家蚕（Bombyx mori）piggyBac转座子转基因载体的构建及转基因方法的研究

摘要

家蚕(Bombyxmori)是一类重要的经济昆虫，目前作为生物反应器表达了多种外源蛋白，特别是其丝腺能够产生大量的丝蛋白，而成为研究的热点。但还存在许多不足，如外源基因的有效导入、整合、表达及转基因个体遗传稳定性等问题，仍需进一步深入研究。首先，本研究构建了基于转座子piggyBac的表达载体和辅助质粒。将家蚕细胞质肌动蛋白基因BmA3(cytoplasmicactinBmA3)启动子(不含信号肽序列)与转座子piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒(pARTR1.2)；将Bm43启动子(含信号肽序列和部分编码区)与绿色荧光蛋白基因(gfp)融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向末端序列间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体(pZAGFP)，在此载体中设计了一个多克隆位点区，便于外源基因的插入。其次，从家蚕(Bombyxmori)品种菁松×皓月后部丝腺中提取总RNA，用RT-PCR扩增技术克隆到家蚕丝心蛋白轻链cDNA，序列分析表明，该片段全长为798个碱基。比较4种不同品种来源的家蚕丝心蛋白轻链基因外显子区域序列，同源性在98.0％-99.4％之间，推测的氨基酸同源性在98.0％-99.6％之间，四个品种间发生的变异比较一致地集中在不同位置的8个碱基上。提取家蚕品种菁松×皓月后部丝腺总DNA，利用PCR扩增技术获得家蚕丝心蛋白轻链基因调控片段和终止子片段，长度分别约为1.2kb和0.45kb，分别与J-139L链基因相应区域进行比对，同源性高达98.8％和99％。结果表明，启动子片段包含一些典型的调控元件和多个可能参与丝蛋白基因特异性表达调控的元件，终止子片段包含有停止转录的信号序列，这为构建家蚕丝腺特异性表达载体奠定基础。最后，利用本研究构建的家蚕转基因载体进行了家蚕转基因的研究。分别用显微注射法、精子介导法、脂质体法和压力渗透法将转基因载体(pZAGFP)和辅助质粒(pARTR1.2)导入家蚕的受精卵中，用PCR方法对后代的检测中，发现后代个体染色体中含有gfp基因，表明gfp基因已整合到家蚕基因组中且能稳定遗传，这为进一步研究将外源基因导入家蚕，进行遗传改良和高效表达奠定了基础。

目录

文摘

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文献综述

第一章家蚕(Bombyx mori)胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建

第二章家蚕(Bombyx mori)丝心蛋白轻链c D N A、基因调控片段和终止子的克隆及序列分析

第三章家蚕(Bombyx mori)转基因方法的初步研究

附图

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致谢