一种可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌及其诱变育种方法和发酵工艺

摘要

本发明公开了一种可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌，该真菌分类学命名为：蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen)BS－1，其由以下方法诱变而得：从天然冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分离出的蝙蝠蛾被毛孢菌株中提取原生质体，对原生质体在15～60W紫外灯下距离10～50cm，照射1～300s，然后接种于MYG再生培养基上放置在25～28℃恒温箱中培养；取诱变培养得到的菌株接种于发酵培养基中，在25～28℃下进行10代以上的驯化后，分别测定有效成分含量，选择生长旺盛、菌粉得率高、有效成分含量高的菌株，最后得到能够在常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢菌株。本发明还公开了该真菌的诱变育种方法和发酵工艺。所述的蝙蝠蛾被毛孢菌株可在常温下快速生长，而且其发酵周期短，生产成本低，使产品更具市场竞争力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种冬虫夏草的真正无性型蝙蝠蛾被毛孢真菌及其诱变育种方法和发酵工艺，尤其涉及一种可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌及其诱变育种方法和发酵工艺。

背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是麦角科虫草属真菌寄生于蝙蝠蛾幼虫体内形成的复合体(简称虫草)，为我国特有名贵药用真菌。产于四川、贵州、云南、青海、西藏等3500～5000米高山上。由于冬虫夏草在医药保健方面的显著疗效，以及天然资源的过度采集，现在天然虫草资源已经濒临枯竭。导致虫草的价格在近几年成倍增长，目前优质天然的野生虫草的价格每公斤已经高达10万元以上，普通百姓难以问津。人工培养虫草是解决这一难题的重要途径，但技术上难度极大，迄今尚无大规模成功的报道。由于很多研究结果都证实通过液体发酵产生的虫草菌丝体在有效成分和疗效方面和天然虫草相似，因此当前解决冬虫夏草资源匮乏的主要途径是利用液体深层发酵方法工业化生产虫草菌丝体。

虫草的液体深层发酵是一种无性繁殖过程，因此首先需要明确的问题是冬虫夏草的无性型究竟是哪种真菌。人们已经先后从天然虫草上分离到10个属共11个种的虫草无性系菌株，其中的几个菌株已经被当作冬虫夏草的无性型开发成药品和保健食品。如金水宝、宁心宝、百令胶囊等。其中使用最广泛的菌株是蝙蝠蛾拟青霉，该菌株也是著名的虫草产品金水宝所采用的生产菌株。但最新的研究结果表明，包括蝙蝠蛾拟青霉菌种在内的很多所谓的虫草无性型都不是真正的冬春夏草无性型，只有蝙蝠蛾被毛孢或中国被毛孢(二者是同种异名菌)才是虫草真正的无性型(魏鑫丽、印象初等，菌物学报，2006，25(2)：192—202)，是目前国内唯一得到学术界公认且可通过“生物还原法”验证的冬虫夏草的真正无性型。

目前国内外虫草的液体深层发酵研究及生产，大部分采用的菌株都是蝙蝠蛾拟青霉，而采用蝙蝠蛾被毛孢或中国被毛孢(和蝙蝠蛾被毛孢是同一种真菌的不同命名形式)所进行的液体深层发酵研究极为少见。主要原因是蝙蝠蛾拟青霉可以在常温下生长，而且生长迅速，产量高，对生长环境和培养基的要求不高，因此生产成本和技术要求都不高。而冬虫夏草真正的无性型蝙蝠蛾被毛孢由于常年生长在海拔3000-4000米的高山上，适宜的生长温度较低，而且生长十分缓慢，对人工发酵的技术条件要求很高，发酵周期往往长达20～40天，这无疑大大提高了工业化发酵生产的成本和技术难度，因此关于蝙蝠蛾被毛孢的液体深层发酵的研究很少，目前只有三项相关的专利。专利“一种中国被毛孢液体菌种发酵工艺方法”(申请号03131904.1)提供了一种蝙蝠蛾被毛孢同种异名菌株—中国被毛孢的液体低温发酵工艺，采用从虫草中分离出的中国被毛孢RCEF0273天然菌株在19～20℃温度下进行菌种培养和多级发酵生产，由于该菌株没有经过任何诱变育种，因此只能在低温下缓慢生长，且从摇瓶种接种到放罐的发酵周期长，约49～51天。另一个相关的专利是“一种中国冬虫夏草真菌—蝙蝠蛾被毛孢的发酵生产方法”(申请号200710016703.3)，其特点是将蝙蝠蛾被毛孢在13—18℃低温下进行发酵生产，发酵周期长达45—60天。最后一个相关专利是“中国冬虫夏草真菌的发酵生产方法”(专利号：ZL97110448.4)，该方法也是在12—20℃的低温下对中国被毛孢进行发酵生产，每一级发酵大约需要5—8天，因此推测其10吨规模的发酵周期大约需要15—24天。由上可见，目前已经报道的蝙蝠蛾被毛孢的发酵生产由于使用的都是原始的、未经诱变的菌种，因此其发酵生产工艺都是在低于20℃的温度下进行，而且生产周期长，能耗高，产业化生产的成本很高，抑制了蝙蝠蛾被毛孢应用产业的发展，使其不能得到最大的经济和社会效益。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供了一种可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌。

本发明的第二个目的是提供一种获得常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的诱变育种方法。

本发明的第三个目的是提供一种应用所得的常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌进行发酵生产的工艺。

本发明的第一目的是通过以下技术措施来实现的：

一种可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌，该真菌分类学命名为：蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen)BS-1，其由以下方法诱变而得：从天然冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分离出的蝙蝠蛾被毛孢菌株中提取原生质体，对原生质体在15～60W紫外灯下距离10～50cm，照射1～300s，然后接种于MYG再生培养基上放置在25～28℃恒温箱中培养；取诱变培养得到的菌株接种于发酵培养基中，在25～28℃下进行10代以上的驯化后，分别测定有效成分含量，选择生长旺盛、菌粉得率高、有效成分含量高的菌株，最后得到能够在常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢菌株。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的诱变育种方法：从青海采集的冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分离出的蝙蝠蛾被毛孢菌株(Hirsutella hepialiChen et Shen)中提取原生质体，对原生质体在15～60W紫外灯下距离10～50cm，照射1～300s，然后接种于MYG再生培养基上放置在25～28℃恒温箱中培养；取诱变培养得到的菌株接种于发酵培养基中，在25～28℃下进行10代以上的驯化后分别测定有效成分含量，选择生长旺盛、菌粉得率高、有效成分含量高的菌株，最后得到能够在常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢菌株。

所述的驯化蝙蝠蛾被毛孢诱变株的液体发酵培养基的配方为每1000重量份水中含以下重量份成分：葡萄糖1～3份，黄豆饼粉2～4份，玉米粉2～3份，KH₂PO₄0.1～0.5份，MgSO₄.7H₂O 0.05-0.20份，pH值5.5～6.5。

所述的恒温箱应处于黑暗避光环境。所述的原生质体的浓度应为10⁵～10⁸个/ml，浓度太小，长出的诱变株很少，很难筛选所需菌株；浓度太大，长出的诱变株太多，连成一片，很难进行单菌落的筛选。

所述的提取原生质体的具体步骤为：取蝙蝠蛾被毛孢菌株，接种于MYG液体培养基中，18～20℃培养15～20天，然后离心，去上清液，并用渗透压稳定剂洗涤；取提取原生质体用的复合酶，以渗透压稳定剂溶解，经微孔滤膜过滤除菌后加入到菌株中在28～35℃酶解3～4小时，将酶解液过滤，离心，去上清液，用渗透压稳定剂洗涤，得纯化的原生质体。

所述的复合酶液的加入量按每300～500mg湿菌丝加1ml酶液计算。

所述的MYG液体培养基配方为每100重量份水中含以下重量份成分：麦芽糖8～12份，葡萄糖2～6份，酵母粉3～5份，pH自然。

所述的MYG再生培养基配方为甘露醇中含以下质量体积比的成分：麦芽糖8～12％，葡萄糖2～6％，酵母粉3～5％，pH自然。所述的甘露醇浓度为0.6～0.8mol/L。

所述的渗透压稳定剂为浓度为0.6～0.8mol/L甘露醇。所述的复合酶组成为：质量百分比分别为2～4％的溶壁酶和0.2～0.8％的崩溃酶按1：1的比例的混合而成。

本发明的第三个目的是通过以下技术方案实现的：一种可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢真菌的发酵工艺，包括以下步骤：

(1)一级摇瓶菌种的培养：

将蝙蝠蛾被毛孢菌种接种于装有一级种子培养基的三角瓶中，放入25℃～28℃恒温摇床，以150～200rpm培养48～72小时，待菌丝长满三角瓶后即可；

(2)二级摇瓶菌种的培养：

将长好的一级摇瓶培养所得的种子接种到装有二级种子培养基的三角瓶中，并置于25℃～28℃恒温摇床，以180～200rpm培养48～72小时；待菌丝长满三角瓶后即可；

(3)一级种子罐生产

将一级种子罐培养基装入搅拌式发酵罐中，灭菌冷却后，调节pH值到5.5～6.5，将二级摇瓶种子接入一级种子罐中，保持培养温度为25～28℃，搅拌速度为150～220rpm，通气量为1∶0.4V/V·min～1：1.0V/V·min，罐压0.03～0.06MPa，经24～60h培养，菌种完成对数生长期即可；

(4)二级种子罐生产

将二级种子罐培养基装入搅拌式发酵罐中，灭菌冷却后，调节pH值到5.5～6.5，将一级种子罐培养好的液体种子全部接入二级种子罐中；保持培养温度为25～28℃，搅拌速度为150～220rpm，通气量为1∶0.4V/V·min～1：1.0V/V·min，罐压0.03～0.06MPa，经24～60h培养，菌种完成对数生长期即可；

(5)发酵罐生产

将液体培养基装入发酵罐，灭菌冷却后，调节pH值到5.5～6.5，将二级种子罐培养好的液体种子全部接入发酵罐培养；保持培养温度为25～28℃，搅拌速度为150～220rpm，通气量为1∶0.4V/V·min～1：1.0V/V·min，罐压0.03～0.06MPa，经60～96h培养，当发酵液变得粘稠，培养基菌pH降到3.4～4.2，发酵液中出现大量小菌球并且菌丝体的浓度达到15～22g湿菌丝/100mL，显微镜检发现菌丝开始衰老、断裂和自溶的时候，结束发酵放罐。

所述步骤(3)中二级摇瓶种子接入一级种子罐中的接种量为培养基和二级摇瓶种子混合物总重量的5～10％。

所述一级摇瓶种子培养基和二级摇瓶种子培养基配方均为每1000重量份水中含以下重量份的成分：葡萄糖1～4份，黄豆饼粉0.5～3份，玉米粉1～3份，麸皮0.1～1.0份，KH₂PO₄0.05～0.2份，MgSO₄.7H₂O 0.01～0.1份，VB1 0.005～0.05，pH值5.5～6.5。

所述的一级种子罐培养基、二级种子罐培养基和发酵罐培养基配方均为每1000重量份水中含以下重量份的成分：葡萄糖1～4份，黄豆饼粉1～4份，蚕蛹粉0.5～2.0份，玉米粉1～4份，麸皮0.1～2份，KH₂PO₄ 0.1～1.0份，MgSO₄.7H₂O 0.01～0.1份，VB1 0.005～0.05，pH值5.5～6.5。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

(1)诱变培育所得蝙蝠蛾被毛孢菌株可在常温下快速生长，而且其发酵周期比现有报道的蝙蝠蛾被毛孢的发酵周期大大缩短，因而使得生产成本大大降低，使产品更具市场竞争力。

(2)目前关于蝙蝠蛾被毛孢液体发酵的研究比较少，而且报道的蝙蝠蛾被毛孢的发酵生产工艺均没有注明发酵菌粉的得率和有效成分的含量。目前关于虫草无性型发酵研究最多的是蝙蝠蛾拟青霉，该领域最著名的产品是金水宝，其菌粉中腺苷和甘露醇的含量分别达到2％和4.3％左右。而本发明中蝙蝠蛾被毛孢菌株不但发酵菌粉得率高，可达到2％以上，而且菌粉中腺苷和甘露醇的含量也非常高，平均分别达到约0.26％和4.52％的水平。由于本发明所生产的蝙蝠蛾被毛孢是真正的冬虫夏草无性型，而且其得率和有效成分含量都不低于目前虫草发酵行业的著名品牌金水宝，因此本专利所生产的蝙蝠蛾被毛孢可作为冬虫夏草的替代品应用于医药和保健品行业，产生良好的经济和社会效益。

(3)本发明提供的获得可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢菌株的诱变育种方法及发酵工艺简单、稳定、重现性好，发酵周期短，不需要低温培养，发酵参数容易控制，成功率高，可进行大批量的培养发酵，生产成本低，适于蝙蝠蛾被毛孢的工业化生产。

具体实施方式

实施例一：

使用的材料：

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基：蒸馏水、20％马铃薯浸汁、2％葡萄糖和2％琼脂粉构成。

MYG液体培养基：100ml蒸馏水中含有麦芽糖10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，pH自然；

复合酶：质量百分比浓度分别为2.5％的溶壁酶和0.5％崩溃酶按1：1的比例混合而成；2.5％溶壁酶(Lywallzyme，购自广东省微生物研究所)，0.5％崩溃酶(Driselase，购自FLUKA AG，CHEM)；

渗透压稳定剂：0.6mol/L甘露醇；

MYG再生培养基：100ml浓度为0.6mol/L甘露醇中含有麦芽糖10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，pH自然；

液体发酵培养基：葡萄糖2％，黄豆饼粉2％，玉米粉1.5％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄.7H₂O0.05％，蒸馏水1000ml，pH值6.0；

一级摇瓶种子培养基或二级摇瓶种子培养基：葡萄糖1.5％，黄豆饼粉2％，玉米粉1.5％，麸皮0.5％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，VB1 10mg/L，蒸馏水1000ml，pH值6.0；

一级种子罐培养基、二级种子罐培养基或发酵罐液体培养基：葡萄糖2％，黄豆饼粉2％，蚕蛹粉1％，玉米粉1.5％，麸皮0.5％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，VB1 10mg/L，蒸馏水1000ml，pH值6.5。

诱变培育方法：

A、原生质体的制备：

按常规方法从青海采集的冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分离出的蝙蝠蛾被毛孢菌株，并将菌株接种到PDA斜面培养基上进行培养。

取PDA斜面培养基上生长旺盛的蝙蝠蛾被毛孢菌丝，取指甲大小的一块，接种于400ml MYG液体培养基中，18℃培养20天，然后将发酵液以3000rpm离心10分钟，去上清液，并用0.6mol/L甘露醇将菌丝体洗涤三次。称量好复合酶，以0.6mol/L甘露醇溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，按每300mg湿菌丝加1ml酶液计算向菌丝体中加入复合酶液，在30℃酶解3.5小时，将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，4000rpm离心10分钟，去上清液，再用0.6mol/L甘露醇洗涤两次，得纯化的原生质体。

B、紫外诱变：

将制备好的原生质体稀释至10⁶个/mL，取5mL放于无菌的9cm平皿内，15w紫外灯，距离30cm，照射约45s，然后取1mL样品分别稀释10倍、50倍、100倍后，分别取0.1ml涂MYG再生培养基平板上，于28℃黑暗闭光的恒温箱中培养至再生菌落长出。然后随机挑取不同的再生菌株进行下面的筛选。

C、突变株的筛选：

将上述经过诱变后的菌株，接种到400ml液体发酵培养基中，在28℃连续进行10代以上的驯化，分别测定有效成分含量，然后选择生长旺盛、菌粉得率高、有效成分含量高的菌株，接种到PDA斜面培养基上培养，作为液体发酵工艺的生产菌株。

发酵生产：

取上述步骤中选育出的可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢菌种，进行摇瓶菌种培养和三级发酵，具体步骤如下：

(1)菌种摇瓶培养：

A、一级摇瓶种的培养：

在500ml三角瓶中装入100ml一级摇瓶种子培养基，灭菌冷却后，取斜面培养基上指甲大小的一块菌丝接种于一级种子培养基中，放入25℃恒温摇床，以150—200rpm培养48小时，然后转接到二级种子培养基中；

B、二级摇瓶种的培养：

在1000ml三角瓶中装入400ml二级摇瓶种子培养基，灭菌冷却后，按20％的接种量将长好的100mL一级种子接种到400ml二级种子培养基中，并置于25℃恒温摇床，以180—200rpm培养56小时，然后转接到一级种子罐中。

(2)菌种的发酵：

A、一级种子罐生产

在100L搅拌式发酵罐中装入50L一级种子罐培养基，灭菌冷却后，调节pH值到6.5，按10％的接种量将上述培养好的二级摇瓶种子接入一级种子罐中，接种后一级种子罐中的培养基总体积约为60L。保持培养温度为25℃，搅拌速度为150rpm，通气量为1∶0.4V/V·min，罐压0.05MPa，经36h培养，菌种完成对数生长期，再转接到二级种子罐中；

B、二级种子罐生产

在1T搅拌式种子罐中装入600L二级种子培养基，灭菌冷却后，调节pH值到6.5，将一级种子罐培养好的60L液体种子全部接入二级种子罐中，接种后二级种子罐中的培养基总体积约为660L。保持培养温度为25℃，搅拌速度为180rpm，通气量为1∶0.6V/V·min，罐压0.05MPa，经48h培养，菌种完成对数生长期，再转接到发酵罐中；

C、发酵罐生产

在10T发酵罐中装入6T液体培养基，灭菌冷却后，调节pH值到6.5，将二级种子罐培养好的液体种子660L全部接入发酵罐培养，接种后发酵罐中的培养基总体积约为6660L。保持培养温度为25℃，搅拌速度为220rpm，通气量为1∶1.0V/V·min，罐压0.06MPa，经76h培养，当发酵液变得粘稠，培养基菌pH降到3.6，发酵液中出现大量小菌球并且菌丝体的浓度达到18.9g湿菌丝/100mL，显微镜检发现菌丝开始衰老、断裂和自溶的时候，结束发酵放罐。

实施例二：

使用的材料：

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基：蒸馏水、20％马铃薯浸汁、2％葡萄糖和2％琼脂粉构成。

MYG液体培养基：100ml蒸馏水中含有麦芽糖8g，葡萄糖4g，酵母粉3g，pH自然；

复合酶：由质量百分比2％的溶壁酶与0.2％的崩溃酶按1：1的比例混合而成；溶壁酶(Lywallzyme)：购自广东省微生物研究所；崩溃酶(Driselase)：购自FLUKA AG，CHEM；

渗透压稳定剂：0.8mol/L甘露醇；

MYG再生培养基：100ml浓度为0.8mol/L甘露醇中含有麦芽糖8g，葡萄糖4g，酵母粉3g，pH自然；

液体发酵培养基：葡萄糖1.5％，黄豆饼粉2.5％，玉米粉1％，KH₂PO₄ 0.05％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，蒸馏水1000ml，pH值6.5；

一级摇瓶种子培养基或二级摇瓶种子培养基：葡萄糖1％，黄豆饼粉2.5％，玉米粉1％，麸皮0.2％，KH₂PO₄ 0.05％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，VB1 20mg/L，蒸馏水1000ml，pH值6.5；

一级种子罐培养基、二级种子罐培养基或发酵罐液体培养基：葡萄糖2％，黄豆饼粉2％，蚕蛹粉1％，玉米粉1.5％，麸皮0.5％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，VB1 10mg/L，蒸馏水1000ml，pH值6.5。

诱变培育方法：

A、原生质体的制备：

按常规方法从青海采集的冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分离出的蝙蝠蛾被毛孢菌株，并将菌株接种到PDA斜面培养基上进行培养。

取PDA斜面培养基上生长旺盛的蝙蝠蛾被毛孢菌丝，取指甲大小的一块，接种于400ml MYG液体培养基中，20℃培养15天，然后将发酵液以3000rpm离心10分钟，去上清液，并用0.8mol/L甘露醇将菌丝体洗涤三次。称量好复合酶，以0.8mol/L甘露醇溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，按每300mg湿菌丝加1ml酶液计算向菌丝体中加入复合酶液，在28℃酶解4小时，将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，4000rpm离心10分钟，去上清液，再用0.8mol/L甘露醇洗涤两次，得纯化的原生质体。

B、紫外诱变：

将制备好的原生质体稀释至10⁸个/mL，取5mL放于无菌的9cm平皿内，25w紫外灯，距离25cm，照射约38s，然后取1mL样品分别稀释10倍、50倍、100倍后，分别取0.1ml涂MYG再生培养基平板上，于27℃黑暗闭光的恒温箱中培养至再生菌落长出。然后随机挑取不同的再生菌株进行下面的筛选。

C、突变株的筛选：

将上述经过诱变后的菌株，接种到400ml液体发酵培养基中，在27℃连续进行10代以上的驯化，分别测定有效成分含量，然后选择生长旺盛、菌粉得率高、有效成分含量高的菌株，接种到PDA斜面培养基上培养，作为液体发酵工艺的生产菌株。

发酵生产：

取上述步骤中选育出的可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢菌种，进行摇瓶菌种培养和三级发酵，具体步骤如下：

(1)菌种摇瓶培养：

A、一级摇瓶种的培养：

在500ml三角瓶中装入100ml一级摇瓶种子培养基，灭菌冷却后，取斜面培养基上指甲大小的一块菌丝接种于一级种子培养基中，放入28℃恒温摇床，以150—200rpm培养54小时，然后转接到二级种子培养基中；

B、二级摇瓶种的培养：

在1000ml三角瓶中装入400ml二级摇瓶种子培养基，灭菌冷却后，按20％的接种量将长好的100mL一级种子接种到400ml二级种子培养基中，并置于28℃恒温摇床，以180—200rpm培养50小时，然后转接到一级种子罐中。

(2)菌种的发酵：

A、一级种子罐生产

在100L搅拌式发酵罐中装入50L一级种子罐培养基，灭菌冷却后，调节pH值到6.2，按照培养基重量10％的接种量将上述培养好的二级摇瓶种子接入一级种子罐中，接种后一级种子罐中的培养基总体积约为60L。保持培养温度为28℃，搅拌速度为160rpm，通气量为1∶0.45V/V·min，罐压0.04MPa，经38h培养，菌种完成对数生长期，再转接到二级种子罐中；

B、二级种子罐生产

在1T搅拌式种子罐中装入600L二级种子培养基，灭菌冷却后，调节pH值到6.5，将一级种子罐培养好的60L液体种子全部接入二级种子罐中，接种后二级种子罐中的培养基总体积约为660L。保持培养温度为28℃，搅拌速度为180rpm，通气量为1∶0.6V/V·min，罐压0.05MPa，经48h培养，菌种完成对数生长期，再转接到发酵罐中；

C、发酵罐生产

在10T发酵罐中装入6T液体培养基，灭菌冷却后，调节pH值到6.5，将二级种子罐培养好的液体种子660L全部接入发酵罐培养，接种后发酵罐中的培养基总体积约为6660L。保持培养温度为28℃，搅拌速度为200rpm，通气量为1∶1.1V/V·min，罐压0.06MPa，经84h培养，当发酵液变得粘稠，培养基菌pH降到3.4，发酵液中出现大量小菌球并且菌丝体的浓度达到20.5g湿菌丝/100mL，显微镜检发现菌丝开始衰老、断裂和自溶的时候，结束发酵放罐。

实施例三：

使用的材料：

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基：蒸馏水、20％马铃薯浸汁、2％葡萄糖和2％琼脂粉构成。

MYG液体培养基：100ml蒸馏水中含有麦芽糖10g，葡萄糖2g，酵母粉2g，pH自然；

复合酶：由质量百分比3％的溶壁酶与0.8％的崩溃酶按1：1的比例混合而成；溶壁酶(Lywallzyme)，购自广东省微生物研究所，崩溃酶(Driselase)，购自FLUKA AG，CHEM；

渗透压稳定剂：0.7mol/L甘露醇；

MYG再生培养基：100ml浓度为0.7mol/L甘露醇中含有麦芽糖10g，葡萄糖2g，酵母粉2g，pH自然；

液体发酵培养基：葡萄糖1％，黄豆饼粉2％，玉米粉2％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄.7H₂O0.05％，蒸馏水1000ml，pH值6.5；

一级摇瓶种子培养基或二级摇瓶种子培养基：葡萄糖1％，黄豆饼粉2％，玉米粉2％，麸皮1.0％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，VB1 50mg/L，蒸馏水1000ml，pH值6.5；

一级种子罐培养基、二级种子罐培养基或发酵罐液体培养基：葡萄糖1％，黄豆饼粉2％，蚕蛹粉1％，玉米粉2％，麸皮1.0％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，VB150mg/L，蒸馏水1000ml，pH值6.5。

诱变培育方法：

A、原生质体的制备：

按常规方法从青海采集的冬虫夏草〔Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.〕子座分离出的蝙蝠蛾被毛孢菌株，并将菌株接种到PDA斜面培养基上进行培养。

取PDA斜面培养基上生长旺盛的蝙蝠蛾被毛孢菌丝，取指甲大小的一块，接种于400ml MYG液体培养基中，18℃培养20天，然后将发酵液以3000rpm离心10分钟，去上清液，并用0.7mol/L甘露醇将菌丝体洗涤三次。称量好复合酶，以0.7mol/L甘露醇溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，按每300mg湿菌丝加1ml酶液计算向菌丝体中加入复合酶液，在35℃酶解3小时，将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，4000rpm离心10分钟，去上清液，再用0.8mol/L甘露醇洗涤两次，得纯化的原生质体。

B、紫外诱变：

将制备好的原生质体稀释至10⁶个/mL，取5mL放于无菌的9cm平皿内，30w紫外灯，距离25cm，照射约28s，然后取1mL样品分别稀释10倍、50倍、100倍后，分别取0.1ml涂MYG再生培养基平板，于25℃黑暗闭光的恒温箱中培养至再生菌落长出。然后随机挑取不同的再生菌株进行下面的筛选。

C、突变株的筛选：

将上述经过诱变后的菌株，接种到400ml液体发酵培养基中，在25℃连续进行10代以上的驯化，分别测定有效成分含量，然后选择生长旺盛、菌粉得率高、有效成分含量高的菌株，接种到PDA斜面培养基上培养，作为液体发酵工艺的生产菌株。

发酵生产：

取上述步骤中选育出的可常温发酵的蝙蝠蛾被毛孢菌种，进行摇瓶菌种培养和三级发酵，具体步骤如下：

(1)菌种摇瓶培养：

A、一级摇瓶种的培养：

在500ml三角瓶中装入100ml一级摇瓶种子培养基，灭菌冷却后，取斜面培养基上指甲大小的一块菌丝接种于一级种子培养基中，放入27℃恒温摇床，以150—200rpm培养54小时，然后转接到二级种子培养基中；

B、二级摇瓶种的培养：

在1000ml三角瓶中装入400ml二级摇瓶种子培养基，灭菌冷却后，按20％的接种量将长好的100mL一级种子接种到400ml二级种子培养基中，并置于27℃恒温摇床，以180—200rpm培养50小时，然后转接到一级种子罐中。

(2)菌种的发酵：

A、一级种子罐生产

在100L搅拌式发酵罐中装入50L一级种子罐培养基，灭菌冷却后，调节pH值到6.5，按照培养基重量10％的接种量将上述培养好的二级摇瓶种子接入一级种子罐中，接种后一级种子罐中的培养基总体积约为60L。保持培养温度为27℃，搅拌速度为140rpm，通气量为1∶0.55V/V·min，罐压0.045MPa，经48h培养，菌种完成对数生长期，再转接到二级种子罐中；

B、二级种子罐生产

在1T搅拌式种子罐中装入600L二级种子培养基，灭菌冷却后，调节pH值到6.5，将一级种子罐培养好的60L液体种子全部接入二级种子罐中，接种后二级种子罐中的培养基总体积约为660L。保持培养温度为27℃，搅拌速度为170rpm，通气量为1∶0.65V/V·min，罐压0.05MPa，经48h培养，菌种完成对数生长期，再转接到发酵罐中；

C、发酵罐生产

在10T发酵罐中装入6T液体培养基，灭菌冷却后，调节pH值到6.5，将二级种子罐培养好的液体种子660L全部接入发酵罐培养，接种后发酵罐中的培养基总体积约为6660L。保持培养温度为27℃，搅拌速度为210rpm，通气量为1∶1.2V/V·min，罐压0.06MPa，经71h培养，当发酵液变得粘稠，培养基菌pH降到3.4，发酵液中出现大量小菌球并且菌丝体的浓度达到21.5g湿菌丝/100mL，显微镜检发现菌丝开始衰老、断裂和自溶的时候，结束发酵放罐。