半乳糖苷(IPTG))，25℃继续振荡培养诱导20小时，离心收集菌体，菌体重悬于原培养液1/10体积的pH7.4的磷酸盐缓冲液内，冰浴超声20秒，将超声裂解液12 000rpm4℃离心30分钟，分别收集超声裂解上清和超声裂解沉淀，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，超声裂解上清和超声裂解沉淀内都表达相对分子量约为34kD的Fd、26kD的L蛋白，而对照菌Top10F’无这两条蛋白条带。

嵌合Fab抗体的大量表达与纯化：

1)嵌合Fab抗体的大量表达

将转化子接种至4升含有氨苄青霉素100μ g/ml的LB培养基内，37℃振荡培养3小时，至菌液OD值至0.8-1.0时，加终浓度为1mmol/L的，25℃继续振荡培养诱导20小时。

2)表达嵌合Fab抗体工程菌的超声裂解

将表达嵌合Fab抗体的诱导菌，6000rpm、4℃离心15分钟收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的pH7.4的磷酸盐缓冲液内，冰浴超声破菌，12 000rpm4℃离心30分钟，收集超声裂解上清，在超声裂解上清中加入终浓度为20mmol/L咪唑和0.5mol/L的NaCl。

3)His-trap亲和层析柱纯化蛋白

将His-trap亲和层析柱连至常压层析系统，先用平衡缓冲液平衡，平衡缓冲液为20mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH 7.4，含终浓度为20mmol/L咪唑，后将超声裂解上清用0.22μm滤膜过滤后上样，上样流速为1ml/min，收集流穿，上样结束后用平衡缓冲液平衡，然后依次用含50、100、200、300、400、500mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白。用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测流穿和各洗脱峰蛋白，结果示100mmol/L的咪唑缓冲液洗脱峰为目的蛋白。

NP11-4嵌合Fab抗体活性的鉴定

采用间接ELISA法鉴定嵌合Fab抗体与日本血吸虫虫卵可溶性抗原的结合活性。用50mmol/L的碳酸盐(pH 9.6)将SEA抗原稀释到10μg/ml后包被酶联板，每孔100μl，4℃过夜。次日用封闭液(5％脱脂奶粉，PBS配制)封闭，200ul/孔，37℃孵育2h。将待检测的嵌合Fab抗体用PBS做倍比稀释(1：5倍稀释)后依次加入待检孔，空白对照(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4)及阴性对照(正常鼠血清)加至对应孔中，每孔100μl，37℃孵育2h。0.05％的PBST液用洗板机洗5遍后加1：2000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，100μl/孔，37℃反应2h，PBST洗5遍，加底物TMB溶液50μl，室温避光显色10min后加50μl 2mol/L硫酸混匀终止反应，用Multiskan SpectrumMicroplate酶标仪测定A450值。结果显示，纯化的嵌合Fab抗体可与日本血吸虫虫卵可溶性抗原呈阳性反应，而与正常鼠血清不反应，说明该抗体与SEA抗原有较好的结合活性。

抗血吸虫单克隆抗体NP11-4嵌合Fab抗体在制备血吸虫病免疫毒素及治疗血吸虫病药物中的应用。

本发明与现有的技术相比具有的优点：

目前血吸虫病的治疗主要以吡喹酮化疗为主，但单一化疗药物的长期使用容易产生耐药性的问题。在曼氏血吸虫中，已发现耐吡喹酮药的虫株。近年来以吡喹酮和青蒿琥酯联合用药治疗血吸虫病的也不少，但是化疗药物所致的毒副作用也很大，因此寻找一种高效低毒的治疗血吸虫病的药物迫在眉睫。

抗体药物由具有靶向性的单克隆抗体与具有治疗作用的化学药物偶联而成。单克隆抗体是药物良好的靶向性载体，通过药物分子上特殊的功能基团，将治疗药物与抗体相连接而组成化学免疫偶联物，避免了药物对其它正常组织的毒害作用，选择性的发挥治疗作用。最初抗体药物是在肿瘤的靶向治疗中得到一定应用，迄今为止国内外还未见在血吸虫病治疗方面的应用。

本发明制备的定位于日本血吸虫成虫表膜、尾蚴膜、童虫膜、虫卵卵壳及卵内毛蚴膜的鼠源单克隆抗体NP11-4，能有效的降低小鼠死亡率，提高减虫率及减卵率，但是鼠源单抗的异源性所引起的HAMA反应不但降低了单抗的效价，而且会给患者带来严重的后果。因此，对鼠源单抗进行改造成为单抗研究的重要方向。利用基因工程的方法构建嵌合Fab基因片段后表达嵌合Fab抗体片段，有较多的优点：

(1)嵌合Fab抗体分子质量小，作为异种蛋白的抗原性较小，降低HAMA反应。

(2)嵌合Fab抗体片段的稳定性好，分子量为50kD，不到完整抗体分子量的1/3，使其比完整抗体更易接近靶组织，组织穿透力强，易通过组织到达靶部位，而且在体内的半衰期短，利于及时清除。

(3)嵌合Fab抗体缺少Fc段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，同时还可以降低机体的非特异反应。

(4)嵌合Fab抗体分子量小，可以做为载体与化疗药物或放射核素偶联在靶向治疗方面具优势。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1是表达抗血吸虫单克隆抗体NP11-4嵌合Fab抗体的重组质粒构建流程图。

图2是用1％的Agarose凝胶检测PCR扩增的NP11-4可变区重链、轻链基因片段，其中1是重链可变区V_H366bp；2是轻链可变区V_L342bp，M：核酸标准分子量(TaKaRa DL2000)。

图3是用1％的Agarose凝胶检测PCR扩增的NP11-4嵌合Fab抗体基因片段，5为嵌合Fab抗体基因片段，大小为1500bp，M：核酸标准分子量(TaKaRaDL2000)。

图4是1％的Agarose凝胶检测构建成功的重组质粒双酶切图谱，用SfiI单酶切，其中大片段为酶切的pComb3XSS片段，小片段为酶切成功的嵌合Fab抗体基因片段，M1：核酸标准分子量(TaKaRa DL10000)，M2：核酸标准分子量(TaKaRa DL2000)。

图5是表达嵌合Fab抗体的重组菌聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果，图示1为表达嵌合Fab抗体的重组菌培养上清，2为超声上清，3为超声沉淀，可见嵌合Fab抗体主要在超声沉淀中表达，而超声上清中表达量较少，培养上清中量最少，M：低分子量蛋白标准(Fermentas)。

图6是表达嵌合Fab抗体的重组菌Western-blot分析结果，1和2均为表达嵌合Fab抗体重组菌的超声上清，在26KD和34KD处可见有目的条带，说明蛋白可溶性表达，3为Top10F’对照，没有目的蛋白表达，M：低分子量蛋白标准(Fermentas)。

图7是表达嵌合Fab抗体纯化后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果，100mM咪唑洗脱液浓缩后的目的蛋白，蛋白较纯，M：低分子量蛋白标准(Fermentas)。

具体实施方式

本发明实施方式的详细说明：

提取抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4杂交瘤细胞总RNA，RT-PCR方法将其逆转录为cDNA，PCR方法扩增重链、轻链可变区基因片段，将鼠源VH、VL分别与人IgG₁的CH₁、C_L通过PCR扩增Fd及全长L。利用重叠延伸PCR以Fd和L基因为模板扩增嵌合Fab基因，将嵌合Fab基因片段克隆至质粒pComb3XSS构建原核表达载体，转化大肠杆菌Top10F’，筛选获得高效表达嵌合Fab抗体的工程菌，表达的目的蛋白约占菌体蛋白总量的40％左右，以包涵体、可溶性、分泌性三种形式存在。

材料与方法

1.菌种与质粒：宿主菌Top10F’及质粒pComb3XSS均为本实验室保存。

2.分子生物学试剂：限制性内切酶SfiI为Roche公司产品、T4 DNA连接酶及质粒纯化试剂盒为TaKaRa公司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体购自Sigma公司，琼脂糖凝胶回收DNA片段的试剂盒购自美国Promega公司。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。

3.基因片段的测序：由上海博亚生物技术有限公司完成。

4.基因克隆方法：DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化；蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析等一般的克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。

结果

1.单克隆抗体NP11-4可变区基因克隆：

复苏抗日本血吸虫单抗NP11-4杂交瘤细胞，应用Trizol试剂，按照说明书提取杂交瘤细胞总RNA，(5～10)×10⁶杂交瘤细胞加1毫升的Trizol溶液，充分混匀后，倒入1.5毫升离心管中，室温静置5分钟，再加入200微升的氯仿，用力摇晃离心管15秒，充分混匀，4℃静置5分钟，后12000rmp 4℃离心15分钟，将约500微升的上层水相转入新的1.5毫升离心管中，加入0.5毫升异丙醇，混匀后4℃静置5分钟，后12000rmp 4℃离心10分钟，小心倒掉上清，留取沉淀，加1毫升预冷的现配75％的乙醇振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp4℃离心5分钟，小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干，在管中加20微升的DEPC水溶解RNA，提取的RNA通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，在反转录酶作用下逆转录获得cDNA；设计19条V_H上游引物和17条V_K上游引物，4条V_H下游引物和3条V_K下游引物引物：

V_K5’上游引物：

V_K-1

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C-3’

V_K-2

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C-3’

V_K-3

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C-3’

V_K-4

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGY TRA CAC AGT C-3’

V_K-5

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C-3’

V_K-6

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTM AGA TRA MCC AGT C-3’

V_K-7

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C-3’

V_K-8

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C-3’

V_K-9

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C-3’

V_K-10

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG WGC TSA CCC AAT C-3’

V_K-11

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTS TRA TGA CCC ART C-3’

V_K-12

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTK TGA TGA CCC ARA C-3’

V_K-13

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C-3’

V_K-14

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A-3’

V_K-15

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T-3’

V_K-16

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C-3’

V_K-17

5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C-3’

V_K3’下游引物

V_KR1

5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT KAT TTC CAG YTT GGT CCC-3’

V_KR2

5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC-3’

V_KR3

5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’

V_H5’上游引物

V_H1

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR MAG CTT CAG GAG TC-3’

V_H2

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC-3’

V_H3

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG CTG AAG SAS TC-3’

V_H4

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3’

V_H5

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAG CTB CAG CAR TC-3’

V_H6

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAR CTG CAG CAG TC-3’

V_H7

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAC GTG AAG CAG TC-3’

V_H8

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAS STG GTG GAA TC-3’

V_H9

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AWG YTG GTG GAG TC-3’

V_H10

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG SKG GTG GAG TC-3’

V_H11

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAM CTG GTG GAG TC-3’

V_H12

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC-3’

V_H13

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAR CTT GTT GAG TC-3’

V_H 14

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC-3’

V_H 15

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAR STT GAG GAG TC-3’

V_H 16

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTT ACT CTR AAA GWG TST G-3’

V_H 17

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAA CTV CAG CAR CC-3’

V_H 18

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAC TTG GAA GTG TC-3’

V_H 19

5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG GTC ATC GAG TC-3’

V_H 3’下游引物

V_H R1

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT-3’

V_H R2

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT-3’

V_H R3

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT-3’

V_HR4

5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT-3’

将V_K5’上游引物、V_K3’下游引物、V_H5’上游引物，V_H3’下游引物各溶为终浓度100pmol/ul，然后均以1∶1体积比例混匀，分别扩增V_H、V_L基因，扩增条件为95℃ 4分钟，95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；最后72℃延伸10分钟，电泳回收、纯化扩增的基因片段，连至pMD-18T载体，转化大肠杆菌XL1-blue，测序后获得轻链、重链可变区序列，序列如下：

V_L 342bp

GAG CTC GAT ATT TTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGAGAT CAA GTC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGAAAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CCC CTGATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGTGGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTGGGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGGACC AAA CTG GAA ATC AAA

V_H 366bp

CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCAGTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGTTGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATT TAC CCTGGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACTGCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAGGAC GTT TTT GTT TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCTCTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA

2、嵌合Fab基因的克隆：

根据上述序列分别设计扩增构建嵌合Fab基因的Fd上游引物：5-G C T G C C C A A C C A G C C AT G G C C-3，下游引物：5-A G A A G C G T A G T C C G G A A C G T C-3，L上游引物：5-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGCTC-3，下游引物：5-GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3，嵌合Fab的上游引物：5-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGCTC-3，下游引物：5-GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3，扩增嵌合Fab基因的上下游引物均引入SfiI的酶切位点，将纯化后的重链可变区基因V_H与人IgG₁的C_H1、轻链可变区基因V_L与人IgG₁的C_L通过PCR扩增Fd及全长L，扩增条件为95℃ 4分钟，95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环，最后72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳分别回收、纯化扩增的Fd、L基因片段，再采用重叠延伸PCR将Fd、L基因连接成嵌合Fab基因，扩增条件为将Fd及全长L混匀，在无外加引物的情况下，互为引物和模板，PCR反应94℃5分钟，94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 60秒，扩增6个循环后，在反应体系中加入嵌合Fab的上游引物和下游引物，PCR反应94℃ 30秒，60℃ 50秒，72℃ 50秒，扩增20个循环，最后72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳回收、纯化嵌合Fab基因片段，连接至pMD-18T，转化感受态大肠杆菌Top10F’，测序验证得到正确的嵌合Fab基因片段，序列如下：

ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GTCTCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGAAAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCAAAG CCC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCAGAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAGATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TAC TGC TTTCAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTGGAA ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCGCCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGCCTG CTG AAT AAC TTCTAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAGGTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACAGAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTGACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGCGAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TTG CCC GTC ACA AAG AGC TTCAAC AGG GGA GAG TGT TAG TTC TAG ATA ATT AAT TAG GAG GAA TTTAAA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTACTC GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAG CTG CAG CAGTCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCA GTG AAG ATA TCCTGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG CTA GGT TGGGTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT GGA GAT ATTTAC CCT GGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGCAAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT GCC TAC ATGCAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC GTT TTT GTT TAT TTT TGTGCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCT CTT GCT TAC TGGGGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GCC TCC ACC AAG GGCCCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGGGGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAACCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTGCAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTCAGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACCTAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GACAAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT AGT GGC CAG GCCGGC CAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGC GCA TAC CCG TAC GAC GTTCCG GAC TAC GCT TCT

3、重组质粒的构建

提取质粒pComb3XSS，用限制性内切酶SfiI单酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内，同样用限制性内切酶SfiI对测序正确的嵌合Fab基因片段单酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化后溶于去离子水内，取等摩尔浓度的两个酶切DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，使嵌合Fab基因片段插入到pComb3XSS载体中，构建出NP11-4嵌合Fab抗体的原核表达载体。

4、重组质粒的筛选及鉴定

将重组质粒转化大肠杆菌Top10F’，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素LB平板，置37℃培养过夜。次日随机挑取转化菌落和转化质粒pComb3XSS的对照菌行菌液PCR鉴定。菌液PCR扩增结果显示重组质粒含有目的嵌合Fab基因片段，而pComb3XSS质粒没有此片段。将菌液PCR阳性的菌液抽提质粒，行SfiI单酶切鉴定，可见在约3500bp和1500bp处各有基因片段出现，说明重组质粒构建成功。

5、表达嵌合Fab抗体工程菌的筛选鉴定

将转化子接种至2ml含有氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基内，37℃振荡培养3小时，至菌液OD值至0.8-1.0时，加终浓度为1mmol/L的，25℃继续振荡培养诱导20小时，离心收集菌体，菌体重悬于原培养液1/10体积的pH7.4的磷酸盐缓冲液内，冰浴超声20秒，将超声裂解液12 000rpm 4℃离心30分钟，分别收集超声裂解上清和超声裂解沉淀，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE))检测，超声裂解上清和超声裂解沉淀内都表达相对分子量约为34kD的Fd、26kD的L蛋白，而对照菌Top10F’无这两条蛋白条带。

嵌合Fab抗体的纯化

材料和方法

1.主要试剂

亲和层析柱为GE公司的His-trap HP，异丙基—B—D—硫代半乳糖苷(IPTG)、咪唑购自Sigma公司。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。

2.表达嵌合Fab抗体工程菌的超声裂解

将表达嵌合Fab抗体的诱导菌，6000rpm 4℃离心15分钟收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的pH7.4的磷酸盐缓冲液内，冰浴超声破菌，12 000rpm 4℃离心30分钟，收集超声裂解上清，在超声裂解上清中加入终浓度为20mmol/L咪唑和0.5mol/L的NaCl。

3.His-trap亲和层析柱纯化蛋白

将His-trap亲和层析柱连至常压层析系统，先用平衡缓冲液平衡，平衡缓冲液为20mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH 7.4，含终浓度为20mmol/L咪唑，后将超声裂解上清用0.22μm滤膜过滤后上样，上样流速为1ml/min，收集流穿，上样结束后用平衡缓冲液平衡，然后依次用含50、100、200、300、400、500mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白。用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测流穿和各洗脱峰蛋白，确定哪个组份内含有目的蛋白。结果

将各洗脱峰的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示，嵌合Fab抗体主要存在于含100mmol/L的咪唑的缓冲液内，有较高的纯度；含200mM的咪唑的缓冲液洗脱峰内亦有目的蛋白，但杂带较多；其它浓度咪唑缓冲液洗脱峰内无目的蛋白。

纯化嵌合Fab抗体结合活性的鉴定及应用

将纯化的嵌合Fab抗体用间接ELISA法检测血吸虫虫卵可溶性抗原，以鉴定该抗体的结合活性。实验结果显示，该重组蛋白与血吸虫虫卵可溶性抗原有很好的结合活性，可用应用于血吸虫病的治疗领域。

材料和方法

1.血吸虫虫卵可溶性抗原：本实验室冻存。

2.酶联反应材料：96孔板为Costar公司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体购自Sigma公司。其它材料为酶联反应的常规材料。

3.ELISA实验：采用间接ELISA法鉴定嵌合Fab抗体与日本血吸虫虫卵可溶性抗原的结合活性。用50mmol/L的碳酸盐(pH 9.6)将SEA抗原稀释到10μg/ml后包被酶联板，每孔100μl，4℃过夜。次日用封闭液(5％脱脂奶粉，PBS配制)封闭，200μl/孔，37℃孵育2h。将待检测的嵌合Fab抗体用PBS稀释为不同浓度后依次加入待检孔，空白对照(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4)及阴性对照(正常鼠血清)加至对应孔中，每孔100μl，37℃孵育2h。0.05％的PBST液用洗板机洗5遍后加1：2000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，100μl/孔，37℃反应2h，PBST洗5遍，加底物TMB溶液50μl，室温避光显色10min后加50μl 2mol/L硫酸混匀终止反应，用Multiskan Spectrum Microplate酶标仪测定A450值。

结果

间接ELISA实验结果显示，纯化的嵌合Fab抗体与血吸虫虫卵可溶性抗原呈阳性反应，而与正常鼠血清不反应，说明该抗体与血吸虫虫卵可溶性抗原具有较好的结合活性。

纯化嵌合Fab抗体的ELISA实验结果(A450)

A：空白对照 B：阴性对照 C：1：400倍稀释的嵌合Fab抗体

D：1：600 E：1：800 F:1:1000 G:1:1500 H:1:2000

抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4嵌合Fab抗体蛋白序列表

<110>南京医科大学

<120>抗血吸虫单克隆抗体NP11-4嵌合Fab抗体及其制备方法、应用

<160>2

<210>1

<211>488

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>一种抗血吸虫单克隆抗体NP11-4嵌合Fab抗体，即抗血吸虫单克隆抗体NP11-4嵌合Fab抗体N端从第1个氨基酸到第215个氨基酸为嵌合Fab抗体的全长L链，从第216个氨基酸到第488个氨基酸为嵌合Fab抗体的Fd段，两者之间由二硫键连接，全长488个氨基酸。

<400>1

Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg

 1              5               10                  15                  20

Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys

                25                 30                35                40

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

                45                 50                 55                 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu

                65             70                    75                 80

Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly

                 85                  90                   95                 100

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

              105                    110                 115                120

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

               125                  130                  135                140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

                145                150                 155                  160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

                165                170                 175                  180

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

                185                190                  200                 205

Gly Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Lys Tyr Leu Leu Pro

              210                  215                220                  225

Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Leu Glu Val Gln

                230                 235                 240                245

Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys

                250                 255                 260                265

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His

                270                 275                 280                285

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Val Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys

                290                 295                 300                305

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu

                310                 315                 320                325

Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Val Phe Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly Tyr Asp Gly

                330                 335                 340                 345

Ser Ser Gln Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

                350                 355                 360                 365

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Lys Thr Ser Gly Gly Thr

                370                 375                 380                 385

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

                390                 395                 400                 405

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

                405                 410                 415                 420

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

                425                 430                 435                 440

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

               445                  450                 455                460

Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro

               465                  470                 475                480

Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser

               485

<210>2

<211>1464

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1464)

<220>

<221>L_region

<222>(1)...(630)

<223>抗血吸虫单克隆抗体NP11-4嵌合Fab抗体L基因序列。

<220>

<221>Fd_region

<222>(631)...(1464)

<223>抗血吸虫单克隆抗体NP11-4嵌合Fab抗体Fd基因序列。

<400>2

ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GTC    45

Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val

 1               5                  10                  15

TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGA    90

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly

                20                  25                  30

AAC ACC TAT TTA GAA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA    135

Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

                35                  40                  45

AAG CCC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA    180

Lys Pro Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

                50                  55                  60

GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG    225

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

                65                  70                  75

ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TAC TGC TTT    270

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe

                80                  85                 90

CAA GGT TCA CAT GTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG    315

Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

                95                  100                105

GAA ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTCATC TTC CCG    360

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

                110                 115                120

CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC    405

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

                125                 130                135

CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG    450

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

                140                 145                150

GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA    495

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

                155                 160                165

GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG    540

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

                170                 175                 180

ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC    585

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys

                185                 190                 195

GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TTG CCC GTC ACA AAG AGC TTC    630

Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys Ser Phe

                200                 205                 210

AAC AGG GGA GAG TGT AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA    675

Asn Arg Gly Glu Cys Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly

                215                 220                 225

TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAG    720

Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Leu Glu Val Gln

                230                 235                 240

CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTA AGG CCT GGA TCT TCA GTG    765

Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val

                245                 250                 255

AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACT AAC TTC TGG    810

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp

                260                 265                 270

CTA GGT TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAT GGA CTT GAG TGG ATT    855

Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

                275                 280                 285

GGA GAT ATT TAC CCT GGG GGT GTT TAT ATT AAT TAC AAT GAG AAG    900

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Val Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys

                290                 295                 300

TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AGC ACT    945

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr

                305                 310                 315

GCC TAC ATG CAG CTC AGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC GTT TTT GTT    990

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Val Phe Val

                320                 325                 330

TAT TTT TGT GCA AGA GTG GGA TAC GAC GGT AGT AGT CAG TCT CTT    1035

Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Gln Ser Leu

                335                 340                 345

GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GCC TCC    1080

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

                350                 355                360

ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC    1125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Lys

                365                 370                 375

ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC    1170

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

                380                 385                 390

TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC    1215

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

                395                 400                 405

AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC    1260

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

                410                 415                 420

TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC    1305

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

                425                 430                 435

ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC    1350

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

                440                 445                 450

AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT AGT    1395

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser

                455                 460                 465

GGC CAG GCC GGC CAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GGC GCA TAC CCG    1440

Gly Gln Ala Gly Gln His His His His His His Gly Ala Tyr Pro

                470                     475             480

TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT    1464

Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser

                485