一种基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体及构建方法

摘要

本发明提供一种基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体及制备方法，由piggyBac转座子表达载体以及表达piggyBac转座酶的辅助质粒组成。piggyBac转座子表达载体由弓形虫启动子序列，如速殖子、缓殖子特异性表达蛋白SAG1、BAG1及GRA的调控元件、目的基因以及piggyBac反向重复序列构建；辅助质粒由SAG1、GRA的调控元件和piggyBac转座酶编码基因构建。本发明与现有技术相比，具有操作简便、转化效率高，为弓形虫药物靶标及疫苗候选抗原的研究鉴定提供了新途径。

说明书

技术领域

本发明旨在提供一种基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体，同时还公开了该载体的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的一种世界性分布的人兽共患寄生虫病。人类弓形虫感染率极高，在某些情况下可引起严重疾病，如孕妇感染弓形虫可影响胎儿的发育，严重者致畸甚至死亡，同时可使孕妇流产或早产；对于免疫抑制或免疫缺陷病人，弓形虫是一个主要的机会性致病因素。孕妇感染弓形虫后有30％～46％的机率从母亲传播给胎儿，引起胎儿先天性感染，造成流产、死胎或先天性弓形虫病；有6％～10％的艾滋病患者并发弓形虫病，而艾滋病病人所患脑炎有50％是由弓形虫感染引起的。据调查，孕产妇和肿瘤患者弓形虫抗体阳性率高达10％～60％。猫、犬、猪、羊、牛、兔等家畜感染弓形虫非常普遍，其感染率高达10％～50％，不仅造成家畜流产，影响畜牧业生产，而且成为人类弓形虫病的主要传染源。因此，弓形虫病已成为我国亟待解决的重要公共卫生问题之一。弓形虫病迄今仍然没有理想的防治药物，由于弓形虫感染后可引起宿主保护性免疫应答，因此研制安全、有效的疫苗应是弓形虫病较好的防治对策。

近年来弓形虫基因组测序已经完成，并鉴定了部分弓形虫毒力相关基因及一些抗原基因，为弓形虫的药物研制及疫苗研究提供了一些候选靶标，但是仍有大量功能基因需要鉴定，如弓形虫发育调节基因、其它重要毒力基因等。

鉴定弓形虫的功能基因，首先需要构建其突变体，目前可以使用的方法包括化学诱变、基因打靶、RNA干扰(RNAi)等技术，这些方法各有优缺点。运用化学诱变方法构建弓形虫Tbd-突变体，表现为缓殖子形成能力减弱，但不能确定其分子机理；通过基因打靶技术鉴定了弓形虫的部分毒力、代谢相关基因，但是这种方法一次只能构建一个突变体，并且效率不高，工作量很大。RNAi技术在操作上也很复杂，首先需要根据靶基因序列设计大量siRNA分子，然后逐一验证其基因沉默效果，并且在效果上也很难达完全的基因沉默。

piggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的DNA转座子，全长2.476kbp，含有1个RNA聚合酶II启动子区和1个多聚腺苷酸信号，该信号的侧面是1个约2.1kb开放读码框，编码1个68kDa的转座酶。piggyBac转座子的末端是长13bp的反向重复序列，两端不对称地分布着19bp的内部反向重复序列。piggyBac转座子反向重复序列的5′末端含有2-3个C碱基，3′末端的G碱基在切出位点的选择过程中起作用。该转座子转座频率高，且总是在TTAA位点插入，被归入TTAA可转移因子家族。作为一种基因诱变工具，piggyBac转座子具有较高的转座效率，可快速、高效地产生大量稳定传代的带有单个piggyBac转座子的突变体，从而避免了传统的基因打靶等诱变方法，大大节约了成本；负载容量大，可同时携带含有多个基因的大片段DNA；转基因可长期稳定地表达；并且以单拷贝形式整合，更易模拟内源基因的表达状况；利用反向PCR可方便地确定piggyBac插入基因组的位置，从而确定基因功能；piggyBac能广泛插入基因组中，尤其偏好基因编码区，有效破坏内源基因功能，与传统基因打靶诱变产生类似的表型；利用piggyBac的精确切离可实现对突变表型的恢复，从而进一步确定表型和基因的对应关系。更为重要的是，piggyBac转座系统的种属特异性差，除了昆虫外，在哺乳动物细胞、曼氏血吸虫及疟原虫均表现出较高的转座活性，这为其广泛应用提供了依据。

发明内容

本发明旨在提供一种基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体，用于弓形虫药物靶标及疫苗候选抗原的研究鉴定。

本发明还公开了上述载体的制备方法，具有构建简单、转化效率高的特点。

本发明提供的基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体，其特征在于：包含piggyBac转座子表达载体及表达piggyBac转座酶的辅助质粒。

所述的弓形虫基因转移载体，其特征在于：弓形虫基因转移载体的piggyBac转座子表达载体为piggyBac转座子的反向重复序列，弓形虫特异性表达蛋白的调控元件。

所述的弓形虫基因转移载体，其特征在于：辅助质粒为弓形虫特异性表达蛋白调控元件指导下表达piggyBac转座酶。

所述的弓形虫基因转移载体，其特征在于：piggyBac转座子的反向重复序列及转座酶选自昆虫粉纹夜蛾。

所述的弓形虫基因转移载体，其特征在于构建弓形虫基因转移载体的弓形虫特异性表达蛋白调控元件为弓形虫速殖子特异性表达蛋白SAG的5′端非编码区和3′端非编码区、缓殖子特异性表达蛋白SAG的5′端非编码区和3′端非编码区、弓形虫致密颗粒蛋白的5′端非编码区和3′端非编码区以及弓形虫其它蛋白的5′端非编码区和3′端非编码区。

本发明的基于piggyBac转座子的弓形虫基因转移载体的制备方法，具体包括以下步骤：

1)piggyBac转座子表达载体的构建：运用PCR技术分别克隆弓形虫多聚腺苷酸信号序列和速殖子或缓殖子特异性表达蛋白SAG1或BAG1或GRA的启动子序列；构建弓形虫目的基因表达盒；通过基因克隆技术将上述构建的目的基因表达盒克隆入piggyBac反向重复序列之间，构建弓形虫piggyBac转座子表达载体；

2)辅助质粒的构建：将piggyBac转座酶编码基因克隆入弓形虫SAG1或GRA启动子序列下游，构建能表达转座酶的辅助质粒。

为了实现将目的基因表达盒稳定的整合到弓形虫基因组中，本发明采用piggyBac转座子构建弓形虫基因转化系统。研究表明piggyBac转座子能在多鳞翅目、双翅目昆虫及多哺乳动物细胞中发生转座，其转座机理在于：piggyBac转座子的两末端各有一个重复序列，两个重复序列的方向相反，称作反向末端重复序列，其间包括两个阅读框，其中一个编码转座酶，发生转座时，转座酶通过识别反向末端重复序列，促进两反向末端重复序列之间的DNA片段的转座。本发明利用DNA重组技术，将完整的目的基因编码框表达盒克隆入piggyBac转座子的反向末端重复序列之间，从而将piggyBac转座子改造为基因转移载体，将基因转移载体能够稳定地将报告基因整合到弓形虫基因组中。

转座子发生转座除需反向末端重复序列之外，还需要转座酶的参与。转座酶识别反向末端重复序列，并实现两个反向末端重复序列及其内部的DNA片段发生转座，为实现转座的基因稳定整合到弓形虫基因组中，本发明将转座酶基因克隆入另一载体中，并在其上游加上弓形虫速殖子特异性SAG1基因启动子，从而构建成能瞬时表达转座酶基因的辅助质粒，保证了转座反应的顺利进行。

这种由piggyBac转座子改造的双质粒转基因系统将需转座的目的基因与转座酶分离，不但可以实现目的基因在弓形虫基因组中的高频率整合，而且保证了转基因弓形虫中整合基因的遗传稳定性。

本发明的积极效果在于：获得的由表达载体质粒和辅助质粒二者共同构成的弓形虫基因转移系统，确保外源目的基因在弓形虫基因组中的高效整合。本发明与现有技术相比，具有操作简便、转化效率高，为弓形虫药物靶标及疫苗候选抗原的研究鉴定提供了新途径。

附图说明

图1弓形虫piggyBac转转座子表达载体的构建策略

图2弓形虫piggyBac转座子系统辅助质的构建策略

图3弓形虫piggyBac转座子缓殖子表达载体的构建策略

图4弓形虫piggyBac转座子速殖子-缓殖子表达载体的构建策略

图5弓形虫piggyBac转座子电穿孔转染结果

A.弓形虫piggyBac转座子表达载体及辅助质粒(表达转座酶)共转染弓形虫滋养体荧光显微镜检测；B.弓形虫piggyBac转座子表达载体(PB-)弓形虫滋养体荧光显微镜检测；C.弓形虫piggyBac转座子电穿孔转染效率[PB+：piggyBac转座子表达载体及辅助质粒(表达转座酶)共转染；PB-：弓形虫piggyBac转座子表达载体转染]。

具体实施方式

下面通过实施例和具体的操作步骤旨在进一步举例说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1

弓形虫速殖子基因转移载体的构建及应用

按照附图1、2所示的技术路线制备弓形虫速殖子转移载体，具体步骤如下：

1.弓形虫SAG1启动子序列及多聚腺苷酸信号序列的克隆及序列分析

将弓形虫RH株腹腔接种昆明小鼠，3-4天后抽取腹水，离心收集虫体，并按常规方法提取弓形虫基因组，以SAG1-F和SAG1-R为引物，运用PCR方法扩增弓形虫SAG1基因的5′端非编码区SAG1-5；以GRA2-F和GRA2-R为引物，运用PCR方法扩增弓形虫GRA2基因的3′端非编码区GRA2-3，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定后，将得到的基因克隆至pMD-18T载体，构建重组质粒pMD/SAG1-5和pMD/GRA2-3，采用双脱氧末端终止法测其序列。

SAG1-F：5′-GGAATTCGCGTGTTCTAACCACAAACCTTG-3′；

SAG1-R：5′-GGTCTAGAGTGGTTCTCCGTCGGTGTGAG-3′；

GRA2-F：5′-GTCTAGAAAACTCGAGAATAATGTTGACTACGACGAAAGTGA-3′；

GRA2-R：5′-GGAAGCTTGTCGACTGGAACTACGGTGTTTG-3′。

2.弓形虫表达盒SAG1/RFP的构建

报告基因RFP的扩增以RFP-F和RFP-R为引物，

RFP-F：5′-GGCTCTAGAATGGCCTCCTCCGAGGACG-3′；

RFP-R：5′-GCTCGAGTTAGGCGCCGGTGGAGTGG-3′

以质粒PB[Act-RFP]DS为模板，扩增片段克隆入T载体，用XbaI/XhoI双酶切获得RFP基因的完整编码区RFP；将上述构建的质粒pMD/SAG1-5和pMD/GRA2-3分别EcoRI/XbaI和XhoI/HindIII双酶切释放目的片段SAG1-5和GRA2-3。按常规方法将这三个片段连接，获得弓形虫表达盒SAG1/RFP。

3.弓形虫piggyBac转座系统表达载体的构建

将上述构建的弓形虫表达盒SAG1/RFP运用EcoRI/XhoI/双酶切，回收表达盒并将其克隆入质粒PB[Act-RFP]DS的HindIII/BamHI位点，即可获得弓形虫piggyBac转座系统表达载体。

4.弓形虫piggyBac转座系统辅助质粒的构建

如图2所示，将质粒CMV-PBase中的转座酶编码区运用HindIII/EcoRI双酶切释放，回收Pbase编码区，并将其克隆入弓形虫表达盒SAG1/RFP中的XbaI/XhoI位点，即获得表达转座酶的辅助质粒SAG1-PBase。

5.弓形虫的转染

通过电穿孔方法将构建的弓形虫piggyBac转座子表达载体及辅助质粒共转染弓形虫RH株滋养体；

6.转座特性的鉴定

运用荧光显微镜及反向PCR技术鉴定piggyBac转座子在弓形虫体内的转座特性(转座效率、插入位点特征)(图5)；

7.通过有限稀释方法将上述弓形虫突变体经96孔培养板培养，建立弓形虫突变体克隆，并进行生物学及免疫学特性的鉴定。

实施例2

弓形虫缓殖子基因转移载体的构建及应用

按照附图3所示的路线制备弓形虫缓殖子转移载体，具体步骤如下：

1.弓形虫BAG1启动子序列的克隆

将弓形虫RH株腹腔接种昆明小鼠，3-4天后抽取腹水，离心收集虫体，并按常规方法提取弓形虫基因组，以SAG1-F和SAG1-R为引物，运用PCR方法扩增弓形虫SAG1基因的5′端非编码区SAG1-5；以GRA2-F和GRA2-R为引物，运用PCR方法扩增弓形虫GRA2基因的3′端非编码区GRA2-3，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定后，将得到的基因克隆至pMD-18T载体，构建重组质粒pMD/BAG1-5和pMD/GRA2-3，采用双脱氧末端终止法测其序列。

BAG1-F：5′-GGATCCTGATCAGTGCACTCTACGAGATGC-3′；

BAG1-R：5′-GGGGGTCTAGACTTTTTTGAATATCATACGGG-3′；

GRA2-F：5′-GTCTAGAAAACTCGAGAATAATGTTGACTACGACGAAAGTGA-3′；

GRA2-R：5′-GGAAGCTTGTCGACTGGAACTACGGTGTTTG-3′。

2.弓形虫表达盒BAG1/RFP的构建

报告基因RFP的扩增以RFP-F和RFP-R为引物

RFP-F：5′-GGCTCTAGAATGGCCTCCTCCGAGGACG-3′；

RFP-R：5′-GCTCGAGTTAGGCGCCGGTGGAGTGG-3′。

以质粒PB[Act-RFP]DS为模板，扩增片段克隆入T载体，用XbaI/XhoI双酶切获得RFP基因的完整编码区RFP；将上述构建的质粒pMD/BAG1-5和pMD/GRA2-3分别EcoRI/XbaI和XhoI/HindIII双酶切释放目的片段BAG1-5和GRA2-3。按常规方法将这三个片段连接，获得弓形虫表达盒BAG1/RFP。

3.弓形虫piggyBac转座系统表达载体的构建

将上述构建的弓形虫表达盒BAG1/RFP运用EcoRI/XhoI/双酶切，回收表达盒并将其克隆入质粒PB[Act-RFP]DS的HindIII/BamHI位点，即可获得弓形虫piggyBac转座系统表达载体。

4.弓形虫piggyBac转座系统辅助质粒的构建

如图2所示，将质粒CMV-PBase中的转座酶编码区运用HindIII/EcoRI双酶切释放，回收PBase编码区，并将其克隆入弓形虫表达盒SAG1/RFP中的XbaI/XhoI位点，即获得表达转座酶的辅助质粒SAG1-PBase。

5.弓形虫的转染

通过电穿孔方法将上述构建的弓形虫piggyBac转座子表达载体及辅助质粒共转染弓形虫RH株滋养体。

6.转座特性的鉴定

运用荧光显微镜及反向PCR技术鉴定piggyBac转座子在弓形虫体内的转座特性(转座效率、插入位点特征)。

7.通过有限稀释方法将上述弓形虫突变体经96孔培养板培养，建立弓形虫突变体克隆，并进行生物学及免疫学特性的鉴定。

实施例3

弓形虫速殖子-缓殖子基因转移载体的构建及应用

按照附图4所示的路线制备弓形虫速殖子-缓殖子转移载体的表达载体，具体步骤如下：

1.弓形虫GRA2基因启动子序列的克隆

将弓形虫RH株腹腔接种昆明小鼠，3-4天后抽取腹水，离心收集虫体，并按常规方法提取弓形虫基因组，以GRA2P-F和GRA2P-R为引物，运用PCR方法扩增弓形虫GRA2基因的5′端非编码区GRA2-5；以GRA2-F和GRA2-R为引物，运用PCR方法扩增弓形虫GRA2基因的3′端非编码区GRA2-3，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定后，将得到的基因克隆至pMD-18T载体，构建重组质粒pMD/GRA2-5和pMD/GRA2-3，采用双脱氧末端终止法测其序列。

GRA2P-F：5′-GGAATTCAAACAAGTTCGTCGCAAAAGG-3′

GRA2P-R：5′-CGTCTAGATGTGAGGCGATATGTGGAGAAG-3′

GRA2-F：5′-GTCTAGAAAACTCGAGAATAATGTTGACTACGACGAAAGTGA-3′；

GRA2-R：5′-GGAAGCTTGTCGACTGGAACTACGGTGTTTG-3′。

2.弓形虫表达盒GRA2/RFP的构建

报告基因RFP的扩增以RFP-F和RFP-R为引物

RFP-F：5′-GGCTCTAGAATGGCCTCCTCCGAGGACG-3′；

RFP-R：5′-GCTCGAGTTAGGCGCCGGTGGAGTGG-3′。

以质粒PB[Act-RFP]DS为模板，扩增片段克隆入T载体，用XbaI/XhoI双酶切获得RFP基因的完整编码区RFP；将上述构建的质粒pMD/GRA2-5和pMD/GRA2-3分别EcoRI/XbaI和XhoI/HindIII双酶切释放目的片段GRA2-5和GRA2-3。按常规方法将这三个片段连接，获得弓形虫表达盒GRA2/RFP。

3.弓形虫piggyBac转座系统表达载体的构建

将上述构建的弓形虫表达盒GRA2/RFP运用EcoRI/XhoI/双酶切，回收表达盒并将其克隆入质粒PB[Act-RFP]DS的HindIII/BamHI位点，即可获得弓形虫piggyBac转座系统表达载体。

4.弓形虫piggyBac转座系统辅助质粒的构建

如图2所示，将质粒CMV-PBase中的转座酶编码区运用HindIII/EcoRI双酶切释放，回收PBase编码区，并将其克隆入弓形虫表达盒SAG1/RFP中的XbaI/XhoI位点，即获得表达转座酶的辅助质粒SAG1-PBase。

5.弓形虫的转染

通过电穿孔方法将上述构建的弓形虫piggyBac转座子表达载体及辅助质粒共转染弓形虫RH株滋养体。

6.转座特性的鉴定

运用荧光显微镜及反向PCR技术鉴定piggyBac转座子在弓形虫体内的转座特性(转座效率、插入位点特征)。

7.通过有限稀释方法将上述弓形虫突变体经96孔培养板培养，建立弓形虫突变体克隆，并进行生物学及免疫学特性的鉴定。