测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法

摘要

本发明公开了测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是合成盐酸克伦特罗的修饰物并将其与蛋白联接，制得免疫原及包被抗原。通过免疫动物获得四种兔抗盐酸克伦特罗的多克隆抗体。四种抗体均可用于盐酸克伦特罗的免疫分析，标准曲线的浓度范围为0.01～100ng/mL，IC

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。

背景技术

盐酸克伦特罗(CL)，俗称瘦肉精，化学名：α-(叔丁氨基)甲基-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐，英文名：Clenbuterol hydrochloride，是一种人工合成的β-肾上腺素受体药物，它可选择性地作用于肾上腺素β₂受体，引起交感神经兴奋，在治疗剂量下，具有松弛气管平滑肌作用，用于治疗哮喘，由于其对子宫平滑肌有较强松弛作用，也常用于延迟分娩。20世纪80年代，研究发现将一定量的盐酸克伦特罗加入动物饲料中，能够改变营养物质的代谢途径，促进动物肌肉特别是骨胳肌蛋白质的合成，同时抑制脂肪合成，从而促进动物生长，增加瘦肉率，于是盐酸克伦特罗在世界范围内作为动物饲料添加剂被广泛应用(Kuiper H.A.et al.Il legal use of β-adrenergic agonists：International.Journal of Animal Science 1998，76：195-207；Prezelj A.et al.Abuse of clenbuterol and its detection.Current Medicinal Chemistry.2003，10：281-290)。它的添加给经营者带来巨大的利润，但是由于其在畜产品中的残留，给广大消费者的身体健康也造成了极大危害。

在家畜生产中使用的有效剂量一般是哮喘剂量的5～10倍，有较强的药性，溶解代谢率低，不易大量代谢排出，残留量较高。盐酸克伦特罗化学性质稳定，一般高温难以分解，作为一类激素，通过腺体深入到组织细胞膜内发挥作用，难以代谢清除。盐酸克伦特罗在动物血管系统中发生作用，使气管扩张，影响肌肉蛋白质代谢、脂肪代谢及肝脏中的糖代谢，严重影响动物正常的生长发育。人们食用含有盐酸克伦特罗残留的动物性食品，产生恶心、呕吐、头晕、心悸、乏力、面部和四肢肌肉颤动等现象，对高血压、心脏病患者危害更大，易引起心动过速、心室早搏、甚至危及生命。国内外曾发生多起由盐酸克伦特罗引起的食物中毒事件(Pulce C.D.et al.Collective human foodpoisonings by CLenbutenol residues in Vealliver.Veterinary and humantoxicology，.1991，33：480-481；柯华等.一起盐酸克伦特罗引起食物中毒的调查与尿样检测.中国卫生监督杂志，2003，10(2)：91-93)，各国政府都禁止将盐酸克伦特罗作为饲料添加剂用于肉用动物的生产。我国农业部多次发布文件，禁止在饲料中使用盐酸克伦特罗，并严格检测市场肉制品中盐酸克伦特罗的含量(中华人民共和国农业部农牧发[1997]3号；[2002]193号)。

测定盐酸克伦特罗含量的方法主要有两类，一类是色谱分析方法，包括了高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱傅立叶红外联用法、毛细管区带电泳法等。我国颁布的检测血液、组织等样品中盐酸克伦特罗的HPLC标准方法(GB/T5009.192-2003)，是利用BOS(经碱去活处理)或ODS反相C18烷基硅胶柱(255nm×4.6mm，5μm)对样品进行分离，选择波长为244nm，流速1.0mL/min，室温条件，检出限5ng/g。但是色谱法仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高；另一类是免疫分析方法，主要是酶联免疫吸附分析方法和胶体金免疫分析方法，各种品牌的这两种免疫分析方法的快速检测试剂盒在市场上均有销售，但是，目前见到的测定盐酸克伦特罗的免疫分析方法的灵敏度不高，迫待改进。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种测定测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是以抗体和抗原与抗体之间特异性反应为基础而建立的高灵敏度、高特异性的分析方法。

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。

测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法

(1)盐酸克伦特罗修饰物的制备

将1～5mg盐酸克伦特罗溶解于0.2～0.6mL水中，缓慢滴加0.1～0.3mL浓度为10～16.7mg/mL的NaNO₂溶液，用盐酸调节混合液的pH值至1.5，暗处4℃反应过夜；取少量上述溶液，滴加到N，N-二甲基苯胺中，溶液颜色由无色变为淡黄色，表明重氮化反应完成；将5～11mg氨基磺酸胺溶解于0.1～0.2mL水中，缓慢滴加到重氮盐溶液中，终止反应。

(2)免疫原及包被抗原的制备

称取牛血清白蛋白50～100mg和卵清蛋白30～60mg，分别溶解于5mL浓度为0.01mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中；将重氮化溶液缓慢滴加至蛋白质溶液中，加入少量NaOH溶液，使混合液的pH值保持在7.5，搅拌下4℃反应4小时；将混合物装入透析袋中，透析数天，获得盐酸克伦特罗-蛋白质溶液，冷冻干燥，-20℃保存待用；盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白和盐酸克伦特罗-卵清蛋白分别用作免疫原及包被抗原。

(3)盐酸克伦特罗多克隆抗体的制备

两种免疫原分别免疫两只兔子：将1～4mg免疫原溶解于0.5～4mL的生理盐水中，加入0.5～3mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.5～2.0mL乳浊液，多次皮下注射入兔子背部，1～5周后，对兔进行加强免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，2～5周进行下一次免疫，并且第三次、第四次免疫后，5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，5～15天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于低温冰箱中储存，有四种抗体，即盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白制备的抗体I，II和盐酸克伦特罗-卵清蛋白制备的抗体III，IV。

(4)建立测定盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法

对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定盐酸克伦特罗含量的ELISA。

本发明的优点：

1.成功制备出抗盐酸克伦特罗的多克隆抗体并建立测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法。

2.灵敏度高：与大多数市售ELISA试剂盒相比，灵敏度提高5～50倍。

3.特异性强：四种抗体与沙丁胺醇的交叉反应率为25.37～45.83％，与其他9种可添加于动物饲料中的药物几乎没有交叉反应。

4.样品处理简单、测试量大、测试费用低。

5.对样品的测定，ELISA与HPLC有很好的相关性。

附图说明

图1.为盐酸克伦特罗(CL)、牛血清白蛋白(BSA)和盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白(CL-BSA)交联物的紫外-可见光谱图

由图1得知，CL和BSA分别在298nm和280nm处有特征吸收峰，CL-BSA在325nm有一肩峰，为CL与BSA交联所形成的更大的共轭体系的特征峰，表明盐酸克伦特罗已成功与蛋白交联。

盐酸克伦特罗(CL)、卵清蛋白(OVA)和盐酸克伦特罗-卵清蛋白(CL-OVA)交联物的紫外-可见光谱图与图1相似

图2.为四种多克隆抗体所建立的ELISA测定盐酸克伦特罗的标准曲线

■包被抗原CL-OVA，1:20,000(e.g.10ng/well)；抗体I，1:100,000；羊抗兔1gG-辣根过氧化物酶(GaRIgG-HRP)，1:20,000；IC₅₀0.18ng/mL；●包被抗原CL-OVA，1:5,000(e.g.40ng/well)；抗体II，1:10,000；GaRIgG-HRP 1:20,000；IC₅₀ 0.55ng/mL；▲包被抗原CL-BSA，1:5,000(e.g.40ng/well)；抗体III；1:10,000；GaRIgG-HRP，1:20,000；IC₅₀ 0.67ng/mL；▼包被抗原CL-BSA 1:2,000(e.g.1000ng/well)；抗体IV，1:10,000；GaRIgG-HRP1:20,000；IC₅₀ 0.44ng/mL。

由图2得知，四种抗体均可用于盐酸克伦特罗的免疫分析，标准曲线的浓度范围为0.01～100ng/mL，灵敏度最高的ELISA的IC₅₀为0.18ng/mL，其它三种ELISAs的IC₅₀分别为0.55，0.67和0.44ng/mL。

图3.为ELISA和HPLC对5个加标样品中盐酸克伦特罗的检测结果的相关曲线

由图3得知，两种方法相关性较好，回归方程为Y＝0.992X+0.469，相关系数为0.989，n＝5，说明二者的相关性很好

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施只用于对发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例：

1.盐酸克伦特罗修饰物的制备

将1～5mg盐酸克伦特罗溶解于0.2～0.6mL水中，缓慢滴加0.1～0.3mL浓度为10～16.7mg/mL的NaNO₂溶液，用盐酸调节混合液的pH值至1.5，暗处4℃反应过夜；取少量上述溶液，滴加到N，N-二甲基苯胺中，溶液颜色由无色变为淡黄色，表明重氮化反应完成；5～11mg氨基磺酸胺溶解于0.1～0.2mL水中，缓慢滴加到重氮盐溶液中，终止反应。

2.免疫原和包被抗原的制备

称取牛血清白蛋白50～100mg和卵清蛋白30～60mg，分别溶解于5mL浓度为0.01mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中；将重氮化溶液缓慢滴加至蛋白质溶液中，加入少量NaOH溶液，使混合液的pH值保持在7.5，搅拌下4℃反应4小时；将混合物装入透析袋中，透析数天，获得盐酸克伦特罗-蛋白质溶液，冷冻干燥，-20℃保存待用；盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白(CL-BSA)和盐酸克伦特罗-卵清蛋白(CL-OVA)分别用作免疫原及包被抗原。

CL、BSA和CL-BSA交联物的紫外-可见光谱图如图1所示，CL、OVA和CL-OVA交联物的紫外-可见光谱图与图1相似。

3.盐酸克伦特罗多克隆抗体的制备

两种免疫原分别免疫两只兔子：将1～4mg免疫原溶解于0.5～4mL的生理盐水中，加入0.5～3mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.5～2.0mL乳浊液，多次皮下注射入兔子背部，1～5周后，对兔进行加强免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，2～5周进行下一次免疫，并且第三次、第四次免疫后，5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，5～15天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于低温冰箱中储存，有四种抗体，即CL-BSA免疫原制备的抗体I，II和CL-OVA免疫原制备的抗体III，IV。

4.优化实验条件，建立测定盐酸克伦特罗的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)

对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法。

(1)溶液配制

(a)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液

称取2.606g Na₂CO₃·10H₂O，3.434g NaHCO₃，用800mL超纯水混匀溶解后，调节pH值，加水至1L，配成0.05mol/L，pH＝9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；

(b)磷酸缓冲液(储备液，PBS×10)

称取21.961g Na₂HPO₄·12H₂O，6.031g NaH₂PO₄·2H₂O，87.666g NaCl，加800mL超纯水混合，加热溶解；用1mol/L的NaOH调节pH＝7.5，加超纯水至1L，配成含0.15mol/L NaCl，pH＝7.5的0.1mol/L磷酸缓冲液(储备液)；

(c)酪蛋白溶液

称取酪蛋白加热溶解于0.01mol/L的PBS中，配成1.0％酪蛋白溶液；

(d)磷酸缓冲液-吐温储备液(含1％Tween20的0.1mol/L磷酸缓冲储备液，PBST×10，pH＝7.5)；

(e)盐酸克伦特罗标准溶液的配制(0.5mg/mL)

0.005g CL溶解于5mL纯水；

(f)CL-OVA和CL-BSA交联物的配制(1mg/mL)

用微量天平称CL-OV或CL-BSA交联物5mg，加入5mL超纯水溶解；

(g)底物溶液(20mL纯水；1mL醋酸钠缓冲液；200μL四甲基联苯胺(TMB)(1％)；20μL过氧化氢(5％))；

(i)醋酸钠缓冲液

称取3.450g CH₃COONa·3H₂O，用100mL超纯水溶解，再用1mol/L柠檬酸(21.031g C₆H₈O₇·H₂O溶解于100mL水中)调节pH＝5.8后，再用水定容到250mL，配成0.1mol/L醋酸钠缓冲液；

(ii)TMB：称取0.0717g TMB，用7.17mL二甲基亚砜溶解，混匀，配成1％，w/v；

(iii)过氧化氢：取20μL 30％的过氧化氢加入100μL超纯水中，混匀，配成5％；

(h)H₂SO₄溶液：移取25mL浓H₂SO₄，溶解于475mL的超纯水中，配成5％ H₂SO₄溶液。

(2)主要仪器

洗板机：A5082，Tecan，Austria；酶标仪：A2082，Tecan，Austria；高效液相色谱仪：Alltech-001

(3)间接竞争ELISA步骤

(a)用包被抗原包板，每孔200μL，4℃过夜；

(b)PBST缓冲液(PBST储备液1：10稀释)满孔洗涤三次；

(c)加入酪蛋白溶液封阻，每孔280μL，室温放置1小时；

(d)PBST缓冲液洗板三次；

(e)依次每孔加入100μL的标准溶液和100μL的一定稀释度的多克隆抗体，室温放置1小时；

(f)PBST缓冲液洗板三次；

(g)加入酶标二抗(羊抗兔1gG-辣根过氧化物酶，GaRIgG-HRP)，每孔200μL，室温放置1小时；

(h)PBST缓冲液洗板三次；

(i)加入底物液显色，每孔200μL，振摇15～20分钟；

(j)加入5％ H₂SO₄溶液，每孔80μL，终止反应；

(k)用酶标仪测定吸光度值，做出标准曲线，进行结果分析与讨论。

(4)ELISA实验条件的优化

本发明对包被抗原和抗体的不同组合、包被抗原的浓度、抗体的稀释度、酶标二抗的稀释度等作了优化，优化结果为如表1所示。

(5)ELISA的标准曲线及灵敏度

盐酸克伦特罗标准标准溶液的浓度为：0，0.01，0.03，0.1，0.3，1.0，10，100ng/mL，由盐酸克伦特罗的储备液1.0mg/mL经过纯水稀释而得。以盐酸克伦特罗浓度的对数为横坐标，以相对信号B/B₀×100％为纵坐标做标准曲线(B₀：盐酸克伦特罗标液浓度为0ng/mL所对应的吸光度值；B：其他各浓度对应的吸光度值)。图2为四种多克隆抗体所建立的ELISA测定盐酸克仑特罗的标准曲线，表1在最佳实验条件下的IC₅₀值，IC₅₀在0.1～0.9ng/mL之间；抗体I所建立的ELISA灵敏度最高，IC₅₀为0.1～0.3ng/mL。

(6)ELISA的特异性

ELISA特异性可用交叉反应率来表示。交叉反应率(CR％)＝(盐酸克伦特罗的IC₅₀/测试物质的IC₅₀)×100％。交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。

在本发明选择沙丁胺醇及其他9种可添加于动物饲料中的药物进行交叉反应实验，交叉反应物的结构及交叉反应实验如表2、表3所示。四种抗体与沙丁胺醇的交叉反应率为25.37～45.83％，与其他9种可添加于动物饲料中的药物几乎没有交叉反应；说明所建立的ELISA特异性强。

5.ELISA对加标样品中盐酸克伦特罗含量的测定

选择了5种阴性样品：牛奶I，牛奶II，猪肝I、鸡肝I和动物饲料I进行加标实验，取1～5g样品，加入1～5μL的盐酸克仑特罗储备液，(1)牛奶样品：量取1～5mL牛奶样品于离心管中，加入纯水稀释1倍，漩涡仪漩涡5分钟，加入浓度为0.1mol/L盐酸1～5mL，水浴振荡器振荡半小时，静置过夜，次日超声萃取15分钟，50℃水浴加热，离心，取上层清液待测；(2)肝脏样品：市场购买的肝脏水洗去血，晾干，取适量肝脏样品切碎，匀浆5分钟，称取1～5g浆状样品，加入浓度为0.1mol/L稀盐酸1～5mL，水浴振荡器振荡半小时，静置过夜，次日超声萃取15分钟，离心，取上层清液待测；(3)饲料样品：取饲料样品，研磨成细粉，称1～5g样品，加入浓度为0.1mol/L稀盐酸1～5mL，水浴振荡器振荡半小时，次日超声萃取15分钟，离心，取上层清液待测；加标样品萃取液按1:400～1:1000稀释后用ELISA直接测定，盐酸克伦特罗的加标回收率为92.2～97.0％，相对标准偏差为1.3～5.3％，说明方法准确性和精密度都比较好。

6.ELISA和HPLC的比较

盐酸克伦特罗的HPLC条件为：色谱条件：Hypersil Gold柱，柱温为室温，流动相为甲醇：0.01mol/L NaH₂PO₄水溶液＝35:65，流量1mL/min，进样20μL，紫外检测波长：240nm，盐酸克伦特罗标准溶液的浓度分别为：0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20μg/mL，样品萃取液用0.45μm的滤膜过滤后直接测定。

所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证，5种加标样品，即牛奶I，加标浓度1μg/mL；牛奶II，加标浓度2μg/mL；猪肝I，加标浓度4μg/g；鸡肝I，加标浓度5μg/g；动物饲料I，加标浓度3μg/g；加标样品用0.1mol/L盐酸萃取并用ELISA和HPLC测定，测定结果以ELISA为横坐标，HPLC为纵坐标作图得两者的相关曲线，如图3所示，回归方程为Y＝0.992X+0.469，相关系数为0.989，n＝5，说明二者的相关性很好。

7.ELISA测定真实样品中盐酸克伦特罗含量

从超市中购得6个牛奶样，从农贸市场中购得3个猪肝样和3个鸡肝样，从农资市场购得4个动物饲料样，用所建立的灵敏度最高的ELISA对上述16个样品进行测定，测定结果如表4所示。结果表明，饲料样品中75％都含有盐酸克伦特罗，最高浓度达64.03ng/g；牛奶、猪肝和鸡肝样品中均发现含有盐酸克伦特罗，最高浓度分别为5.33ng/mL、2.28ng/g和0.74ng/g。

表1 ELISA最佳实验条件及IC₅₀值

表2 交叉反应物质的化学结构

表3 四种抗体的交叉反应实验结果

表4 ELISA测定真实样品中盐酸克伦特罗含量