具有提高的稳定性的白细胞介素12p40变体

摘要

本发明公开了经修饰的白细胞介素－12(IL－12)p40多肽。该经修饰的多肽在IL－12p40亚单位中具有改变以消除在位置Lys260和Arg261之间的蛋白酶部位。与野生型成熟的人IL－12p40多肽相比较，根据本发明的经修饰的IL－12p40多肽具有提高的稳定性。

说明书

发明领域：

本发明总体上涉及IL-12p40蛋白，包括含有IL-12p40的融合蛋白， 所述IL-12p40受到修饰以提高它们的稳定性。具体而言，本发明的 IL-12p40蛋白移除了p40亚单位Lys260和Arg261区域中的蛋白水解部位。

发明背景

白细胞介素12(IL-12)是炎性细胞因子，其通过淋巴系统的多种细胞， 包括吞噬细胞、B细胞和活化的树突状细胞应答感染而产生(Colombo和 Trinchieri(2002)，Cytokine & Growth Factor Reviews，13：155-168)。IL-12 在介导免疫系统的固有免疫和适应性免疫之间的相互作用、作用于T细胞 和天然杀伤(NK)细胞、增强细胞毒性淋巴细胞的增殖和活性以及提高其它 炎性细胞因子特别是干扰素γ(IFN-γ)的产生中起着重要的作用。

IL-12是由α-链(p35亚单位，IL-12p35)和β-链(p40亚单位，IL-12p40) 组成的异源二聚体，所述α-链和β-链通过二硫桥共价连接以形成生物活性 的74kDa异源二聚体。成熟的(野生型)人IL-12的IL-12p35和IL-12p40 的氨基酸序列分别描述于图1(SEQ ID NO：1)和图2(SEQ ID NO：2)。

白细胞介素23(IL-23)是与IL-12密切相关的二硫键桥接的异源二聚体 分子，因为其具有与IL-12相同的β链IL-12p40，但是具有独特的α链(p19 亚单位，IL-23p19)(Oppmann等，(2000)，Immunity，13：715-725)。与IL-12 类似，IL-23是由吞噬细胞和活化的树突状细胞产生的，并且被认为参与 一系列炎性细胞的募集和活化(Langrish等，(2004)Immunol.Rev.，202： 96-105)。成熟的人IL-23的IL-23p19的氨基酸序列描述于图3(SEQ ID NO：3)。

对于免疫细胞分泌生物活性的IL-12或IL-23异源二聚体而言，需要 在相同的细胞中伴随表达α和β亚单位。没有观察到免疫细胞仅分泌 IL-12p35或IL-23p19，但是产生生物活性IL-12或IL-23异源二聚体的细 胞超过异源二聚体10至100倍地分泌游离形式的p40亚单位(D’Andrea等 (1992)，J.Exp.Med.，176：1387-98，Oppmann等，(2000)，Immunity，13： 715-725)。此外，已观察到在小鼠中，甚至在不存在α亚单位的情况下， 细胞也可能产生生物活性的IL-12p40同源二聚体(Hikawa等(2004)， Neuroscience，129：75-83)。

已显示出内源IL-12的存在对于免疫抵抗广泛的病原体以及免疫抵抗 移植和化学诱导的肿瘤是必需的(Gateley等(1998)，Annu.Rev.Immunol.， 16：495-521)。已证明IL-12具有基于诱导IFN-γ和活化效应细胞诸如CD8+ T细胞和NK细胞的有效的抗肿瘤活性(Brunda等(1993)，J.Exp.Med.，178： 1223-30)。作为其经证实的抗肿瘤活性的结果，在人类临床试验中作为用 于治疗多种癌症的免疫治疗剂测试了IL-12(Atkins等(1997)，Clin.Cancer Res.，3：409-17；Gollob等(2000)，Clin.Cancer Res.，6：1678-92；以及 Hurteau等(2001)，Gynecol.Oncol.，82：7-10)，所述癌症包括肾癌、结肠癌、 卵巢癌、黑素瘤和T细胞淋巴瘤，以及作为用于癌症疫苗的佐剂测试了 IL-12(Lee等(2001)，J.Clin.Oncol.19：3836-47)。

对于IL-12或IL-23，产生正确折叠的和生物活性的异源二聚体形式的 重组蛋白需要在生产细胞系中同时表达α亚单位和IL-12p40两者。然而， 纯化的重组蛋白显示出一定程度的异质性，这是由在IL-12p40的C端区 域的蛋白酶剪切所造成的。IL-12或IL-23蛋白的不稳定性可能导致在其生 产和作为治疗剂的临床应用中的问题。因此，本领域需要经改良的重组 IL-12或IL-23变体，所述变体产生对蛋白酶剪切更具抵抗力的同质蛋白。

发明概述

本发明提供了人IL-12 p40亚单位的变体(p40变体)，与野生型IL-12 p40蛋白相比较，其具有经提高的稳定性。在这些p40变体中，将通常对 蛋白酶剪切敏感的C端区域改造得对蛋白酶消化更具抵抗力。特别地，本 发明的p40变体包括在D3结构域改造的氨基酸改变，目的是避免产生潜 在的T细胞表位，所述表位可能会使变体蛋白具免疫原性并触发人的抗体 反应。结果，本发明的p40变体在有关其生产、制剂和药物动力学中，具 有超过野生型IL-12p40蛋白的经提高的作为治疗剂的特性。

因此，一方面，本发明提供了人IL-12 p40 D3结构域的变体(D3变体)， 其中D3变体具有与野生型人IL-12 p40 D3结构域至少85％的同一性，并 包括在对应于成熟的人IL-12 p40残基258-266位的一个或多个位置的氨基 酸改变。本发明的某些实施方案部分地基于这样一种理解，即根据本发明 的氨基酸的一个改变或多个改变具有移除Lys260和Arg261之间的蛋白水 解部位的特定的益处。

根据本发明，对对应于残基258-266位的一个或多个位置的氨基酸改 变可以是缺失、替换或插入。此外，用非碱性氨基酸替换碱性氨基酸的氨 基酸替换能够用于产生根据本发明的变体。

具体而言，本发明的D3变体可以包括在选自Lys258、Ser259、Lys260、 Arg261、Lys263、Lys 264、Asp265和Arg266位置处的一个或多个氨基 酸替换。此类氨基酸改变可以单独或联合地应用以诱导上文描述的结构和/ 或功能改变。例如，D3变体可以掺入一个、两个、三个、四个或更多的下 列替换：Lys258Gln、Ser259Asp、Lys260Ala、Lys260Asn、Lys260Gln、 Lys260Gly、Arg261Ala、Arg261Asp、Arg261Thr、Lys263Gly、Lys263Ser 和/或Lys264Gly。

在一些实施方案中，替换是位置Lys260。替换可以用非碱性氨基酸例 如Ala、Asn、Gln或Gly替换Lys260。除了Lys260之外的其它替换可以 发生在Ser259和Arg261。具体地，本发明的一些D3变体掺入替换 Ser259Asp、Lys260Asn和Arg261Thr。在其它的实施方案中，本发明的 D3变体掺入替换Ser259Asp、Lys260Asn、Arg261Thr和Lys264Gly，同 时任选地缺失Lys263和Asp265。或者，本发明的D3变体掺入替换 Ser259Asp、Lys260Asn、Arg261Thr和Lys264Gly而缺失Lys263、Lys264 和Asp265。

在根据本发明的其它实施方案中，包括替换Lys260的替换的D3变体 备选地包括在Lys258、Ser259、Arg261、Lys263和Lys264的一处或多处 进一步的替换。例如，在一个实施方案中，D3变体包括替换Lys258Gln、 Ser259Asp、Lys260Gln、Arg261 Asp，以及任选地Lys263Ser和Lys264Gly。

在其它的实施方案中，除了在Ser259、Lys260和Arg261处的替换外， 还缺失了对应于Lys263、Lys264、Asp265和Arg266的一个或多个残基， 而在另一个实施方案中，用非碱性氨基酸替换Lys263、Lys264、Asp265 和Arg266中的一个或多个。在其它的实施方案中，在Lys264处的替换是 Lys264Gly，以及任选地，缺失Lys263和Asp265。本发明的其它D3变体 掺入了替换Ser259Asp、Lys260Asn、Arg261Thr和Lys264Gly，以及任选 地对应于Lys263、Asp265和Arg 266的残基的缺失。

本领域技术人员能够理解，如本文所描述的掺入D3变体的p40变体 及其活性部分也在本发明的范围内。类似地，含有p40变体的IL-12蛋白 和其活性部分(IL-12变体)也在本发明的范围内。本发明还包括融合蛋白， 所述融合蛋白包括本发明的IL-12变体和选自抗体部分、非IL-12细胞因 子或其活性部分的部分。

类似地，含有p40变体的IL-23蛋白及其活性部分(IL-23变体)也在本 发明的范围内。本发明还包括融合蛋白，所述融合蛋白包括本发明的IL-23 变体和选自抗体部分、非IL-23细胞因子或其活性部分的部分。

在另一方面，本发明涉及编码本发明任何D3变体、p40变体、IL-12变 体和IL-23变体的核酸。本发明还包括包含此类核酸的细胞，例如原核细 胞。

本发明也描述了制备此类D3变体、p40变体、IL-12变体、IL-23变 体以及含有这些部分的融合蛋白的方法。

在另一方面，本发明提供了应用本发明的变体和编码这些变体的核酸 的方法。例如，本发明包括治疗患者的方法，所述方法包括给患者施与治 疗有效量的本发明的p40变体或其活性部分。

本发明的前述和其它特征和优点以及发明本身将会从以下的附图、说 明书和权利要求书中得到更全面的理解。

总之，本发明涉及：

·IL-12 p40 D3结构域的变体，其中变体具有与野生型人IL-12 p40 D3结构域至少85％的序列同一性并且包含在对应于亲本的成熟的人IL-12 p40的位置258-266处的残基的一个或多个位置处的氨基酸改变。

·相应的变体，其中改变消除了Lys260和Arg261之间的蛋白酶部位。

·相应的变体，其中改变是替换或缺失。

·相应的变体，其中改变是选自Lys258、Lys260、Lys263和Lys264 的替换。

·相应的变体，其中选择了一个或多个下列氨基酸替换：

Lys258Gln，

Lys260Ala、Lys260Asn、Lys260Gln、Lys260Gly，

Lys263Gly、Lys263Ser，和

Lys264Gly。

·相应的变体，其中替换是至少在位置Lys260。

·相应的变体，其中替换是用选自Ala、Asn、Gln或Gly的非碱性 氨基酸替换碱性氨基酸。

·相应的变体，其中变体还包含在位置Ser259、Arg261或Arg266 处的一个或多个替换。

·相应的变体，其中替换是Ser259和Arg261。

·相应的变体，其中替换是Ser259Asp、Lys260Asn和Arg261Thr。

·相应的变体，还包含替换Lys264Gly。

·相应的变体，其中还缺失了残基Lys263和Asp265中的一个或两个。

·相应的变体，其中缺失了对应于Lys263、Lys264、Asp 265和Arg266 的一个或多个残基。

·相应的变体，还包含选自以下的一个或多个替换：

Lys263、Lys264、Asp 265和Arg266，

其中相应的初始氨基酸残基被非碱性氨基酸替换。

·相应的变体，还包含选自以下的一个或多个替换：

Lys258、Ser259、Arg261、Lys263和Lys264。

·相应的变体，其中替换是Lys258Gln、Ser259Asp、Lys260Gln和 Arg261Asp。

·相应的变体，还包含替换Lys263Ser和Lys264Gly。

·相应的变体，特别包含：

(i)下列替换：Ser259Asp、Lys260Asn和Arg261Thr。以及

(ii)下列缺失：Lys263、Lys264和Asp265，

其中所述的位置与未修饰的野生型分子相关联，因此在变体的位置 258-263形成序列串Lys-Asp-Asn-Thr-Glu-Arg。

·相应的变体，特别包含：

(i)下列替换：Ser259Asp、Lys260Asn、Arg261Thr和Lys264Gly， 以及

(ii)下列缺失：Lys263和Asp265，

其中所述的位置与未修饰的野生型分子相关联，因此在变体的位置 258-264形成序列串Lys-Asp-Asn-Thr-Glu-Gly-Arg。

·相应的变体，其包含下列替换：Lys258Gln、Ser259Asp、 Lys260Gln、Arg261Asp，

因此在变体的位置258-265形成序列串：Gln-Asp-Gln-Asp-Glu- Lys-Lys-Arg。

·相应的变体，所述变体包含下列替换：Lys258Gln、Ser259Asp、 Lys260Gln、Arg261Asp、Lys263Ser、Lys264Gly，

因此在变体的位置258-265形成序列串：Gln-Asp-Gln-Asp-Glu- Ser-Gly-Arg。

·IL-12蛋白或其片段，其含有上文和下文中描述的变体。

·IL-23蛋白或其片段，其含有上文和下文中描述的变体。

·融合蛋白，其包含所描述的变体、或IL-12或IL-23蛋白，以及抗 体或其活性部分。

·相应的融合蛋白，其中所述的变体或所述的蛋白融合至所述抗体或 抗体部分优选地所述抗体的Fc部分的C端，其中所述抗体靶向肿瘤抗原， 诸如KS(EpCam)或14.18，或在肿瘤组织中过量表达的受体，诸如HER2 或EGFR或VEGFR。

·编码在上文和下文中所描述的变体、或IL-12或IL-23蛋白、或融 合蛋白的核酸或DNA分子。

·包含所述核酸的表达载体。

·产生所描述的变体或IL-12或IL-23蛋白或融合蛋白的宿主细胞。

·适用于治疗由IL-12或IL-23触发的疾病的药物组合物，其包含药 学有效量的变体、IL-12或IL-23蛋白、或包含此类变体或IL-12或IL-23 蛋白的融合蛋白，任选地还包含可药用的载体稀释剂或赋形剂，或具有联 合治疗方案中的其它药学有效药物。

·所述药物组合物或其有效成分用于制备治疗癌症或自身免疫疾病 的药物的用途。

附图简述：

图1描述了成熟的(野生型)人IL-12的α链即p35亚单位的成熟氨基 酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2描述了成熟的(野生型)人IL-12的β链即p40亚单位的成熟氨基 酸序列(SEQ ID NO：2)。对应于位置211-306(SEQ ID NO：26)的结构域D3 用斜体标出，并且对应于位置258-266的肽片段用下划线标出(SEQ ID NO：5)，Lys260和Arg261用粗体强调。

图3描述了成熟的(野生型)人IL-23的α链即p19亚单位的成熟氨基 酸序列(SEQ ID NO：3)。

图4A显示了以抗体融合蛋白产生的数种纯化的人IL-12的 SDS-PAGE凝胶(泳道1-8)，而图4B显示了以抗体融合蛋白产生的数种纯 化的人IL-23的SDS-PAGE凝胶(泳道1-3)。IL-12p35和IL-23p19亚单位 共价地连接至抗体重链。6kD的条带用箭头标出。标记物(泳道M)指示分 子量(kD)。

图5描述了成熟的(野生型)人IL-12p40亚单位C端肽片段的氨基酸序 列。片段从Arg261开始(SEQ ID NO：4)。

图6描述了对应于成熟的(野生型)人IL-12p40亚单位的位置258-266 的肽片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。

图7.1和7.2描述了来自不同哺乳动物，包括人、狒狒(Papio anubis)、 恒河猴(Macaca mulatta)、白眉猴(Cercocebus torquatos)、狗(Canis familiaris)、猫(Felis catus)、马(Equus caballus)、猪(Sus scrota)、母牛(Bos Taurus)、山羊(Capra hircus)、绵羊(Ovis aries)、鹿(Cervus elaphus)、水牛 (Bubalus bubalis)、仓鼠(Mesocricetus auratus)、豚鼠(Cavia porcellus)、棉 鼠(Sigmodon hispidus)、大鼠(Rattus norvegicus)和小鼠(Mus musculus)的 IL-12p40亚单位的氨基酸序列比对。用粗体标出的两个氨基酸是蛋白酶剪 切部位。

图8描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V1的变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。改造的序列用下划线标出。

图9描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V2的变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。改造的序列用下划线标出。

图10描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V3的变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。改造的序列用下划线标出。

图11描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V4的变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。改造的序列用下划线标出。

图12描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V5的变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。改变用下划线标出。

图13描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V6的变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。改变用下划线标出。

图14描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V7的变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。改变用下划线标出。

图15描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V8的变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。改变用下划线标出。

图16描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V9的变体 的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。改变用下划线标出。

图17描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V10的变 体的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。改变用下划线标出。

图18描述了成熟的人IL-12p40亚单位的在本文中称为p40V11的变 体的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。改变用下划线标出。

图19描述了编码全长(野生型)人IL-12p40亚单位的核酸序列(SEQ ID NO：21)。

图20描述了编码p40变体p40V1和p40V2部分的在本文中称为V1V2 的合成核苷酸片段的核酸序列。V1V2片段包含V1片段，所述V1片段包 括编码SEQ ID NO：17的区域(下划线标出)。V1片段后接连接子序列(小 写)，以及随后是包括编码SEQ ID NO：18的区域(下划线标出)的V2片段。

图21描述了编码p40变体p40V3和p40V4部分的在本文中称为V3V4 的合成核苷酸片段的核酸序列。V3V4片段包括V3片段，所述V3片段包 含编码SEQ ID NO：19的区域(下划线标出)。V3片段后接连接子序列(小 写)，以及随后是包括编码SEQ ID NO：20的区域(下划线标出)的V4片段。

图22描述了编码p40变体p40V5和p40V6部分的在本文中称为V5V6 的合成核苷酸片段的核酸序列。V5V6片段包括V5片段，所述V5片段包 含编码Arg261Ala的密码子替换(下划线标出)。V5片段后接连接子序列 (小写)，以及随后是包括编码Lys260Ala和Arg261Ala的密码子替换(下划 线标出)的V6片段。

图23描述了编码p40变体p40V7和p40V8部分的在本文中称为V7V8 的合成核苷酸片段的核酸序列。V7V8片段包含V7片段，所述V7片段包 括编码Lys260Ala的密码子替换(下划线标出)。V7片段后接连接子序列(小 写)，以及随后是包括编码Lys260Gly的密码子替换(下划线标出)的V8片 段。

图24是用多克隆抗人p40抗体的蛋白质印迹(Western blot)。收获用 野生型IL-12p40和IL-12p40变体(V1-V4)转染的细胞的上清液，并在 SDS-PAGE凝胶上进行处理。对每一IL-12p40变体p40V1、p40V2、p40V3 和p40V4的两个独立克隆(a，b)进行了测试。箭头指出了经切割缺少C端 片段的IL12p40的条带(泳道p40wt)。

图25显示了含有p40变体p40V1、p40V2、p40V3、p40V4、p40V5、 p40V6、p40V7、p40V8和野生型p40的抗体-IL12融合蛋白的SDS-PAGE 凝胶(泳道1-9)。上面的主要条带表示抗体重链和p35亚单位之间的融合蛋 白，以及下面的主要条带表示抗体轻链。除了泳道5外，在变体蛋白的任 何泳道都没有检测到6kDa条带。标记物(条带M)标出了分子量(kD)。

图26显示了静脉内施与的含有p40变体p40V1-p40V8的抗体-IL12 融合蛋白与抗体-(野生型)IL12融合蛋白相比较的药物代谢动力学数据。

图27A显示了皮下施与的含有p40变体p40V1-p40V4的抗体-IL12融 合蛋白与抗体-(野生型)IL12融合蛋白相比较的药物代谢动力学数据(图 27A)，且图27B显示了皮下施与的含有p40变体p40V5-p40V8的抗体-IL12 融合蛋白与抗体-(野生型)IL12融合蛋白相比较的药物代谢动力学数据(图 27B)。

图28是具有在蛋白的D3区域外的突变的IL-12p40变体。

发明详述：

本发明描述了细胞因子白细胞介素-12(IL-12)p40亚单位的变体，其具 有与野生型蛋白相比提高的稳定性。在这些变体中，将通常非结构组成的 且对蛋白酶剪切敏感的p40亚单位的区域突变为对蛋白酶剪切更具抵抗 力。在结构域D3中的这一区域靠近p40亚单位的C端，包括对应于成熟 的人p40中氨基酸258-266的多肽段(p40(258-266))。

IL-12p40亚单位也是细胞因子白细胞介素23(IL-23)的成分亚单位。 IL-23具有α亚单位“p19”和β亚单位“p40”两个亚单位。IL-23的p40 亚单位与IL-12p40相同。因此，IL-12p40亚单位变体同样地也是IL-23p40 亚单位的变体。

在一类一般的实施方案中，将一个或多个突变引入对应于氨基酸残基 258-266的p40区域内，以消除在人p40中对应于Lys260和Arg261之间 位置的剪切部位。在其它的实施方案中，通过建模产生更紧密的折叠结构 而将特定的突变引入这一区域。本发明的另一方面，还预测所引入的突变 以避免使得p40亚单位的改造区域具有免疫原性。例如，选择p40亚单位 改造区域中的氨基酸替换以避免产生在人中被识别为潜在的T细胞表位的 肽。

可通过多种机制将突变引入对应于氨基酸残基258-266的p40区域。 例如，在一个实施方案中，通过一个氨基酸替换另一个氨基酸而将一个突 变或多个突变引入。在其它的实施方案中，通过一个或多个p40亚单位的 残基的缺失而引入突变。又在另一实施方案中，通过将一个或多个氨基酸 残基插入p40亚单位而引入突变。

在一个实施方案中，本发明的p40变体包含于蛋白组合物中，诸如包 含于IL-12蛋白、IL-12融合蛋白、IL-23蛋白、IL-23融合蛋白或p40同 源二聚体中。例如，在一个实施方案中，IL-12蛋白含有p35亚单位和根 据本发明的p40变体。在另一个实施方案中，IL-23蛋白含有p19亚单位 和根据本发明的p40变体。在其它实施方案中，融合蛋白含有融合至含有 IL-12p40变体的IL-12蛋白的抗体部分。在甚至其它实施方案中，融合蛋 白含有融合至含有IL-12p40变体的IL-23蛋白的抗体部分。在其它实施方 案中，融合蛋白的抗体部分是完整的抗体、Fc区域、sc-Fv、抗体的抗原结 合部分或抗体的活性片段。在其它的实施方案中，根据本发明的融合蛋白 包括融合至非IL-12或非IL-23细胞因子或其活性部分的IL-12p40变体。

在本发明的其它方面，含有本发明的p40变体之一的蛋白组合物具有 比相应的野生型蛋白更长的循环半寿期。因此，与含有野生型p40亚单位 的IL-12或IL-23蛋白相比较，包括本发明的经改造的p40亚单位的IL-12 变体或IL-23变体具有有关其生产、制剂和药物代谢动力学的作为治疗剂 的提高的性质。

在其它实施方案中，将对IL-12p40氨基酸序列的突变引入至 IL-12p40(258-266)区域的外部，以及任选的引入IL-12p40的IL-12p40 D3 结构域的外部。可将此类突变引入IL-12p40 D3结构域的其它地方，以及 可以引入至其它的结构域中。例如，图28描述了在残基258-266外部的氨 基酸序列中具有改变的IL-12 p40亚单位的序列。Leong等(2003)，Proc. Natl.Acad.Sci.USA.100：1163-1168(其内容在此处引入作为参考)教导了 IL-12 p40氨基酸序列中除258-266区域之外的可以进行突变的多个残基。 此外，由于IL-12p40的三维晶体结构是已知的(Yoon等(2000)，EMBO J. 19：3530-3541，其内容此处引入作为参考)，并且对于p40亚单位与IL-12 p35亚单位的相互作用所必需的残基是已知的，因此对不会破坏p40亚单 位功能的其它突变的选择可以由本领域技术人员确定。

剪切产物的确定

本发明部分地基于IL-12p40亚单位对于特定蛋白酶剪切事件是敏感 的这一观察，以及基于确定剪切部位的新的实验结果。已发现，当将重组 蛋白在还原条件下在SDS-PAGE凝胶上通过电泳分离时，纯化的如实施例 2描述的那样在NS/0细胞中产生的重组IL-12蛋白一致地显示出一定程度 上的异质性，可清楚的看到约6kD分子量的额外的蛋白质条带。对于重组 IL-23蛋白也观察到了类似的结果。这在图4中得到了阐明，图4显示了 对于以抗体融合蛋白产生的数种纯化的人IL-12(图4A)和人IL-23蛋白组 合物(图4B)的SDS-PAGE凝胶。

如实施例3描述的那样纯化污染物并测定其氨基酸序列，发现其对应 于IL-12p40亚单位本身的C端46个氨基酸片段的序列，这是通过在Lys260 和Arg261之间的蛋白酶剪切产生的(图5-SEQ ID NO：4)。在Lys260和 Arg261之间的剪切似乎是很占优势的，尽管在该区域剪切部位的周围是普 遍的碱性氨基酸(...KSKREKKDR...(图6-SEQ ID NO：5)，其中Lys260和 Arg261用粗体表明)。然而，尽管从p40亚单位切离，C端肽片段保持与 p40亚单位的剩余部分非共价地结合，使得难于通过重组蛋白的进一步纯 化而移除所产生的异质性。

L-12p40蛋白

成熟的人p40亚单位是306个氨基酸的蛋白质，其类似于可溶解的I 类细胞因子D受体，由结构域D1、D2和D3组成。剪切部位(Lys260和 Arg261之间)在D3内，D3是包含从I 211至S306区域的96个氨基酸的 纤连蛋白III型结构域。成熟的人IL-12 p40亚单位的序列如图2所示。D3 的氨基酸序列在图2中以斜体显示。在公开的人IL-12异源二聚体X射线 晶体结构中(Yoon等(2000)，EMBO J.，19：3530-41)，在人D3结构域的 p40(258-266)区域内的环的一部分不能被分辨。不希望被理论所束缚，在晶 体结构中未分辨的区域往往是柔性的、非结构环的指征，并且可构成蛋白 质水解的靶部位。

来自多种哺乳动物物种的成熟p40亚单位的一级结构比对如图7.1和 7.2所示，包括人；灵长类狒狒、恒河猴和白眉猴；狗；猫；马；猪；反刍 动物母牛、山羊、绵羊、鹿、水牛；以及啮齿类仓鼠、豚鼠、棉鼠、大鼠 和小鼠。在比对中，p40(258-266)周围的区域表现出序列变异性，特别是对 于其长度而言。具体的，在一些物种尤其是反刍动物中序列较短，以及在 其它动物诸如啮齿类中，序列在一些情况下可能包含额外的插入。在很多 物种中，对应于人p40 K260R261的二肽基序是保守的，或者是同一的或 者是展示出两个碱性氨基酸。这些物种包括包括农业和商业上很重要的物 种，包括但不限于马、母牛、山羊、猪以及绵羊。因此，将类似于本文所 教导的关于人IL-12p40的突变中的一个或多个的突变引入到非人 IL-12p40的对应于人IL-12p40残基258-266的区域可证实在降低或消除非 人IL-12p40在K260R261剪切部位的蛋白酶剪切是有用的。

原则上，根据本发明，可能在人或其它异种生物中应用来自缺乏对应 于人IL-12p40 K260R261的带正电二肽基序的物种的IL-12p40变体。然 而，在实践本发明中应当注意，当施与人时，非人形式的IL-12p40通常会 导致抗p40抗体。更广泛的说，将来自一个物种的p40施与另一个物种不 是最理想的。此外，不同的非人p40亚单位对蛋白酶剪切的潜力通常是未 知的。此外，来自一个物种的p40亚单位可能在另一物种中没有功能，或 者是在与诸如p35或p19的亚单位组装的步骤或者是在与受体亚单位相互 作用的步骤没有功能。

变体IL-12p40蛋白

本发明提供了在D3结构域具有突变的提高了稳定性的变体IL-12p40 蛋白。在本文中所用的术语“D3变体”是指例如IL-12或IL-23的人p40 亚单位的D3结构域，与野生型D3相比较，其具有一个或多个氨基酸改变。 本文使用的术语“p40变体”是指在D3结构域中具有突变的例如IL-12或 IL-23的人p40亚单位，即含有D3变体的p40亚单位。本文使用的术语 “IL-12变体”是指含有p40变体的人IL-12蛋白。本文使用的术语“IL-23 变体”是指含有p40变体的人IL-23蛋白。

根据本发明的一个实施方案，p40变体的D3结构域具有与野生型 IL-12p40的D3结构域至少70％或更多的序列同一性。在其它实施方案中， p40变体的D3结构域具有与野生型IL-12p40的D3结构域至少75％或更 多的序列同一性。在另一个实施方案中，p40变体的D3结构域具有与野生 型IL-12p40的D3结构域至少80％或更多的序列同一性，而在其它的实施 方案中，p40变体的D3结构域具有与野生型IL-12p40的D3结构域至少 81％或更多、或至少82％或更多、或至少83％或更多、或至少84％或更 多、或至少85％或更多、或至少86％或更多、或至少87％或更多、或至 少88％或更多、或至少89％或更多、或至少90％或更多、或至少91％或 更多、或至少92％或更多、或至少93％或更多、或至少94％或更多、或 至少95％或更多、或至少96％或更多、或至少97％或更多、或至少98％ 或更多、或至少99％或更多的序列同一性。

根据本发明的另一个实施方案，p40变体的氨基酸序列具有与成熟的 野生型IL-12p40的氨基酸序列至少70％或更多的序列同一性。在其它实 施方案中，p40变体的氨基酸序列具有与成熟的野生型IL-12p40的氨基酸 序列至少75％或更多的序列同一性。在另一个实施方案中，p40变体的氨 基酸序列具有与成熟野生型IL-12p40的氨基酸序列至少80％或更多的序 列同一性，而在其它的实施方案中，p40变体的氨基酸序列具有与成熟野 生型IL-12p40的氨基酸序列至少81％或更多、或至少82％或更多、或至 少83％或更多、或至少84％或更多、或至少85％或更多、或至少86％或 更多、或至少87％或更多、或至少88％或更多、或至少89％或更多、或 至少90％或更多、或至少91％或更多、或至少92％或更多、或至少93％ 或更多、或至少94％或更多、或至少95％或更多、或至少96％或更多、 或至少97％或更多、或至少98％或更多、或至少99％或更多的序列同一 性。

为确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，将序列进行用于最优比 较目的的比对(例如，为了与另一氨基酸序列进行最优化比对，可以将空位 引入到第一个氨基酸序列的序列中)。两个序列间的同一性百分比是序列所 共有的相同位置数的函数(即，％同一性＝(相同位置的数#/位置的总数#)乘 以100)。如果所比较的是不同长度的序列，应用较短的序列确定位置的总 数。两个序列之间的同一性百分比的确定也可以通过数学算法来完成。

用于两个序列比较的非限制性数学算法的示例是Karlin和Altschul， (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：2264-68的，如在Karlin和Altschul， (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90：5873-77中那样修正的算法。这样的 算法被并入到Altschul等，(1990)J.MoI.Biol.，215：403-10的NBLAST 和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序，得分＝100、 字长＝12来实施。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序，得分＝50、字 长＝3来实施。为得到用于比较目的的空位比对，可以如在Altschul等，(1997) Nucleic Acids Research.25(17)：3389-3402中所描述的那样利用空位 BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可以应用各个程序(例如， XBLAST和NBLAST)的缺省参数。

在一个实施方案中，本发明提供了含有改变的D3变体，所述改变移 除了Lys260和Arg261之间的蛋白酶剪切部位。在一个实施方案中，突变 了位置Lys260的氨基酸。在更特别的实施方案中，用非碱性氨基酸替换 Lys260。非碱性氨基酸例如包括Ala、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、 Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。例如用Ala、 Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、 Trp、Tyr或Val替换Lys 260。在备选的实施方案中，用硒代半胱氨酸替 换Lys 260。其中用另一个氨基酸替换了Lys260的D3变体的实例显示于 图12、13、14、15、16和18中。

在其它的实施方案中，突变了Arg261。例如，在一个实施方案中，用 任何的非碱性氨基酸替换Arg261。例如，在一个实施方案中，用Ala、Asn、 Asp、Cys、Glu、 Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、 Tyr或Val替换Arg261。在备选的实施方案中，用硒代半胱氨酸替换 Arg261。其中用另一个氨基酸替换了Arg261的D3变体的实例显示于图 12、13、17和18中。在其它的实施方案中，突变了Lys260和Arg261。 例如，在一个实施方案中，用另一个氨基酸替换了Lys260和Arg261的每 一个。例如，用Gln、Ala、Asn或Gly替换Lys260并且用Ala、Asp或 Thr替换Arg261。其中用其它氨基酸替换了Lys260和Arg261两者的D3 变体的实例显示于图13和18中。

此外，在一个实施方案中缺失了Lys260和Arg261，而在其它实施方 案中，在Lys260和Arg261之间插入了氨基酸。

在其它实施方案中，产生了D3变体，其中用另一个氨基酸替换 Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、Lys263、Lys264或Arg266的一个 或多个中的每一个。在一个实施方案中，用非碱性氨基酸替换Lys258、 Ser259、Lys260、Arg261、Lys263、Lys264或Arg266的一个或多个中的 每一个。例如，在一个实施方案中，用Gln替换Lys258。在另一个实施方 案中，用Asp替换Ser259。在另一个实施方案中，用Ala、Gly、Asn或 Gln替换Lys260。在其它实施方案中，用Ala、Thr或Asp替换Arg261。 在另一个实施方案中，用Ser替换Lys263。在其它实施方案中，用Gly替 换Lys264。在一个实施方案中，用Gln、Asp、Asn或Thr替换Arg266。 在其它实施方案中，用另一个氨基酸替换Lys263和Lys264的每一个。例 如，在一个实施方案中，分别用Ser和Gly替换Lys263和Lys264的每一 个。在另一个实施方案中，分别用Gln、Asp、Gln、Asp、Ser和Gly替 换了Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、Lys263和Lys264。

在其它实施方案中，产生了D3变体，其中用另一氨基酸替换Ser259、 Lys260和Arg261的一个或多个中的每一个。在其它实施方案中，用非碱 性氨基酸替换Ser259、Lys260和Arg261的一个或多个中的每一个。例如， 在一个实施方案中分别用Asp、Asn和Thr替换Ser259、Lys260和Arg261。

在另一个实施方案中，用另一个氨基酸替换Lys258、Ser259、Lys260 和Arg261的每一个。例如，在一个实施方案中，用非碱性氨基酸替换 Lys258、Ser259、Lys260和Arg261的每一个。在一个实施方案中，分别 用Gln、Asp、Gln和Asp替换Lys258、Ser259、Lys260和Arg261的每 一个。在其它实施方案中，分别用Asp、Asn、Thr和Gly替换Ser259、 Lys260、Arg261和Lys264。在其它实施方案中，分别用Asp、Asn、Thr 和Gly替换Ser259、Lys260、Arg261和Lys264，而缺失Lys263和Asp265。 在另一个实施方案中，分别用Asp、Asn和Thr替换Ser259、Lys260和 Arg261，而缺失Lys263、Lys264和Asp265。

不希望被理论束缚，认为缺失具有降低p40(258-266)区域的构象柔性 的效果，并因此降低Lys260-Arg261基序采取允许相关蛋白酶剪切的构象 的能力。因此，在一个实施方案中，缺失了Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、 Lys263、Lys264、Asp265或Arg266中的一个或多个。

在其它的实施方案中，产生了D3变体，其中缺失了Lys263、Lys264、 Asp265或Arg266的一个或多个。例如，在一个实施方案中，缺失了Lys263 和Asp265，而在另一个实施方案中，缺失了Lys263、Lys264和Asp265。 在另一个实施方案中，缺失并用一个或多个非碱性氨基酸替换Lys263、 Lys264和Asp265。在其它实施方案中，缺失了Lys263、Lys264、Asp265 和Arg266。在其它实施方案中，缺失Lys263、Lys264、Asp265或Arg266 的一个或多个，而用另一个氨基酸替换Ser259、Lys260或Arg261的一个 或多个。例如，在一个实施方案中，分别用Asp、Asn和Thr替换Ser259、 Lys260和Arg261，而缺失Lys263、Lys264和Asp265。在其它实施方案 中，分别用Asp、Asn和Thr替换Ser259、Lys260和Arg261，而缺失Lys263、 Lys264、Asp265和Arg266。

在其它的实施方案中，选择氨基酸替换以避免产生新的T细胞表位。 分析肽序列产生T细胞表位的潜力的方法是本领域公知的(参见，例如，美 国专利申请公开号2003/0153043；国际公开号WO 00/034317；以及 Sturniolo等(1999)，Nature Biotech.，17：555-61)。在一个实施方案中，用 序列KDNTER(SEQ ID NO：17)替换人IL-12p40(258-266)的序列。换言之， 分别用Asp、Asn和Thr替换Ser259、Lys260和Arg261，而缺失Lys263、 Lys264和Asp265，因此在来自变体中残基258-263所产生的序列是 KDNTER。所产生的IL-12p40变体显示于图8中。

在其它的实施方案中，用序列KDNTEGR(SEQ ID NO：18)替换人 IL-12p40(258-266)的序列。换言之，分别用Asp、Asn和Thr替换Ser259、 Lys260和Arg261，而缺失Lys263、Lys264和Asp265并只用Gly残基替 换，因此来自变体中残基258-264所产生的序列是KDNTEGR。所产生的 IL-12p40变体显示于图9中。

在另一个实施方案中，用序列QDQDEKKDR(SEQ ID NO：19)替换人 IL-12p40(258-266)的序列。换言之，分别用Gln、Asp、Gln和Asp替换 Lys258、Ser259、Lys260和Arg261，因此来自变体中残基258-266所产生 的序列是QDQDEKKDR。所产生的IL-12p40变体显示于图10中。

在其它实施方案中，用序列QDQDESGDR(SEQ ID NO：20)替换人 IL-12p40(258-266)的序列。换言之，分别用Gln、Asp、Gln、Asp、Ser和 Gly替换Lys258、Ser259、Lys260、Arg261、Lys263和Lys264，因此来 自残基258-266所产生的序列是QDQDESGDR。所产生的IL-12p40变体 显示于图11中。

在其它的实施方案中，D3变体包含于IL-12p40亚单位或其活性部分 之内。活性部分是指与野生型IL-12p40部分的生物活性相比较，含有D3 变体的IL-12p40亚单位在一个实施方案中具有至少10％的活性、在另一 个实施方案中具有至少20％的活性、在另一个实施方案中具有至少30％的 活性、在另一个实施方案中具有至少50％的活性、在另一个实施方案中具 有至少70％的活性、在另一个实施方案中具有至少75％的活性、在另一个 实施方案中具有至少80％的活性、在另一个实施方案中具有至少90％的活 性、在另一个实施方案中具有至少95％的活性、在其它实施方案中具有至 少99％的活性、在另一个实施方案中具有至少100％的活性、在其它实施 方案中具有至少150％的活性、在另一个实施方案中具有至少200％的活 性、在其它实施方案中具有至少300％的活性、在另一个实施方案中具有 至少400％的活性、在另一个实施方案中具有至少500％的活性、在另一个 实施方案中具有至少1000％的活性。

含有IL-12p40变体的蛋白质

可将IL-12p40变体引入蛋白组合物代替野生型IL-12p40。包括 IL-12p40的生物活性蛋白组合物的实例是p40同源二聚体、IL-12和IL-12 融合蛋白、以及IL-23和IL-23融合蛋白。在本发明的一个方面，IL-12 p35/ 变体p40异源二聚体由独立的多肽链组成。备选地，IL-12 p35/变体p40 异源二聚体由单一多肽链组成。在本发明的另一方面，IL-23 p19/变体p40 异源二聚体由独立的多肽链组成。备选地，IL-23 p19/变体p40异源二聚体 由单一多肽链组成。

在本发明的另一方面，作为IL-12融合蛋白的一部分，IL-12融合配偶 体(partner)可以是抗体部分或抗体部分的一部分。有用的抗体部分包括 将IL-12融合蛋白靶向至肿瘤环境，例如靶向至肿瘤细胞本身或肿瘤的坏 死中心或支持基质的抗体部分。在本发明的另一个实施方案中，融合配偶 体是另一个细胞因子。有用的细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7和IL-15。

在本发明的另一方面，作为IL-23融合蛋白的一部分，IL-23融合配偶 体可以是抗体部分或抗体部分的一部分。有用的抗体部分包括将IL-23融 合蛋白靶向至肿瘤环境，例如靶向至肿瘤细胞本身或肿瘤的坏死中心或支 持基质的抗体部分。在本发明的另一个实施方案中，融合配偶体是另一个 细胞因子。有用的细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7和IL-15。

编码p40变体的核酸

在本发明的其它方面，考虑了编码包含本发明p40变体的多肽的核酸。 编码本发明p40变体的核酸例如可以应用本领域技术人员熟悉的DNA技 术而得到构建。示范性的方法可以在实施例1中得到。

图19描述了编码成熟的人IL-12p40亚单位的核酸序列。图20-22描 述了用于编码本发明p40变体中示范性突变的合成核苷酸片段。

应用p40变体的治疗方法

本发明的p40变体，包括含有p40变体的融合蛋白和IL-12蛋白或 IL-23蛋白可以用作免疫治疗剂，诸如，基于IL-12蛋白的经证实的抗肿瘤 活性，可用于治疗多种癌症。例如，本发明的p40变体优选地作为与p35 的异源二聚体可以用于治疗癌症，所述癌症包括但不限于肾癌、结肠癌、 卵巢癌、黑素瘤和T细胞淋巴瘤，以及可用作癌症疫苗的佐剂。p40变体 也可以作为p40/p40同源二聚体的一部分以减少TH 1反应(例如，与自身 免疫疾病相关的TH 1反应)。

施用

本发明的IL-12变体、IL-23变体和p40变体都可以并入至适合于施用 的药物组合物中。此类组合物一般包含IL-12变体或含有IL-12变体的融 合蛋白以及可药用的载体。本文所使用的术语“可药用的载体”意图包括 与药物施用相容的任何所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、 等渗剂和吸收延迟剂，等等。此类介质和试剂用于药学活性物质的应用是 本领域所公知的。

配制本发明的药物组合物以与其施用的预定途径相一致。施用途径的 示例包括肠胃外的，例如静脉内、皮肤内、皮下的、经口(例如，吸入)、 经皮(局部的)、经粘膜的和直肠施与。用于肠胃外、皮肤内或皮下施用的 溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释液，诸如用于注射的水、盐溶 液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，诸如 苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯 合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用 于调节张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱调节，诸如盐 酸或氢氧化钠。肠胃外的制品可以封装于安瓿、一次性注射器或用玻璃或 塑料制成的多剂量小瓶中。

含有本发明的IL-12变体、IL-23变体或p40变体的药物可以具有0.01 或更少至100％(w/w)的浓度，尽管所述量根据药物的剂型有所不同。

施用的剂量取决于患者的体重、疾病的严重性、所应用的IL-12p40变 体的特定类型以及医生的意见。例如，对于本发明的IL-12变体，一般可 取施与约0.01至约10mg/kg体重/天，在注射的情况下约0.02至约2mg/kg /天，或约0.5mg/kg/天。剂量可以根据疾病的严重性和医生的意见一天施 与一次或多次。对于含有本发明的IL-12p40变体的抗体-IL-12融合蛋白或 抗体-IL-23融合蛋白，一般可取每天施与约0.001至约1mg/kg体重/天， 在注射的情况下约0.002至约0.5mg/kg/天，或约0.1mg/kg/天。剂量可 以根据疾病的性质和严重性以及医生的意见每2、3或4个星期期间施与一 次或两次。

本发明的各方面将通过以下实施例进一步阐述。

实施例

实施例1：人IL-12p40亚单位变体的克隆

应用本领域技术人员熟知的标准DNA技术构建编码本发明的p40变 体的核酸，具体而言编码p40V1至p40V8(SEQ ID NO：6-13)的核酸。大体 上，从头合成编码跨越包含突变氨基酸残基的区域的片段以及通过常用的 限制性位点括起来的DNA盒(Blue Heron Biotechnology，Bothell，WA)， 并替换包含于携带p40序列的表达质粒(参见，例如，美国专利号6,838,260 中的pNC-p40)中野生型序列的相应片段。编码成熟的(野生型)人IL-12p40 亚单位的核酸序列显示于图19中。因此得到编码p40变体的表达质粒。

具体而言，如下产生编码p40V1和p40V2的核酸。用Bpu10 I和Eco RI/Sca I或Bbs I消化携带如图20所示的以连续片段合成的p40V1和 p40V2 DNA盒的克隆载体(pBHV1V2)，分别产生具有EcoR I/Bpu10 I相 容末端的EcoR I/Bpu10 I(对于V1)盒和Bbs I/Bpu10 I(对于V2)盒。Sca I 消化包括于其中以消除类似大小的V2片段。将这些纯化的片段以与得自 NC-p40的适当的Bpu10 I/Pvu I和Pvu I/Eco RI片段三重连接而克隆至 pNC-p40表达载体。

应用相同的方法从图21所示的合成序列开始产生编码p40V5和 p40V6的核酸，以及从图23所示的合成序列开始产生编码p40V7和p40V8 的核酸。

类似地，为产生编码p40V3和p40V4的核酸，应用EcoR I/Bbs I/Sca I(Sca I消化包含于其中以消除类似大小的V4片段)或仅应用Bbs I消化携 带合成的图22所示序列的质粒(pBHV3V4)，分别产生EcoR I/Bbs I(对于 V3)盒和Bbs I(对于V4)盒，每一个都具有与经EcoR I/Bbs I消化的表达载 体pNC-p40相容的末端。注意对于Bbs I限制性酶，识别序列和切割序列 是分离的，因此含有多个Bbs I识别位点的序列可产生不同的、序列特异 的突出端。然后凝胶纯化V3和V4盒，并应用得自pNC-p40的适当的Bbs I/Pvu I和Pvu I/Eco RI片段，以三重连接分别连接至pNC-p40表达质粒。

可以应用相同的通用方法产生编码其它本发明考虑的p40变体的其它 核酸分子。

实施例2：p40变体和抗体-IL-12的表达；含有p40变体的融合蛋白

应用标准方法产生表达本发明p40变体的细胞系(参见美国专利号 6,838,260)。将编码p40变体的pNC-p40表达质粒电穿孔入细胞中，例如 NS/0细胞。细胞铺板，并在含有G418的培养基中选择经转染的细胞。通 过ELISA对来自抗药克隆的培养上清液进行产生p40的分析，并亚克隆最 高产量的细胞并进行稳定表达测试。

为产生表达抗体IL-12融合蛋白的具有本发明p40变体的细胞系，采 用了美国专利号6,838,360描述的顺序转染方法。例如，通过用编码NHS76 抗体(其中重链恒定区的C端连接至IL-12 p35亚单位的N端)的第二种载 体pdHL10λDI-NHS-p35进一步转染表达p40V1的细胞系而得到融合蛋白 DI-NHS-IL12p40V1。表达质粒pdHL10λ是pdHL7的衍生物，其中编码 的轻链恒定结构域是λ链。在含有氨甲蝶呤的培养基中选择细胞，并通过 标准方法克隆表达抗体融合蛋白的稳定转染子。

实施例3：p40变体的纯化和表征

为描述p40变体p40V1、p40V2、p40V3和p40V4(SEQ ID NO：6-9) 的完整性，收集来自双重瞬时转染的表达这些变体的NS-0细胞的用过的 细胞培养液，并用多克隆抗人p40抗体进行蛋白质印迹处理，如图24所示。 对照野生型p40亚单位包含于其中作为对照(泳道1)。发现缺乏C端6kDa 片段的经切割的种类在任何所测试的变体中不存在(泳道2-9)，并且仅完整 的p40能检测到，其中所述C端6kDa片段在这些电泳条件下从完整的 p40种类中通常是很好分辨的(参见指向泳道1条带的箭头)。因此，所测试 的p40变体对在蛋白表达过程中存在的蛋白水解活性具有抗性。

应用基于蛋白A捕获的标准技术(参见美国专利号6,838,260)从细胞培 养上清液中纯化含有IL-12p40变体的抗体融合蛋白。

来自在SEQ ID NO：6-13中给出的p40变体(泳道1-8)和未突变对照(泳 道9)的NS-0稳定克隆的经纯化的抗体融合蛋白的SDS-PAGE凝胶如图25 所示。三个主要条带中间的表示未切割的p40亚单位，在稍上方具有微弱 的条带表示更糖基化的种类。上面的最主要条带表示抗体重链和p35亚单 位之间的融合蛋白，以及较下的主要条带表示抗体轻链。发现除了含有 IL-12p40V5的抗体融合蛋白样品之外，不存在6kDa条带。对于 IL-12p40V5，观察到了残余的6kDa条带(泳道5)。

实施例4：野生型IL-12P40亚单位中蛋白酶剪切部位的表征

通过标准方法确定约6kDa蛋白污染片段的特性。简单的说，将纯化 的DI-NHS-IL12蛋白变性并在55℃在缓冲的6M胍/1mM DTT溶液中还 原，并在具有10％至90％乙腈梯度的Vydac C4柱上经过反相HPLC分离。 收集对应于未经确认的肽种类的级分，干燥并重悬浮以在SDS-PAGE凝胶 上电泳以确认其对应于6kDa片段，并通过N端测序确定肽序列。测序分 析揭示具有序列REKKDRVFTD的肽，其对应于成熟的(野生型)人 IL-12p40亚单位起始于Arg261的序列。

实施例5：含有p40变体的IL-12蛋白的生物活性

通过从人PBMC诱导IFNγ测定含有p40变体的IL-12蛋白的生物活 性。将含有变体p40V1至p40V8的抗体融合蛋白Ab-IL-12与具有野生型 p40的Ab-IL-12和重组人IL-12蛋白相比较。

基本上如Gately等(1995)，Current Protocols in Immunology，6.16.4节， 和Kobayashi等(1989)，J.Exp Med.，170：827-845所描述的方法进行IFNγ 诱导分析。用PHA-P培养PBMC 3天，然后加入25IU/ml人IL-2(R&D Systems，Minneapolis MN)再培养24小时。洗涤细胞，将20IU/ml IL-2加 入至所有细胞，随后加入从20ng/ml(按照IL-12对分子贡献的相对质量) 开始的系列两倍稀释的IL-12融合蛋白。24小时后，用购自R&D Systems 的抗体对通过ELISA测定IFNγ的浓度。

用来自不同供体的PBMC的两次独立实验结果总结于表1。

表1：在IFNγ诱导测定法中Ab-IL12变体的生物活性

^*(n＝2)

与重组人IL-12相比较，具有野生型p40的Ab-IL12的活性减少约10 倍。发现所测试的抗体-IL12变体蛋白没有显著地进一步影响蛋白的活性。 与相应的野生型抗体-IL12融合蛋白相比较，Ab-IL12p40V1至 Ab-IL12p40V8具有稍微降低的活性(约少1.5-3倍)。

实施例6：含有p40变体的IL-12蛋白的药物代谢动力学

确定了含有p40变体的抗体融合蛋白的药物代谢动力学。应用本领域 技术人员熟知的标准方法进行实验。简单而言，用25μg Ab-IL12或含有 变体p40V1、p40V2、p40V3、p40V4、p40V5、p40V6、p40V7和p40V8 的Ab-IL12变体以0.2ml的体积尾部静脉静脉内或皮下注射BALB/c小鼠 (每一治疗组n＝3)。分别在直至24小时和直至96小时的不同时间点通过眼 球后放血取得小体积血液，并收集于肝素涂布的管中以防止凝结。在离心 移除细胞后，通过用抗人IgG H&L抗血清捕获并用抗人IL-12抗体检测而 分析血浆。将结果对在注射(t＝0)后30秒内取得的每只小鼠血浆中的初始 浓度进行标准化。图26是评估静脉内施用的蛋白的药物代谢动力学的代表 性实验汇编。发现与野生型对照蛋白相比较，含有变体p40V1和p40V2、 p40V3、p40V4以及p40V6的抗体-IL-12融合蛋白具有显著改善的药物代 谢动力学值。特别地，发现分布相(α相)的半寿期大约是两倍，以及相应地， 变体蛋白的AUC也大约是两倍。然而，所有Ab-IL-12融合蛋白的消除相 (β相)基本保持相似。这些结果与当皮下施与小鼠时蛋白的药物代谢动力学 一致。图27的A图显示野生型Ab-IL12与含有p40 V1、p40 V2、p40 V3 和p40 V4的Ab-IL12变体的比较，以及B图显示野生型Ab-IL12与含有 p40 V5、p40 V6、p40 V7和p40 V8的Ab-IL12变体的比较。

实施例7：用IL-12p40变体治疗人类患者

将本发明的IL-12p40变体如下用于预防和治疗人类疾病和病症。一般 而言，优选的施与方法是通过静脉内输注或静脉内注射，或通过皮下注射、 吸入，但是经口递送和其它方法也是可能的。

用含有IL-12p40变体的抗体-IL12融合蛋白如下治疗患有晚期转移性 前列腺癌并有通过常规化疗治疗历史的患者。每一治疗周期的抗体-IL12 融合蛋白的剂量大约是每千克体重150微克，并且可以是在单天或在连续 的两或三天递送，点滴输注施与。治疗可以与通过医师确定的适合患者的 前列腺癌的标准治疗相结合。非甾类的抗炎药物，例如Naproxen^TM，也可 以作为药物处方。治疗周期每三个星期大约重复一次。

通过点滴输注含有IL-12p40变体的抗体IL-12融合蛋白治疗患有激素 难治性乳腺癌的患者。非甾类的抗炎药物，例如Naproxen^TM，也可以作为 药物处方。

在替代的治疗方案中，每3个星期约一次地使用含有IL-12p40变体的 抗体-IL12融合蛋白，与含有IL-2的免疫细胞因子诸如KS-IL2联合治疗 晚期激素难治性前列腺癌或晚期激素难治性乳腺癌。这两种药剂可以通过 点滴输注共施与。在治疗前，对患者施用免疫刺激量的环磷酰胺。非甾类 的抗炎药物，例如Naproxen^TM，也可以作为药物处方。

用Fc-p40融合蛋白(其中p40亚单位是IL-12p40变体)约每2个星期 一次的以约8mg/kg的剂量通过点滴输注治疗患有类风湿性关节炎的患 者。发现通过单一疗法显著地抑制了关节破坏的进程，甚至当与根据疾病 调整的抗风湿病药物相比也是如此。